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农药学论文:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法

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农药学论文:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法 收稿日期:2009 - 02 - 23 录用日期:2009 - 03 - 17 基金项目:浙江省自然科学基金 (No. Y307448);浙江省教育厅科研项目 (No . 20070138) 作者简介:李少南 (1963—),副教授;* 通讯作者 (Corresponding author),E-mail : snli@zju.edu.cn 农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法 李少南 * 浙江大学农药与环境毒理研究所,杭州 310029 摘要:微生物群落在保持土壤肥力和对外界适应能力方面起着十分重要的作用 . 随...
农药学论文:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法
收稿日期:2009 - 02 - 23 录用日期:2009 - 03 - 17 基金项目:浙江省自然科学基金 (No. Y307448);浙江省教育厅科研项目 (No . 20070138) 作者简介:李少南 (1963—),副教授;* 通讯作者 (Corresponding author),E-mail : snli@zju.edu.cn 农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法 李少南 * 浙江大学农药与环境毒理研究所,杭州 310029 摘要:微生物群落在保持土壤肥力和对外界适应能力方面起着十分重要的作用 . 随着农药的广泛应用和农药评估体 系的建立与完善,人们越来越关注农药对土壤微生物群落的负面影响,并且尝试用多种方法进行研究 . 虽然对其中任 何一种方法的使用,均有助于提高人们对农药副作用的认识,但是使用少数几种方法所获得的信息,已能够满足风险 评估的最低要求 . 论文以农药风险评估的“资料要求”为依据,对“资料要求”中涉及的“碳转化”和“氮转化”两种室内 试验的特点和思路进行了分析 . 此外还简要介绍了国内外农药管理部门在土壤微生物风险评估中常用的几种模 型,并探讨了这些模型与具体试验方法之间的关联 . 从文中可以看出,对于农药的土壤微生物影响,现已建立起了比 较化的室内测定方法,目前缺乏的是与风险评估模型相配套的田间试验方法或准则 . 关键词:农药;土壤微生物群落;副作用;方法学 文章编号:1673 - 5897(2010)1 - 018 - 07 中图分类号:X171.5,S48 文献标识码:A Methods for Detecting Side -Effect of Pesticides to Soil Microbial Communities LI Shao-nan* Institute of Pesticide and Environmental Toxicology , Zhejiang University , Hangzhou 310029 Received 23 February 2009 accepted 17 March 2009 Abstract:Soil microflora plays important role in maintaining soil fertility and its capacity against outside strikes. Along with extensive application of pesticides and with establishment and improvement of pesticide evaluating frameworks, side - effects of pesticides on soil microflora have been attracting more and more concern. Various methods have been developed to investigate the possible effects of pesticides on soil microflora. Each of the methods has its own specific contribution towards an all -sided recognition of the effects, only a few of them, however, are believed to be able to provide adequate data for risk assessment. Based on“data requirement”put fore by administrative departments both at home and from abroad, the present paper summarized characters and thoughtfulness for designation of two of the laboratory tests included in“data requirement”, i .e . , incubation systems, methods for detection, and so on. In addition to that, some evaluating schemes, which were accepted nowadays by state and international administrative departments, were briefly introduced, and relations of these schemes with their related test methods were discussed. One can see from this paper that scientific methods for laboratory studies on impact of pesticides on soil microflora have already been established. What are in urging need are methods or guidelines for field investigation of the impacts to cooperate with risk assessments. Keywords:pesticides;soil microflora;side-effects;methodology 2010 年 第 5 卷 第 1 期,18-24 生 态 毒 理 学 报 Asian Journal of Ecotoxicology Vol. 5, 2010 No. 1, 18-24 李少南:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法第 1 期 1 引言 微生物群落对于土壤肥力的保持起着十分重 要的作用 . 这种肥力多是通过对植物材料的分解 和从空气中固氮并与植物共生等微生物活动来实 现的 . 近来人们还认识到微生物群落在土壤适应 性进化中的贡献 . 这种贡献体现在对土壤微生物 基因库的维持,使土壤中能够很快产生新的基因 组,以应对土壤使用方式的多样性变化(Soulas and Lors , 1999). 考虑到农药中的许多品种直接 在土壤中使用,即使用于叶面处理的药剂,使用后 亦有 70%~80%落在了土壤表面,人们关注它们对 土壤微生物群落的影响就不难理解了 . 农药管理 部门规定,用于农艺、园艺、林业等的植物保护剂 (即农药),生产商必须提供有关产品对土壤微生 物群落影响的资料 . 这些资料必须足以阐明其产 品在推荐剂量和方法下使用后对土壤微生物群落 是否有不利影响;如果有,影响所持续的时间究竟 有多长 . 2 资料要求 化学品对土壤微生物群落的影响是多方面的, 人 们 可 以 从 不 同 角 度 进 行 研 究 . Locke 和 Zablotowicz(2004)将研究终点归纳为 3 类,即生物 量(Biomass)、土壤酶活性(Soil enzyme activity)和 氮素可矿化性(Mineralizable N). 美国 California 州 环保署在最近起草的一份文献中将研究终点归纳 为 4 类,即生物量(Biomass)、种群(Population)、活 性(Activity)和多样性(Diversity). 每一类当中又包 含若干种不同的终点(OEHHA , 2008). 对于这些 终点的研究,有助于人们从不同侧面了解农药对 土壤微生物负面影响 . 从实践角度,只有那些与风 险管理目标相对吻合的研究终点,才可能被纳入 风险评估的“资料要求”. 评估农药对土壤微生物的风险,其“资料要求” 主要涉及微生物群落的“碳转化(Carbon turnover)” 和“氮转化(Nitrogen turnover)”功能在暴露期间所 受的影响 (FAO , 1981;1989;EPPO , 2003). 所谓 “碳转化”是指土壤微生物转化有机碳成为二氧化 碳的能力 . 而所谓“氮转化”是指土壤微生物通过 氨化和硝化反应转化含氮有机物成为硝酸根的过 程 .“氮转化”与“碳转化”是关系密切的生命过程 . 对“氮转化”的检测,往往可以折射出待测物对土 壤“碳转化”能力的影响 . 因为氨化和硝化过程是 紧随有机物“碳—氮”键的断裂而发生的 . 如果硝 酸根的形成速率在处理和对照土之间没有差异, 则可以有把握地推断,土壤的“碳转化”功能没有 受到显著影响(OECD , 2000a). 研究农药对土壤微生物的影响,既可以在室 内,也可以在温室或田间进行 . 所谓室内试验, 就是农药的添加、土壤微生物的暴露、功能检测 等环节均在室内条件下进行 . 温室或田间试验与 室内试验的主要区别在于前两者是将供试药剂 施用于田间,并在施药后的不同时间选点取样,然 后在室内完成功能检测 . 农药风险评估试验一般 从室内开始 . 对许多农药来说,室内试验已经能够 满足风险评估的需要 . 当室内试验证明农药对土 壤微生物群落存在风险,或者风险性难以通过室 内试验加以判断时,需要进一步开展温室或田间 试验 . 目前国内外尚未制订出与风险评估模型相配 套的土壤微生物田间试验方法 . 农药管理机构正 在讨论和酝酿制订相关的试验准则(EPPO , 2003). 本文以室内试验为例,对土壤微生物试验的方法 学要素加以剖析 . 3 试验要素 3.1 土样 土壤中包含多种微生物 . 它们在土壤中的关 系复杂,具有一定的抗外界干扰能力 . 外来化学品 对土壤微生物群落某一部分造成损害,因此而丧 失的功能,有可能被群落的另一部分所补偿 . 现今 人们普遍认同,研究农药对土壤微生物的影响,其 着眼点应该放在群落的整体功能上 . 以土壤中分 离的菌株作为研究对象时,虽然也能提供不少有 关农药和土壤微生物相互作用的信息,但此类信 息并不能反映群落整体在土壤中的实际情况 . 因 此人们在研究农药对土壤微生物影响时,大多以 具有微生物活性的土壤,而不是纯培养的微生物 菌株作为研究单位 . 3.1.1 物理性能 土壤的一些物化特征,如粘粒含量、阳离子代 换量、pH 值、有机质含量等,会不同程度地影响农 药在土壤中的吸附与挥发,进而影响农药对土壤 微生物的生物有效性(Bioavailability). 因此在大多 19 生 态 毒 理 学 报 第 5 卷 数情况下,土壤微生物试验需要以一种以上的不 同性质的土样(如砂土和壤土)作为试验材料 . 美国 EPA(1996)要求供试土样达到以下标准: pH 4~8、有机质含量 1%~8%、阳离子代换量大于 70meq·kg-1、砂粒(作者注———粒径介于 2~0.02mm 之间)含量不超过 70%. OECD(2000a ; 2000b)给出了其对供试土样的 要求:砂粒含量介于 50%~75%之间;pH 值介于 5.5~7.5 之间;有机碳含量介于 0.5%~1.5%之间; 土样的微生物碳含量不低于该土样有机碳总含量 的 1%. 上述指标范围被 OECD 称作是对土样的“最差 状况(Worst cast situation)”. 所谓“最差状况”,意 味着此类土样为农药提供了相对高的生物有效性 . 如果以该土样作为测试,测得的农药影响不 明显,就无需用其他土样再进行测试(OECD , 2000a ; 2000b). 3.1.2 土样采集 OECD 认为取土深度应该控制在土表以下 0~ 20cm. 如果在温室或非耕地取土,深度可延伸到土 表以下 25cm . 土样最好取自谷类作物(玉米除外) 或密植的绿肥田 . 选中的田块应该停用农药至少 1 年,并且应该至少 6 个月未使用化肥或至少 3 个 月未使用有机肥(OECD , 2000a ; 2000b). 3.1.3 筛分和贮存 手工剔除土样中的蚯蚓、节肢动物、石子、植物 根系等大块杂质(如果有的话). 然后将土样晾置 到可以过筛为止(对一般农田土样而言,此时的含 水量大约为 12%). 使土样过 2mm 筛 . 调节土样含 水量至其饱和持水量的 40%~60%. 按上述步骤处 理过的土样,可在温度(4±2)℃、通风、避光的条件 下贮存 . 但 OECD 认为即使在上述条件下,土样的 贮存期最长也不宜超过 3 个月,过长时间的贮存 会使土壤微生物活性明显下降,或使微生物区系 的原始状况发生改变(OECD , 2000a ; 2000b). 3.1.4 恢复培养 经过较长时期贮存的土样一般不能直接用于 试验,而是应该经过适当的恢复性培养,以恢复贮 存过程中丧失的土壤微生物活性 . 恢复培养是否 达到预期的效果,应该经过适当程序加以验证 . OECD 对恢复培养合格土样的生物量指标提出了 以下要求,即土样中微生物碳含量不低于该土壤 有机碳总含量的 1%(OECD , 2000a;2000b). 3.2 底物 底物的作用首先在于提高土样中微生物的生 物量,使之达到试验准则所要求的水平 . 根据实际 需要,底物既可在加药前的恢复培养期,也可在加 药后的培育过程中添加 . 至于底物的种类,OECD 主张使用鲜苜蓿粉,由紫花苜蓿 Medicago sativa 制 成,其 C/N 介于 12/1~16/1 之间,一般按照每 kg 干 土 5g 的比率添加(OECD , 2000a). 美国 EPA 推荐 的底物是经过 0.6mm 筛分选的苜蓿干粉 . 该底物 添加率多为 6%(w/w)(EPA , 1996). 除了用于提高微生物的生物量,底物还具有启 动和刺激微生物功能发挥的作用 . 如 OECD 的“碳 转化”试验要求在每次测试中向每 kg 干重的土样 中添加高剂量(2000~4000mg)葡萄糖以刺激微生 物的碳转化活性(OECD , 2000b). 3.3 培育系统 3.3.1 培育容器 按照美国 EPA(1996)的测试准则,培育容器 应该能够容纳 50g 土样,并且具有足够的换气空 间(100mL 左右的玻璃广口瓶能满足这方面要 求). 如果土样的用量增加,容器的体积应该相应 扩大 . 为了减少容器内的水分散失,瓶口可用聚 乙烯薄膜等覆盖,但是这种覆盖不应该过分阻隔 空气流通;也可以将瓶口完全敞开,每隔一定时间 (如 7d)补充一次水份,以恢复土壤含水量到起始 水平 . 3.3.2 加药方式 水溶性原药和可以在水中分散的农药制剂,如 乳油、可湿性粉剂、水乳剂、悬浮剂等,可以直接用 水稀释,然后使稀释液与土样混匀 . 如果药剂难溶于水,又难以直接与土样混合, 可先用少量有挥发性机溶剂(如丙酮、氯仿)将其 溶解,再将药液涂布在少量细土或石英细砂(粒径 0.1~0.5mm)表面,待溶剂挥发后,将吸附有药剂 的细土或石英细砂进一步分散到土样中去 . 注意 不可将溶解于有机溶剂的药液直接与土样混合 . 因为这样做有可能会破坏土样中微生物区系的完 20 李少南:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法第 1 期 整性 . 有些内含石砾核心的颗粒剂,由于体积较大而 难以与土样均匀混合 . 遇到这种情形,可先用水或 有机溶剂将外包物洗脱,再做下一步处理 . 3.3.3 剂量设置 如果农药在环境中的起始浓度可以推测,应优 先以起始环境浓度为依据进行测试;反之,当环境 浓度无法推测时,人们可以主观地选择一系列浓 度进行测试,直至获得 EC50 数值 (EPA , 1996; OECD , 2000a ; 2000b). 起始环境浓度的推测,一般以施药剂量为依 据 . 如此推测时,OECD 认为可以设定施用的药剂 100%进入土壤,并且均匀分布于地表 0~5cm 的土 层,土壤密度为 1.5g·cm -3(OECD , 2000a ; 2000b). OECD 认为农药的测试剂量至少应该包括“推 测环境浓度(Predicted Environmental Concentration, PEC)”以及 PEC 的 5 倍浓度 . 对于那些多次使用 的药剂,可以考虑以 PEC 乘以使用次数的模式确 定最高测试浓度 . 然而最高测试剂量不必超过单 次用药 PEC 的 10 倍(OECD , 2000a ; 2000b); 美国 EPA 的测试准则规定,农药试验可选择 PEC 的 0.1 倍、1.0 倍和 10 倍作为测试剂量 . 若采 用主观设定的系列浓度法进行测定,最高测试浓 度一般不超过 1000mg·kg -1(干土). EPA 认为在 1000mg·kg -1(干土)的测试浓度下,如果供试药剂 对土壤微生物活性的抑制率低于 50%,试验即可 终止(EPA , 1996); 蔡道基等(1986)根据我国当时的农药平均使 用量,提出采用 1、10、100mg·kg-1 3 个浓度进行测 试 . 考虑到不同农药田间用量的差别,国家环保局 在稍后制定的《化学农药环境安全评价试验准则》 中对此项内容做了修改,主张以农药常用量(即推 荐的最大用量)、常用量的 10 倍量、常用量的 100 倍量时表层土壤中农药的推测含量作为测试剂量 (蔡道基,1989). 微生物试验的每一浓度组(包括对照)应该设 置重复 . 美国 EPA 要求每一浓度组设 5 个重复 (EPA , 1996). OECD 认为每一浓度组至少需设 3 个重复(OECD , 2000a;2000b). 3.3.4 培育条件 温度方面,OECD 准则规定药剂处理过的土样 应该在 20℃下培育,培育期间的温度变幅不应超 过 ±2℃(OECD , 2000a;2000b). 美国 EPA 推荐的 培育温度为 22℃(EPA , 1996). 也可以将试验当地 土壤微生物最为适应的生长温度作为活性土壤的 培育温度(EPA , 1996;OECD , 2000a;2000b). 我国 的化学农药环境安全评价试验准则将 25℃作为活 性土壤的培育温度(蔡道基,1989). 湿度方面,以旱地微生物区系作为研究对象 时,土壤的培育湿度一般控制在饱和持水量的 40%~60%(OECD , 2000a ; 2000b)或者 10kPa(EPA , 1996). 如果试验对象涉及藻类,培育湿度可以提 高到土壤的饱和持水量 .“氮转化”试验中可采用 的土样培育方法有两种:即“散装培育”或“分装培 育”. 一个处理的“散装培育”土样包含多个分样, 在整个培育过程中,各分样可以被分批采集;而一 个处理的“分装培育”土样中只包含一个分样,该 分样只能在培育终结时采集 . 在加药操作上,“散 装培育”具有省工的优点,也有助于减少试验误差 . 但是如果供试药剂挥发性较强,“分装”则被认为 是唯一可供选择的培育方式 (OECD , 2000a ; 2000b). 培育过程中一般要避免光照 . 这样做一方面 为了避免农药见光分解,另一方面可以抑制土壤 中藻类的生长 . 3.3.5 取样规划 对于农药类化学品,OECD 规定土壤微生物试 验的持续时段至少应达到 28d . 土样(包括分样)的 采集应该在药剂处理后的第 0d、第 7d、第 14d 和第 28d 进行 . 在对第 28d 的样品进行检测后,如果发 现处理组和对照组土壤微生物活性的差异超过 25%,OECD 认为应适当延长试验周期,直至处理 组和对照组土壤微生物活性的差异低于 25%,但 延长的最大时限不应超过 100d (OECD , 2000a ; 2000b). 对于非农药类化学品,OECD 将试验持续的时 段设定为 28d,在第 7d 和第 28d 取土样或采集分 样,利用第 28d 的数据计算 ECx 值(OECD , 2000a ; 2000b). 将美国 EPA 试验持续的时段设定为 28d,土样 或分样的采集在第 5d 和第 28d 进行,利用第 28d 的数据计算 ECx 值(EPA , 1996). 我国的《化学农药环境安全评价试验准则》规 21 生 态 毒 理 学 报 第 5 卷 定 15d 作为农药对土壤微生物影响的一个试验周 期,取样在药剂处理后的第 0d、第 5d、第 10d 和第 15d 进行(蔡道基,1989). 3.3.6 系统质量要求 土壤微生物试验结果多是以处理组相对于对 照组功能的下降率(±25%)作为评判依据,若试验 组内各重复之间的测定值差异过大,将会影响对 试验结果的评判 . OECD 规定对照组内各重复间 的测定 值 差 异 不 应 超 过 ±15%(OECD , 2000a ; 2000b). 3.4 检测方法 3.4.1 “氮转化” 微生物的“氮转化”活性,通常以有机氮转化 为 NH4+的速率和 /或 NH4+转化为 NO3-的速率来表 示 . 而农药对“氮转化”活性的影响则通过处理组 相对于对照组 NH4+和 /或 NO3 -生成的下降率来表 示 . 为此需要将土样中的 NH4 +和 NO3 -加以提取 . OECD 和美国 EPA 分别给出了 NH4 +和 NO3 -的提 取方法: 按照 OECD 试验准则,将 5mL 0.1mol·L -1 的 KCl 加入相当于 1g 干重的土样,初步摇动后,将混 合液置于 150rpm 的摇床上振荡 60min,离心,取上 清液,测定其中 NH4+和 NO3-浓度 . 来不及测定的 上清液可在室温(20±5)℃下保存,OECD 认为贮 存期不宜超过 6 个月(OECD , 2000a). 按照美国 EPA 的试验准则,将 80mL 0.1mol· L -1 的 KCI 加入内含相当于 50g 干重土样的试验 容器中 . 初步摇动后,将容器至于摇床上继续振 荡 1h,提取液经低氮滤纸(如 Whatman 42 号定量 滤纸) 过滤后,用于 NO3 -或 NH4 +检测(EPA , 1996). NO3-和 NH4 +检测方法很多 . 具体可参见严昶 生(1988). 3.4.2 “碳转化” 微生物的“碳转化”活性通常以土壤在单位时 间内对氧气的吸收率或对二氧化碳释放率来表示 . 而农药土壤微生物“碳转化”活性的影响,可通过 处理组相对于对照组氧气的吸收或对二氧化碳释 放的下降率来衡量 . 对于二氧化碳释放,美国 EPA 推荐在气体流 通状态下测量 . 其原理是将内含土样并经过一段 时间密闭的培育容器,经由进、出气体的两个通 道,分别与气泵和红外气体检测器(Infrared gas analysis, IRGA) 相连 . 通道上分别安装有可控开 关 . 气泵提供的不含二氧化碳的湿润气流通过进 气通道进入培育容器,气流携带土壤呼吸作用释 放出的二氧化碳,经出气通道和干燥器而到达 IRGA . 在气体的流速确定的前提下,土样在容器 内的密闭培养时间需要通过预试验加以调节,使 出气通道内二氧化碳的分压与 IRGA 的检测灵敏 度相匹敌,同时又不会因为密闭培养而使容器内 氧气过多下降,以致影响土壤微生物的正常生长 . EPA 认为密闭培养的时间以 1 ~77h 为宜(EPA , 1996). 为了刺激土样的瞬时呼吸率,OECD 推荐在每 一测试之前按 2000~4000mg·kg -1(干土)的量向土 样中添加葡萄糖,经过 12h 左右密闭培养之后加以 测定(OECD , 2000b). 除了使用 IRGA,土壤呼出的二氧化碳还可以 用氢氧化钠吸收,再通过滴定或气相色谱法检测 . 我国国家环保局推荐了一种简易的土壤二氧化碳 吸收装置,目前被我国的农药登记试验单位普遍 采用(蔡道基,1989). 该装置以密闭的广口瓶作为 培养容器 . 植入土样的同时,每只广口瓶中放入一 只盛有 5mL NaOH 标准溶液的小烧杯,再将整个 广口瓶移至(25±1)℃的恒温箱中培养 . 至于取样 计划,起初是在试验开始后的第 0d、第 5d、第 10d 和第 15d 进行(蔡道基,1989),后来变更为试验后 的第 1d、第 2d、第 4d、第 7d、第 11d 和第 15d . 此处 所谓“取样”,是指从密闭广口瓶中取出培养开始 时(第 0d)放置的小烧杯,同时将一个新的小烧杯 放在原来位置以继续 CO2 的吸收 .“取样”的同时 也更换了广口瓶中的空气,不至于使瓶中氧气分 压下降到明显影响土壤呼吸作用的程度 . 碱液中吸收的 CO2 可以参考中科院南京土壤 研究所微生物室(1985)的方法进行测量 . 目前我国室内测量农药对土壤“碳转化”的影 响,其测量终点与 OECD 和美国 EPA 的稍有不同: 前者测的是土壤微生物在整个温育时段(如 0~1d、 0~2d、0~4d、0~7d、0~11d、0~15d) 的“碳转化”效 率,而后者测的是土壤微生物在温育的某一时间 点(如第 0d、第 7d、第 14d、第 28d)的“碳转化”效 率 . 除了作用强度,农药在土壤中发挥作用的时间 22 李少南:农药对土壤微生物群落的副作用的研究方法第 1 期 也是衡量其对微生物影响的一个重要因素 . 我国 以整个暴露时段内土壤二氧化碳的释放量作为测 量终点,从这一点上看,具有其合理的一面 . 但是 在温室和田间试验中,人们很难进行类似的测定, 而比较容易测量土壤微生物在试验阶段的某一时 间点的碳转化效率,因此 OECD 和美国 EPA 的测 量方法可用于不同层次间的试验,也易于试验结 果的相互比较 . 3.5 评价 Johnen 和 Drew 早在 1977 就年提出了一套以 功能的恢复时间作为关注水平(Level of concerns, LOCs)的风险评估体系 . 此体系中,对于室内试验 和野外试验而言,恢复时间<15d 和<30d,为无风 险;恢复时间 15~30d 和 30~60d,为略有风险但可 以忍受;>30d 和>60d,为有风险 . 比如某一农药对 土壤微生物的影响需要 20d 恢复,对于野外试验而 言,该农药属于“无风险”等级,对于室内试验,该 农药则属于“略有风险但可以忍受”. Johnen 和 Drew 评估体系,其室内试验的评价标准严于室外 . 之所以如此设置,目的在于防止室内试验出现“假 阴性”结果:如果室内试验证明农药对土壤微生物 “无风险”,风险也不可能在野外发生;反之,如果 室内试验显示农药对土壤微生物“有风险”,可以 进一步开展温室或田间试验,以确认类似的风险 是否会在野外发生 . Johnen 和 Drew 的这一评估体 系得到了联合国粮农组织(FAO) 的认可(FAO , 1981). 凡以环境浓度为依据的试验,其结果均可 应用该体系进行评估 . 在微生物风险的评估中,联邦农林生物研究中 心(Biologische Bundesanstalt für Land -und Forstwirtschaft, BBA)将对照组和处理组微生物活 性的差异作为关注目标 . 它为室内和野外试验设 定的 LOCs 分别是 15%和 25% . 按照这套评估体 系,在历时不超过 90d 的室内暴露之后,对照组和 处理组之间土壤微生物活性的差异如果低于 15%,供试药剂对微生物的影响被认为“可以接 受”;反之,如果差异超过 15%,则需要进一步开展 温室或田间试验 . BBA 规定的温室或田间试验历 时不超过 120d. 通过试验,对照组和处理组之间土 壤微生物活性的差异如果低于 25%,供试药剂的 影响被认为“可以接受”,如果差异超过 25%,供试 药剂则被认为对土壤微生物有不良影响 . 为了消 除或减轻这种不良影响,农药管理部门或许会对 该药剂的使用范围施加某种限制(Ehle , 1993). 欧 洲 和 地 中 海 植 保 组 织 (European and Mediterranean Plant Protection Organization, EPPO) 将农药的土壤微生物风险等级进行了如下划分并 给出了相应的处理意见(EPPO , 2003):1)通过 28d 的室内暴露,如果处理组相对于对照组土壤微生 物活性的差异未超过 25%,该药剂被认为“低风 险”;2)通过 28d 的室内暴露,如果处理组相对于 对照组土壤微生物活性的差异达到或超过 25%, 应该延长暴露时间进一步测试,但最终的暴露时 间不应超过 100d;3)延长暴露时间后,如果处理组 相对于对照组土壤微生物活性的差异未超过 25%,该药剂被认为具有“中等风险”;反之,如果 处理组相对于对照组土壤微生物活性的差异达到 或超过 25%,该药剂被认为具有“高风险”;4)对于 室内判断为“高风险”的药剂,一般需开展温室或 田间试验,以明确供试药剂在实际应用中的风险 程度、范围和持续时间 . 蔡道基等(1986)针对 15d 室内试验提出了毒 性等级划分的下列标准:1)在 1mg·kg -1(干土)的 试验浓度下,如果处理组相对于对照组的土壤微 生物活性下降率达到或超过 50%,供试药剂对土 壤微生物“高毒”;2)在 10mg·kg-1(干土)的试验浓 度下,如果处理组相对于对照组的土壤微生物活 性下降率未达到 50%,供试药剂对土壤微生物“低 毒”;3)在 10mg·kg-1(干土)的试验浓度下,处理组 相对于对照组的土壤微生物活性下降率达到或超 过 50%,而在 1mg·kg -1(干土)的试验浓度下,如 果处理组相对于对照组的土壤微生物活性下降率 未达到 50%,供试药剂对土壤微生物具有“中等 毒性”. 上述划分主要基于以下假设:1)大多数农药的 最高田间用量不超过 750g·hm -1;2)均匀施用的农 药大多分布在距地表 0~5cm、容重为 1.5g·cm -3 的 土层中;3)基于上述两个假设大多数农药在土壤 中的最高起始浓度不超过 1mg·kg-1干土;4)在最 高起始浓度下,如果处理组相对于对照组的土壤 微生物活性下降幅度达到或超过 50%,说明该农 药对土壤微生物“高毒”;5)在“条施”或“点施”等 特殊施药条件下,农药在农田中的分布面积仅有 均匀施药时的 1/10,或者说农药在局部农田中的 最高起始浓度可能达到均匀施药时的 10 倍,即 23 生 态 毒 理 学 报 第 5 卷 10mg·kg -1(干土). 在此前提下,如果处理组相对 于对照组的土壤微生物活性下降幅度未能达到 50%,说明该农药对对土壤微生物“低毒”. 衡量农药对土壤微生物的影响,除抑制程度之 外,抑制作用所持续的时间具有同样重要的意义 . 蔡道基等(1986)综合抑制程度、抑制所持续的时 间,以及造成该抑制所需的暴露浓度三方面因素, 提出使用“危害系数”评估农药对土壤微生物影响 的设想 .“危害系数”,可由下列来计算: 危害系数 = 抑制率(%)×抑制所持续的时间 暴露浓度 农药的“危害系数”可以被划分成下列 3 个等 级:1)“危害系数”≥200,具有“严重危害”;2)200> “危害系数”≥20.0,具有“中等危害”;3)“危害系 数”<20.0,“无实际危害”. 上述划分的主要依据是:1) 在 1mg·kg -1(干 土)的浓度下,经过 120d(即 4 个月,相当于 1 个生 长季)的暴露期,如果处理组相对于对照组的土壤 微生物活性下降幅度仍然能够达到或超过 50%, 说明该农药对对土壤微生物具有“严重危害”;2) 在 10mg·kg -1(干土)的浓度下,经过 120d 的暴露 期,如果处理组相对于对照组的土壤微生物活性 下降幅度未能达到 50%,说明该农药对对土壤微 生物“无实际危害”;3)在 10mg·kg-1(干土)的浓度 下,经过 120d 的暴露期,处理组相对于对照组的土 壤微生物活性下降幅度达到或超过 50%,但是在 1mg·kg-1(干土)的浓度下,经过同样的暴露期,处 理组相对于对照组的土壤微生物活性下降幅度未 能达到50%,说明该农药对对土壤微生物具有“中 等危害”. “危害系数”可用于田间试验的结果评估 . 需 要指出的是,为计算“危害系数”所开展的田间试 验,其持续时间应该是 120d,而不是室内试验所采 用的 15d . 研究和确定农药对土壤微生物的影响,是农药 生态风险评估和风险管理的客观需要 . 而关注这 方面问题,是农药环境毒理学向生态毒理学发展 的一个重要标志 . 针对土壤微生物的化学品评估 试验,无论在室内、温室,还是在田间进行,均属于 系统层次的研究 . 室内就相当于一个土壤微宇宙 试验 . 此类试验之所以选择功能性指标作为测试 终点,是因为这类指标是土壤生态系统物质和能 量循环水平以及系统抗胁迫能力的集中体现 . 对 土壤微生物而言,以室内试验结果推测其在野外 可能受到的影响,比起其他类型的非靶标生物做 类似推测时的结果可靠性要强得多 . 室内试验关 键的一点,是要保持土样中微生物群落结构和功 能的完整性,在试验过程中不会受到药剂以外的 因素的破坏 . 通讯作者简介:李少南(1963─),男,副教授,主要从事 农药生态毒理学研究 . 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