蛋白质折叠论文：HIV_1TAT蛋白转导肽的研究进展

中国生物工程杂志 � Ch ina B io techno logy, 2010, 30( 10) : 66�73 HIV�1 TAT蛋白转导肽的研究进展* 吴永红 � 张成岗** (军事医学科学院放射与辐射医学研究所 蛋白质组学国家重点实验室 � 北京 � 100850) 摘要 � TAT蛋白转导肽是人类免疫缺陷病毒 1型 ( human immunodefic iency v irus type 1, H IV�1)编 码的一段富含碱性氨基酸、带正电荷的多肽,属于蛋白转导域家族的一员。长期研究发现其全长 及 11个碱性氨基酸富集区的核心肽段 ( YGRKKRRQRRR)不仅能够在包括蛋白质、多肽及核酸等 多种外源生物大分子的跨膜转导过程中具有重要作用, 而且能够携带这些外源生物大分子通过 活体细胞的各种生物膜性结构 (如细胞膜和血脑屏障等 )并发挥生理功能,但其跨膜转导机制仍 不明确。新近研究还发现 TAT核心肽段在促进外源蛋白高效达过程中也具有重要作用, 能够 显著增加外源蛋白高效、可溶性表达的水平,显示了 TAT蛋白转导肽的新功能。以 TAT蛋白转导 肽跨膜转导作用的长期研究背景为基础,分别从 TAT蛋白转导肽的结构特点、其跨膜转导作用的 影响因素及其作用机制等方面进行了系统综述,进一步结合 TAT蛋白转导肽的最新研究进展分 别从药物研发、机制探索及新功能的开发等方面展望了后续研究方向与应用价值, 不仅为深入阐 述 TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用的功能意义提供了参考依据,而且为 TAT蛋白转导肽在微生 物工程及蛋白质工程等领域的潜在应用价值提供了重要参考信息。 关键词 � TAT � 蛋白转导肽 � 碱性氨基酸 � 蛋白转导 � 外源蛋白表达 中图分类号 � Q819 收稿日期: 2010�06�08� � 修回日期: 2010�07�13 * 国家 � 973 ( 2006CB504100 )、国家科技 重大专项 ( 2009ZX09503�002, 2009ZX09301�002, 2009ZX09103�616 )、国家自 然科学基金 ( 30973107, 30772293)资助项目 ** 通讯作者,电子信箱: zhangcg@ bm .i ac. cn � � 生物体是一个多层面、多因素相互协调发展的复 杂有机体,机体内大量生物分子 (如寡核苷酸、核酸、多 肽和蛋白质等 )的调节失控或缺乏将导致严重疾病。 细胞膜作为生物体内重要的天然屏障,虽可有效保护 机体免受胞外有害物质的侵袭, 但也同时能够阻碍胞 外物质如药物等的有效摄入,从而会导致这些药物分 子不能有效地被转运入细胞而发挥治疗作用。因此, 开发安全、高效、可控的外源分子跨膜转运技术以促进 对细胞结构与功能的干预一直是基础研究及药物研发 等领域亟待解决的难题。目前,虽然可以通过显微注 射法 [ 1�2]、电穿孔法 [ 3�4]、脂质体介导法 [ 5�6]和病毒载体 介导法 [ 7�8]等多种方法实现外源生物大分子的跨膜转 运,但由于这些方法具有转运效率低、细胞破坏性大、 安全性差、细胞毒性大、靶标特异性差、耗时多和成本 高等缺点,使其大规模应用及推广受到极大限制。 � � 许多研究者通过长期深入研究发现, 自然界中有 一类天然存在的多肽能够安全高效地实现外源生物大 分子的跨膜转导, 进而将其归为一个家族即蛋白转导 域家族 [ 9�12]。近二十多年的研究发现该家族是一类广 泛存在于自然界并富含碱性氨基酸序列的多肽, 其长 度一般小于 20个氨基酸,因其能够介导多种外源生物 大分子通过各种生物膜性结构进入细胞而得名 [ 9]。迄 今为止已发现多种自然界中天然存在及人工合成的蛋 白转导域 (表 1 ), 主要包括人类免疫缺陷病毒 1型 ( hum an mi munodeficiency virus type 1, H IV �1)编码的反 式转录激活因子 TAT [ 13�14]、果蝇同源异型转录因子 ANTP [ 15]、单纯疱疹病毒 1 型 ( HSV�1 ) 转录因子 VP22 [16]和人工合成的多聚精氨酸及多聚赖氨酸 [ 17�19] 等,不仅能够介导多种外源蛋白跨膜转导进入细胞,如 超氧化物岐化酶 ( SOD )和过氧化氢酶 [ 19, 20] ,而且还能 够介导多种其他外源物质如核酸和其他颗粒性物质 2010, 30( 10) 吴永红 等: H IV�1 TAT蛋白转导肽的研究进展 (如纳米材料 )等通过多种生物膜性结构进入细胞并保 持其生物活性,如细胞质膜和血脑屏障等 [ 21�24]。目前, 蛋白转导域家族中研究较多且较为深入的是 H IV �1编 码的反式转录激活因子 TAT蛋白转导肽,许多研究发 现其全长及其中的 11个碱性氨基酸富集区的核心肽 段在外源生物大分子的安全高效跨膜转导过程中具有 重要作用,而我们新近还发现 TAT的 11个碱性氨基酸 富集区的核心肽段能够显著地促进外源蛋白高效可溶 性表达 [ 25],发现了 TAT蛋白转导肽的新功能。本文分 别从 TAT蛋白肽的结构特点、跨膜转导的影响因素及 其作用机制等方面综述相关研究进展, 旨在为基于 TAT功能的相关研究及应用提供参考依据。 表 1� 蛋白转导域家族成员及核心氨基酸组成 Tab le 1� Fam ilym em ber of prote in transduction dom ain and its core am ino acids com ponents 起 源 名 称 核心氨基酸序列 参考文献 H IV�1 TAT TyrG lyArgLysLysArgArgG lnA rgA rgA rg 13, 14 Drosoph ila ANTP ArgG lnIsoLysIsoT rpPheG lnA snA rgA rgM etLysTrpLysLys 15 HSV�1 VP22 A spA laA laThrA laTh rArgG lyA rgS erA laA laS erA rgProThrG lu A rgProA rgA laProA laA rgSerA laS erA rgProArgArgProValG lu 16 化学合成 寡聚精氨酸 ( Rn, n= 5~ 9) R 5 : ArgArgArgArgArg R6: A rgA rgA rgA rgA rgA rg R 7: ArgArgArgArgArgArgA rg R8: A rgA rgA rgA rgA rgA rgA rgA rg R 9: A rgArgArgArgArgArgArgA rgA rg 17, 18 化学合成 寡聚赖氨酸 LysLysLysLysLysLysLysLysLys 19 1� TAT蛋白转导肽的结构特点 � � H IV�1是一种引起获得性免疫缺陷综合征的高度 病原性慢病毒,可编码多种蛋白调控自身及宿主基因 的表达,其中反式转录激活因子蛋白 TAT是目前研究 的热点,不仅能够与 H IV �1长末端重复序列的反式激 活应答元件 ( trans�activation response elem en ,t TAR )结 合反式激活病毒基因的转录延伸, 进而调控病毒基因 的表达等,而且还可介导多种外源生物大分子通过细 胞膜等各种膜性结构的脂质双分子层进入细胞并发挥 生理功能 [ 26�28]。G reen等 [ 13]于 1988年首次报道外源给 予人工合成的 TAT全长蛋白时,能够通过 HeLa细胞膜 进入细胞核并反式激活 H IV长末端重复序列操纵的氯 霉素乙酰转移酶 mRNA 的转录, 进一步实验发现 TAT37~ 86截短体与 TAT 全长肽段的功能相同, 而 TAT1~ 37截短体则没有跨膜转导活性,说明 TAT跨膜转 导活性主要集中于 37 ~ 86位氨基酸。同时, Frankel 等 [14]也发现直接将纯化后的 TAT全长蛋白加入 H eLa 细胞培养液后,也能够通过细胞膜进入细胞核反式转 录激活病毒启动子并表达氯霉素乙酰转移酶。 1994 年, Faw ell等通过化学方法合成了含有 TAT蛋白截短 体 TAT1~ 72和 TAT37~ 72的多种酶,如 ��半乳糖苷酶、辣根 过氧化物酶和 RNase A等,研究发现该两个 TAT截短 体均具有介导外源蛋白跨膜转导活性,进一步揭示了 TAT蛋白跨膜转导作用的功能域主要集中于 37~ 72 位氨基酸 [ 29]。而 V ives等 [ 9]于 1997年则通过深入研究 揭示 TAT47�57的 11个氨基酸是其跨膜转导的核心区,其 特征为一段富含碱性氨基酸、带正电荷且具有蛋白转 导活性的多肽, 进而将具有该特征的一类多肽称为蛋 白转导域。 � � 根据病毒株的不同, TAT蛋白转导肽全长含有 86 ~ 130个氨基酸不等,由两个外显子编码,第一个外显 子编码 1~ 72位的氨基酸,第二个外显子编码 72位以 后的氨基酸。进一步分析 TAT蛋白转导肽全长发现由 5个重要的功能结构区组成, 包括 N �末端激活区、半胱 氨酸富集区、中心区、碱性氨基酸富集区和谷氨酰胺富 集区 (图 1 ) [ 30�32]。其中, 碱性氨基酸富集区是其核心 区,含有 11个核心氨基酸 ( YGRKKRRQRRR ), 包括 6 个精氨酸 ( R)和 2个赖氨酸 ( K ) [ 9]。目前研究发现碱 性氨基酸在 TAT蛋白转导肽介导的外源生物分子跨膜 转导过程中起关键作用,而且碱性氨基酸的数目直接 影响外源生物分子跨膜转导的效率。基于蛋白结构预 测发现 TAT蛋白转导肽碱性氨基酸富集区能形成 ��螺 旋结构, 而圆二色谱和核磁共振成像检测结果显示 TAT蛋白转导肽的碱性氨基酸富集区不具有形成功能 性结构的特点 [ 33] , 最新的 TAT �P�TEFb复合物晶体结 构显示 TAT可以通过诱导转录因子 P�TEFb复合物的 结构变化发挥功能 [ 34]。 67 中国生物工程杂志 China B io techno logy Vo.l 30 N o. 10 2010 图 1� TAT全长结构示意图 F ig. 1� Schemat ic d iagram of TAT fu ll�length structure 2� TAT蛋白转导肽跨膜转导作用的影响因素 � � TAT蛋白转导肽作为机体内重要生物大分子跨膜 转导作用的转运体, 经过二十多年的研究已被广泛用 于基础医学和药物研发等领域,已发现 TAT蛋白转导 肽介导的外源生物大分子跨膜转导作用是一个受多种 复杂因素调控的过程 (表 2 ),现归纳如下。 2. 1� 碱性氨基酸簇对跨膜转导效率的影响 2. 1. 1� 碱性氨基酸数目的影响 � 碱性氨基酸是构成 TAT蛋白核心肽段的主要氨基酸。基于 TAT蛋白转导 肽氨基酸的组成特点, 许多研究者从碱性氨基酸的角 度研究其在外源生物大分子跨膜转导中的作用。H an 等 [17]利用绿色荧光蛋白 ( green fluorescen t protein, GFP)为基因研究不同数目的精氨酸 ( R5~ 9 )和赖 氨酸 (K5~ 9 )介导的 GFP蛋白跨膜转导作用时发现, 随 着碱性氨基酸数目的增加其介导的外源蛋白跨膜转导 作用增强,其中多聚精氨酸簇的跨膜转导作用要强于 多聚赖氨酸簇; 5聚精氨酸簇的转导效率与 TAT核心 肽段的转导效率相同, 而 9聚赖氨酸簇的转导效率则 与 TAT核心肽段的转导效率相同。 Park等于 2002年 研究发现, 9聚赖氨酸簇能够携带超氧化物歧化酶转导 入人成纤维细胞,且其酶活性能在细胞中稳定维持 24 小时。同时,他们的研究还揭示 9聚赖氨酸簇的转导 效率要强于 TAT核心肽段的转导效率 [19]。由此可见, 即便由于实验条件和实验模型的区别,使得多聚赖氨 酸与 TAT核心肽段的转导效率存在一定的差异,但碱 性氨基酸的数目在外源生物大分子跨膜转导过程中的 作用是不容忽视的,将直接影响 TAT蛋白转导肽介导 的外源生物大分子跨膜转导的效率 [ 17�19]。 2. 1. 2� TAT蛋白核心肽段数目及位置的影响 � 已知 单一的 TAT核心肽段具有高效的外源生物大分子跨膜 转导活性,那么如果采取多个 TAT蛋白核心肽段共同 融合成嵌合体, 外源生物大分子的跨膜转导活性是否 会发生变化? Ryu等 [ 35]于 2003年利用 GFP为报告基 因,将 TAT蛋白核心肽段分别置于表达产物的氨基端 和羧基端及两端进行融合表达,结果发现氨基端和羧 基端与 TAT核心肽段相融合的蛋白转导效率相同,而 两端同时融合 TAT蛋白核心肽段的融合蛋白的跨膜转 导效率是单端的两倍。该研究组于 2005年进一步使 用超氧化物歧化酶作为报告基因也证明了该现象 [ 36] , 说明 TAT蛋白核心肽段的数目对外源生物大分子的跨 膜转导效率影响较大,而其所处位置对外源生物大分 子的跨膜转导作用并无显著影响。 2. 1. 3 � 碱性氨基酸周围其他组件的影响 � 目前许多 研究已经揭示 TAT蛋白转导肽的天然结构中碱性氨基 酸起着重要的作用,能够独立完成不同分子大小、不同 结构和不同理化特性外源生物大分子的跨膜转导。许 多研究者继而试图在 TAT核心肽段的氨基端和羧基端 分别加上不同序列及不同大小的外源组件,进一步研 究 TAT核心肽段及其衍生肽段的跨膜转导活性。研究 结果发现,即使在 TAT核心肽段的不同位置连接不同 疏水性及不同分子大小的外源组件, 也不能改变 TAT 核心肽段跨膜转导的特性, 而通过增加疏水性组件可 以改变 TAT核心肽段跨膜转导的效率 [ 37�42]。 Chen 等 [ 43]证明当在 TAT核心肽段的氨基端连接疏水性生 物素残基时, 可将 RNase A的跨膜转导活性增加近 6 倍,说明一些碱性氨基周围组件的介入虽然不能改变 TAT核心肽段跨膜转导的特性, 但可以在一定程度上 影响其跨膜转导效率。 2. 1. 4� TAT蛋白转导肽荷电性的影响 � TAT核心肽 段的结构特性显示其不仅含有碱性氨基酸,而且还带 有强烈的正电荷。研究发现该阳离子电荷的变化将严 68 2010, 30( 10) 吴永红 等: H IV�1 TAT蛋白转导肽的研究进展 重影响其跨膜转导活性,当通过单一删除或替换带有 正电荷的碱性氨基酸时,能够明显降低 TAT核心肽段 的跨膜转导活性 [ 9, 44�45]。进一步研究揭示精氨酸侧链 的胍基残基对 TAT肽段跨膜转导活性的影响较大, 明 显高于其他阳离子残基如赖氨酸残基、组氨酸残基和 鸟氨酸残基等,深入研究发现当强烈的阳离子电荷存 在时,有利于 TAT核心肽段携带靶物分子与荷负电的 生物膜性结构相结合,进而启动 TAT核心肽段介导的 后续跨膜转导作用 [ 46�47]。由此可见, TAT蛋白转导肽 荷电性的多少及其强度将直接影响其介导的外源生物 分子跨膜转导能力及活性。 2. 2� 外源生物分子对跨膜转导作用的影响 2. 2. 1� TAT蛋白转导肽暴露程度的影响 � TAT蛋白 转导肽能够介导多种不同分子量及不同直径大小的外 源生物大分子的跨膜转导, 如蛋白质、寡核苷酸和颗粒 性物质等 [ 29, 48�49]。由于 TAT蛋白转导肽融合生物大分 子的理化特性差异较大,不同的生物大分子将严重影 响 TAT蛋白转导肽的暴露程度, 进而影响其跨膜转导 活性。Torch ilin等利用不同长度脂链将脂质体与 TAT 蛋白转导肽连接,构建了不同空间长度的 TAT蛋白转 导肽与脂质体融合的嵌合体。研究结果显示只有适当 长度的脂链连接才能使 TAT蛋白转导肽充分暴露,进而 有效地介导脂质体的细胞内化 [48]。 Schwarze等利用 TAT核心肽段研究其介导的 ��半乳糖苷酶组织细胞跨 膜转导作用时发现,完全变性的 TAT���半乳糖苷酶融合 蛋白的组织细胞跨膜转导活性较强,深入分析可能是当 TAT核心肽段融合蛋白完全变性时, TAT核心肽段能够 完全暴露,进而最大程度地发挥其跨膜转导活性 [21, 50]。 2. 2. 2� TAT蛋白转导肽与外源生物大分子间化学连接 的影响 � 从现有的研究看,基于 TAT蛋白转导肽与其外 源生物大分子间化学连接的研究较少,多数研究只关心 获得 TAT蛋白转导肽介导外源生物大分子跨膜转导的 生物活性而不考虑其生化特性等。进一步分析发现, TAT蛋白转导肽与外源生物大分子间的化学连接作用较 大,不仅能够影响 TAT蛋白转导肽的暴露程度,而且可 以影响外源生物大分子转导后生物活性的发挥 [ 21]。通 过改造 TAT蛋白转导肽与其外源生物大分子间化学连 接的特性,不仅能够增加 TAT蛋白转导肽跨膜转导的活 性,而且有利于外源生物大分子胞内活性的发挥。 2. 2. 3� TAT蛋白转导肽密度的影响 � TAT蛋白转导肽 能够介导多种生物大分子的跨膜转导,如颗粒性物质、脂 质体和噬菌体等 [ 38, 49�52] ,如此巨大的生物大分子如何通 过生物膜性结构进入细胞一直是一个研究热点。许多研 究发现, TAT蛋白转导肽的密度在这些外源生物大分子 的跨膜转导过程中具有重要作用。Fawell等 [ 29]于 1994 年就已发现,一分子的天然 ��半乳糖苷酶大约需要 4~ 5 分子的 TAT蛋白转导肽才能被有效地转导入细胞。 Lew in等 [49]研究进一步发现,一分子直径为 45nm的铁磁 性颗粒大约需要 6~ 7分子的 TAT蛋白转导肽才能被有 效转运。有意思的是,高重复性 TAT蛋白转导肽的质粒 转导活性明显高于低重复性的转导活性,如质粒侧支上 含有 8个 TAT蛋白转导肽的转染效率要明显高于含有 4 个和 2个的, 转导效率与 TAT蛋白转导肽的密度成正 比 [38]。不过,现有研究虽然揭示了 TAT蛋白转导肽的密 度与外源生物大分子的跨膜转导作用关系密切,但是一 直未能够确定 TAT蛋白转导肽密度与其转导效率之间 的量效关系,也未见到 TAT蛋白转导肽介导外源生物大 分子跨膜转导所需最小数目的报道。 � � 综上所述,可以发现 TAT蛋白转导肽介导外源生 物大分子的跨膜转导作用是一个复杂的多因素调控过 程,通过优化其跨膜转导因素不仅可以改组其自身结 构,而且可以开发新的跨膜转导肽等。 表 2� TAT蛋白转导肽转导作用的影响因素 Tab le 2� Ingred ien ts of TAT prote in transduction dom ain 影响因素 功能 参考文献 碱性氨 基酸簇 碱性氨基酸数目 随着碱性氨基酸数目增加 TAT跨膜转导作用增强 17, 18, 19 TAT蛋白核心肽段数目及位置 氨基端和羧基端同时融合的转导效率是单端的两倍,且其所处位置对转导作用无显著影响 34, 35 碱性氨基酸周围其他组件 疏水性及不同分子大小组件均不能改变 TAT蛋白转导肽的跨膜转导特性,但一些疏水性组件可以影响其转导效率 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 TAT蛋白转导肽荷电性 TAT蛋白转导肽荷电性的多少及其强度将直接影响其跨膜转导能力和活性 9, 44, 45, 46, 47 TAT蛋白转导肽暴露程度 TAT蛋白转导肽暴露程度越大其跨膜转到活性越强 29, 48, 49, 50 外源生 物分子 TAT蛋白转导肽与外源生物 分子间化学连接 化学连接不仅影响 TAT蛋白转导肽的暴露程度,而且影响其跨膜转导活 性的发挥 21 TAT蛋白转导肽密度 不同分子大小的靶物分子所需 TAT蛋白转导肽协同跨膜转导的数目不同 29, 38, 49 69 中国生物工程杂志 China B io techno logy Vo.l 30 N o. 10 2010 3� TAT蛋白转导肽介导外源生物分子跨膜 转导的作用机制 � � TAT蛋白转导肽以其安全高效的跨膜转导作用已 经被广泛地应用于基础研究和药物研发等领域,有望 成为机体所需重要药物分子的潜在转运体。但由于其 跨膜转导作用机制依然不明确, 使其潜在应用受到了 极大限制。长期研究揭示 TAT蛋白转导肽介导的外源 生物分子跨膜转导作用机制可能与以下几个模型相关 (图 2)。 3. 1� 直接内化模型 � � 该模型的提出基于早期的一些初步实验基础, 研 究者通过实验发现 TAT蛋白转导肽介导的外源生物分 子跨膜转导作用是一个非受体、非转运蛋白和非能量 依赖的直接内化作用,依赖于 TAT蛋白转导肽的直接 易位进入细胞 [ 44] ,但进一步研究则发现 TAT蛋白转导 肽并不能自动携带外源生物分子易位入细胞, 而是依 赖于 TAT蛋白转导肽自身的正电荷与带负电荷的细胞 膜结合将生物分子运送入细胞内 [ 53]。目前的研究结果 已将该模型推翻。 3. 2� 倒置胶束模型 � � TAT蛋白转导肽作为蛋白转导域家族的一员, 与 该家族其他成员 (如 ANTP和 VP22等 )一样具有许多 相似的生物学特性: 富含碱性氨基酸和介导外源生物 分子安全高效跨膜转导。基于蛋白转导域家族的另一 个成员果蝇同源异型转录因子 ANTP介导的寡肽跨膜 转导作用是一个倒置胶束 ( inverted m icelles)模型,外源 生物分子通过转运体向细胞膜靠近,形成倒置胶束将 转运体融合蛋白包裹; 然后倒置胶束通过反转作用将 转运体融合蛋白释放入细胞内; 最后, 转运体与外源生 物分子释放,继而生物分子与其受体结合发挥生理功 能 [15, 54]。推而广之,该过程也应适用 TAT蛋白转导肽 介导的外源生物分子跨膜转导作用的机制。 3. 3� 胞吞作用模型 � � 随着研究的不断深入,早期认为 TAT蛋白转导肽 介导外源生物分子跨膜转导作用是一个非受体、非转 运蛋白和非能量依赖的直接内化作用的观点正在逐渐 被推翻。 Brooks等 [ 55]研究发现,当在低温或细胞培养 环境中进行能量剥夺时, TAT48�60肽段介导的细胞内化 作用显著下降,而且该内化作用的动力学过程与胞吞 作用一样缓慢。进一步通过胞内染色定位发现,细胞 内具有胞吞机制典型的点状分布模式。 Koppelhus 等 [ 56]研究则发现, TAT47�57肽段融合嵌合体能够以囊泡 状的形式被摄入多种人源细胞株,该过程具有时间、温 度和浓度依赖性。W adia等 [ 57�58]于 2004年进一步利用 胞吞作用的荧光标志物 FM 4�64研究了 TAT�Cre的跨 膜转导现象,发现二者具有胞内共定位作用,从而充分 说明 TAT蛋白转导肽介导的外源靶分子跨膜转导是一 个胞吞机制。从目前的研究数据来看, 胞吞作用模型 可能是 TAT蛋白转导肽介导外源生物分子跨膜转导作 用比较可能的机制, 但也不能排除其他模型。由于 TAT蛋白转导肽介导外源生物分子跨膜转导是一个复 杂的多因素调控过程,实验中各种因素的变化都会导 致其作用机制的揭示出现偏差,故而 TAT蛋白转导肽 介导外源生物分子跨膜转导的作用机制还需要更多更 系统研究才能够被真正揭示。 图 2� TAT蛋白转导肽转导机制示意图 F ig. 2� Schem atic d iagram d isp lay ing them echanism of TAT protein transduc tion pep tide 4� 展 � 望 � � TAT蛋白转导肽作为重要的蛋白转导域家族成员 虽然已被广泛地应用于多种外源生物分子的跨膜转 导,但其介导的外源生物分子跨膜转导作用的机制依 然不明。同时, 随着研究的不断深入, TAT蛋白转导肽 在外源蛋白高效可溶性表达中的新功能也在被发现。 基于现有的研究进展,后续 TAT蛋白转导肽的研究将 主要集中于以下几个方面。 4. 1� TAT蛋白转导肽作用机制的研究 � � 许多研究已经揭示 TAT蛋白转导肽具有多种外源 生物分子跨膜转导作用,如蛋白质、核酸和颗粒型分子 70 2010, 30( 10) 吴永红 等: H IV�1 TAT蛋白转导肽的研究进展 等。然而, TAT蛋白转导肽介导的外源生物分子跨膜 转导作用的机制依然是一个谜。虽然有多种假说模型 试图揭示 TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用机制,但到 目前为止没有一个大家公认的机制模型。TAT蛋白转 导肽携带外源生物分子转运过程是 �被动进入 还是 �主动摄入 将是未来研究的重点。 4. 2� 基础研究和药物研发 � � 生物体具有多种生物膜性结构,如细胞膜和血脑 屏障等,由于这些具有天然屏障功能的膜性结构的存 在,不仅保护了机体免受外界有害物质的侵袭, 而且阻 碍了外界有利生物分子的有效摄入。长期研究所发现 的天然存在的具有各种生物膜性结构转导作用的多肽 如 TAT蛋白转导肽,能够安全高效地携带外源生物分 子通过各种膜性结构转导入机体细胞,从而弥补了外 界生物分子不能有效跨膜转导的缺陷,为体外潜在药 物分子的跨膜转导提供安全高效的转运体。随着 TAT 蛋白转导肽介导的外源生物分子跨膜转导作用机制的 进一步深入揭示, TAT蛋白转导肽在基础研究和药物 研发领域的应用会越来越广。 4. 3� TAT蛋白转导肽的新功能 � � 长期以来 TAT蛋白转导肽的跨膜转导作用及其作 用机制的研究一直是该领域的热点,很少有研究者关 注于 TAT蛋白转导肽的其他功能。目前, 我们通过系 统研究发现 TAT蛋白转导肽,尤其是其 11个碱性氨基 酸的核心肽段,在外源蛋白的高效可溶性表达过程中 也具有重要作用。我们以 EGFP为报告基因,采用分子 克隆技术重组表达了 TAT�EGFP和 EGFP, 通过 SDS� PAGE和免疫印迹检测发现 TAT�EGFP融合蛋白的表 达水平明显高于非 TAT融合蛋白 EGFP;进一步亚细胞 定位实验发现 TAT�EGFP融合蛋白主要可溶性表达于 细胞质, 随着时间的增加其细胞周质成分增加, 而 EGFP主要表达于细胞周质。虽然我们的研究揭示了 TAT核心肽段具有新的促进外源蛋白高效可溶性表达 的功能,但具体机制还有待进一步深入研究。 � � 综上,我们可以看出关于 TAT蛋白转导肽的后续 研究将不仅仅局限于其跨膜转导作用及其作用机制的 进一步揭示,其潜在的药用价值及其新功能的发现与 应用也将成为后续研究重点。 参考文献 [ 1 ] M och izuk iT, K im J, Sasak iK. 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