基因工程的论文：结核杆菌重组基因16kD_38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值

[基金项目 ] � 浙江省医药卫生科研基金资助项目 ( 2009B131 ) [作者简介 ] � 范超明 ( 1968- ), 男 ,本科,副主任检验师,主要从 事临床生化、微生物实验诊断研究。 �实验研究 结核杆菌重组基因 16kD- 38kD融合蛋白诊断结核病的应用价值 范超明 1, 李伟 1,樊德利 1,郑小银 1,丁建祖 2 ( 1. 杭州师范大学附属医院 杭州市第二人民医院, 杭州 � 310015; 2. 浙江省医学科学院, 杭州 � 310015) [摘要 ] � 目的: 构建结核杆菌 16kD- 38kD重组融合基因,纯化 16kD- 38kD融合抗原,进一步评价其在结核病血清学诊 断中的应用价值。方法: 通过构建重组结核杆菌 16kD- 38kD融合基因工程菌株,经亲和层析纯化融合蛋白,以此蛋白为 抗原, 建立金标免疫层析法结核病人血清中的特异性抗体, 同时与单一的 16kD重组蛋白和 18kD重组蛋白进行比 较。结果: 16kD、38kD、16kD- 38kD三种重组抗原检测肺结核病人血清 201份检出率分别 56. 2% ( 113 /201)、57. 7% ( 116 /201)、73. 6% ( 148 /201), 融合蛋白抗原阳性检出率明显高于单一重组蛋白抗原, 对菌阳血清的检出率达到 81. 9% ;检测健康体检血清 179份阴性符合率分别为 87. 2% ( 156 /179)、89. 9% ( 161 /179)、88. 8% ( 159 /179) ,三种蛋白 无明显差异。结论: 16kD- 38kD融合蛋白具有较好的敏感性和特异性,与单一使用两种蛋白比较,对结核病人血清抗体 的检出率有很大的提高,在结核病血清学诊断中有较高的参考价值。 [关键词 ] � 结核杆菌; 16kD- 38kD融合蛋白; 金标层析法 [中图分类号 ] � S852. 61+ 8� � � � [文献标识码 ] � A � � � � [文章编号 ] � 1004- 8685( 2010) 10- 2471- 03 Evaluation of the recombinant 16kD- 38kD fusion protein ofMycobacterium Tuberculosis for serodiagnostic test FAN Chao- m ing1, LI Wei1, FAN D e- li1, ZHENG X iao- y in1, D ING J ian - zu2 ( 1. The A ffiliated H osp ital o fH angzhou Norm a l University H ang zhou Second People!s H ospita l, H angzhou, Zhe jiang 310015, China; 2. Zhejiang A cadem y ofM edica l Sc iences, H ang zhou 310015, Ch ina) [ Abstract] � Objective: To construct the prokaryo tic expression vector for gene encoding the 16kD- 38kD fusion prote in in orde r to sea rch a sero log icalm e thod to d istingu ish the state o f tubercu lous infection. M ethods: To ga in the recom binant prote in an tigen 16kD- 38kD ofMycobacter ium tubercu lo sis h ighly expressed in E. co li the fusion pro tein w ere pur ified w ith affinity chrom atogra� phy. To bu ild Co llo ida l go ld imm unochrom atographic assay w ith the fusion prote in antigen in order to de tect serum o fTB patients. A t the same tim e com pare the result w ith the s ing le 16kD and 38kprote in antigen. R esults: 201 patients serum w ere detec t w ith 16kD, 38kD, 16kD - 38kD three recom binant antigens, the pos itive ra te respectiv ely 56. 2% ( 113 /201), 57. 7% ( 116 /201) , 73. 6% ( 148 /201), the positive rate of 16kD- 38kD pro tein antigen w as h igher. 179 contro l samp les nega tive rate respec tive ly 87. 2% ( 156/179), 89. 9% ( 161 /179) , 88. 8% ( 159 /179), show s no evident d ifferences am ong them. Conclusion: 16kD- 38kD fusion prote in has good sensitiv ity and specific ity comparew ith the sing le 16kD and 38kD prote in antigen. In TB serod iag� nostic to be higher in reference va lue. [ Key words] � Mycobacter ium Tuberculos is; 16kD- 38kD fusion pro tein; Co llo idal go ld imm unochrom atographic assay � � 结核病 ( Tuberculosis)是一种人兽共患的慢性传染病,其 特征是在机体器官形成结核结节, 继而结节中心干酪样坏死 或钙化。据报道, 全球每年有 800万被诊断为新结核病人,其 中有 300万死亡 [ 1]。由于近年来多药耐药 (MDR )结核病的暴 发流行, 和艾滋病毒 ( H IV )的双重感染者增多, 结核问变得 更加复杂 [ 2]。目前, 结核病的检测以痰涂片为主, 但检出率较 低; 痰培养耗时太长, 需一个月以上。因此, 需要寻找新的检 测方法以弥补传统方法的不足, 结核抗体检测成为结核病快 速诊断和鉴别诊断的重要方法。本研究旨在对结核分支杆菌 重组基因 16kD- 38kD融合蛋白在金标免疫层析法诊断结核 病的价值进行评价, 为正确地早期诊断结核病提供新的材料。 1� 材料与方法 1. 1� 材料 1. 1. 1� 血清来源 � 肺结核病人痰检阳性血清 72份,痰检阴性 血清 86份, 肺外结核血清 43份, 来自德清县疾控中心;健康体 检血清 179份本院化验室提供。 1. 1. 2� 试剂 � 抗人 IgG单克隆抗体由浙江省医学科学院新技 术开发室自行研制蛋白含量 5 m g /m ;l羊抗鼠 IgG蛋白含量 10 m g /m l、牛血清白蛋白 ( BSA )购自杭州昊天生物技术有限公 司; 硝酸纤维素膜、聚酯膜、玻璃纤维膜为 M illipo r公司产品; 厚滤纸吸水垫、PVC底板、塑料外壳由杭州博顿生物技术公司 2471中国卫生检验杂志 2010年 10月第 20卷第 10期 � Ch in ese Jou rn al ofH ealth Laboratory Techno logy, Oct 2010; Vol 20� No 10 提供; 氯金酸 ( HAuC .l C .l 4H 2 O)购自上海化学试剂一厂; 柠檬 酸钠、碳酸钾、叠氮钠等为 S igm a产品。 1. 2� 实验方法 1. 2. 1� 重组抗原的表达、纯化 � 构建 16kD、38kD和 16kD - 38kD融合基因质粒,分别导入大肠埃希菌 BL21中,建立三种 重组菌株, 将菌株接种于含氨苄西林 ( Am p+ ) 50 �g /m l的 LB 液体培养基, 37∀ 振荡培养过夜。然后从中取 5 m ,l接种于 300 m l新鲜的含氨苄西林的 LB液体培养基, 37∀ 振荡培养 4 h, 至 A600约为 0. 6, 加入 IPTG至终浓度 0. 25 mm o l/L, 继续 37∀ 诱导 4 h; 离心收集菌体。超声破碎菌体, 10000 r /m in离 心, 收集上清液用 N i- Sephro se FF亲和柱纯化, SDS - PAGE 鉴定, L aww rry法测定蛋白含量, 计算公式: 蛋白含量 = A 655 � 3. 35�稀释倍数 1. 2. 2� 胶体金抗人 IgG 单克隆抗体探针 (结合物 )的制 备 � 按照文献 [3]方法制备胶体金颗粒, 然后标记抗人 IgG单 克隆抗体, 其步骤为: 超纯净水溶解氯金酸使其浓度为 0. 01% ,煮沸后每 100 m l加入 1%柠檬酸三钠溶液 1. 5 m ,l继 续煮沸 15 m in,等冷却后用 0. 2 m o l/L K2CO3调 pH 至 7. 0,快 速搅拌下加入抗人 IgG单克隆抗体 2 m g, 并继续搅拌 30 m in, 最后加入 10% BSA水溶液使终浓度呈 1%混匀, 以 2000 r /m in 离心 10 m in,弃沉淀, 上清液以 10000 r /m in离心 30 m in, 小心 吸去上清液, 沉淀物即为纯化的金标抗人 IgG单克隆抗体探 针, 将此溶于保存液中 ( 0. 02 mo l/L, pH 7. 4 T ris- H C,l含 1% BSA、0. 5 m g /m l聚乙二醇 20000和 0. 5 mg /m l NaN3 ) 4∀ 保存 备用。将标记好的抗人 IgG单抗金标探针稀释后用点膜机喷 点在聚酯膜上, 37∀ 烘干,放入铝箔袋中加入干燥剂, 封口,室 温保存备用。 1. 2. 3� 金标免疫层析检测卡的制备 1. 2. 3. 1� 将硝酸纤维素膜粘在 PVC底板中央, 用点膜机把 16kD重组蛋白、38kD重组蛋白和 16kD- 38kD融合蛋白抗原 分别点在硝酸纤维素膜上,作为检测线 ( T线 ), 同时在检测线 上方 5 mm 处点上羊抗鼠 IgG作为质控线 ( C线 ), 37∀ 烘干, 放入铝箔袋中加入干燥剂,封口, 室温保存备用。 1. 2. 3. 2� 组装 � 按图 1所示将玻璃纤维样品吸收垫、聚酯膜 金标垫、厚滤纸吸水垫分别粘贴在点好结核杆菌重组抗原的 PVC底板上,用自动切条机分切成 4 mm 宽度, 将切下的试纸 条装入塑料反应板中 ,即为结核杆菌抗体检测卡, 见图 2。 图 1� 试纸条组装示意图 1. 3� 血清标本检测 将上述试纸条装入一块特制的检测塑料板内, 检测板的 长 7. 0 cm, 宽 2. 0 cm, 分底及盖二部分, 板盖上有大、小 2个 孔, 小的为加样孔 (标有 S), 大的系观察口 (标有 T和 C)。装 板时将试纸条的吸水滤纸端紧贴小孔, 紧闭板盖即成。检测 时将血清直接滴加在加样孔内, 每份样本滴 3滴 (约 50 � l) 5 m in后在观察口判读结果。如在观察口的纤维素膜上显示两 条红线视为阳性性, 仅留一条对照红线 ( C线 )则为阴性, 见图 2,图 3。 2� 结果 2. 1� 重组抗原经 SDS - PAGE鉴定 , 纯化后的三种重组蛋白 电泳均呈单一条带, 分子量约 16kD、38kD和 55kD, 与的 蛋白完全符合; L aw rry法测定蛋白含量分别为 2. 8 mg /m l、 1. 9 mg /m l和 3. 2 m g /m l。 2. 2� 检测卡试剂最适工作浓度为, 金标抗人 IgG探针喷量 4� l/ cm, 16kD蛋白抗原和 38kD蛋白抗原稀释至 1. 5 mg /m ,l 16kD- 38kD蛋白抗原稀释至 2. 0 m g /m ,l羊抗鼠 IgG稀释至 2. 0 mg /m ,l喷量均为 1 � l/cm, 血清用量约 50 � l( 3滴 )。 2. 3� 16kD、38kD、16kD- 38kD三种重组抗原检测肺结核病人 血清 201分,其中痰检阳性血清 72份检出率分别为 61. 1% ( 44 /72)、65. 3% ( 47 /72)、81. 9% ( 59 /72); 痰检阴性血清 86 份检出率分别为 52. 3% ( 45 /86)、55. 8% ( 48 /86)、69. 8% ( 60 / 86); 肺外结核血清 43份检出率分别为 55. 8( 24 /43)、48. 8% ( 21 /43)、67. 4% ( 29 /43); 总检出率分别为 56. 2% ( 113 /201)、 57. 7% ( 116 /201)、73. 6% ( 148 /201), 融合蛋白抗原阳性检出 率明显高于单一重组蛋白抗原; 检测健康体检血清 179份阴性 符合率分别为 87. 2% ( 156/179)、89. 9% ( 161 /179)、88. 8% ( 159 /179) , 见表 1。 表 1� 三种重组抗原检测血清结果 血清 样本数 16kD抗原 阳性数 检出率 (% ) 38kD抗原 阳性数 检出率 (% ) 融合抗原 阳性数 检出率 (% ) 肺结核痰检阳性病人 72 44 61. 1 47 65. 3 59 81. 9 肺结核痰检阴性病人 86 45 52. 3 48 55. 8 60 69. 8 肺外结核病人 43 24 55. 8 21 48. 8 29 67. 4 健康人 179 23 12. 8 18 10. 1 20 11. 2 (下转第 2475页 ) 2472 中国卫生检验杂志 2010年 10月 第 20卷第 10期 � Ch inese Journal ofH ealth Laboratory T echnology, Oct 2010; Vol 20� No 10 蛋白质的合成等杀菌过程, 因此细菌对 C lO 2 没有抗药性。 C lO2可以吸附和穿过病毒的衣壳蛋白,与其中的 RNA反应破 坏基因合成 RNA的能力,并在病毒表面聚集了高浓度的 C lO 2 分子, 因而可以大大加强 C lO2的灭活效果。 目前 C lO 2消毒剂多用于城市自来水、井水等饮用水消毒, 国家#消毒技术∃ ( 2002年版 )规定饮用水消毒在饮用水 源水中加入 5 mg /L C lO2, 作用 5 m in, 使大肠杆菌数达到饮用 水卫生。卫生部颁布的生活饮用水标准中, 对 C lO2消毒 目前只规定了: 与水接触时间至少 30 m in, 出厂水中限值 0. 8 m g /L, 出厂水中余量 % 0. 1 m g /L, 管网末梢水中余量% 0. 02 mg /L,但对 C lO2总量尚未规范。 坑道水库储水因长期储存真菌污染较严重 [ 6] , 在特殊情 况下如战时或军事演练需要人员紧急进驻坑道时, 直接饮用 坑道储水对人员健康不利。饮用水的快速、有效消毒则显得 尤为重要, 而 C lO2 在坑道环境中对储水消毒快速, 5 m g /L C lO2的投入量 48 h达消毒效果, 在坑道阴暗低温环境下可保 持消毒效果达 90天,适合坑道储水短期消毒。而 C lO 2的不稳 定性, 是指 C lO2在强烈不利条件下,如光照或温度较高时可以 发生强烈的歧化作用 ,分解转化为亚氯酸根、氯酸根及次氯酸 根等次生产物 [ 7]。实验表明 C lO2稳定性与温度和光照有直 接关系, 温度越低稳定性越好, 避光可使 C lO2分解明显下降。 因坑道水库处于阴暗、低温且避光的环境, C lO2发生歧化作用 减弱, 因此能够保持比较稳定的残余量, 因此在短期内具有较 好的杀菌作用。同时实现 C lO 2 对坑道空气、物体表面和储水 消毒一体化 [8]。 当消毒后的储水 C lO2% 0. 35 m g /L时有明显的氯气味,饮 用前需经去氯处理。因 C lO 2 在水中以单分子形式存在, 储水 经煮沸后 C lO2从水中逸出,操作简单易行。该法不仅适用于 坑道储水, 也同样适用于部队演习、野营拉练或在特殊情况下 对 C lO2消毒水的应用, 具有广泛推广应用价值。 [参考文献 ] [ 1 ] 黄志明.稳定性二氧化氯应用手册 [M ] .第 1版.上海:上海科技文 献出版社, 1993: 9- 12. [ 2 ] 陈洁,罗晓晋,李霞. 二氧化氯溶液的稳定性测定 [ J].中国药物与 临床, 2007, 7( 2) : 95- 97. [ 3 ] 刘南.二氧化氯消毒研究进展 [ J] .重庆医学, 2005, 34 ( 3 ) : 449- 451. [ 4 ] 黄志明, 张东曙, 刘波, 等. 应大力推广二氧化氯用于空气消毒 [ J] .化工标准& 计量& 质量, 2003 ( 8) : 24- 26. [ 5 ] 龙峰,肖师宇.浅析二氧化氯替代液氯消毒的优势 [ J] .现代机械, 2006 ( 5) : 120- 122. [ 6 ] 张永良,李艳红,侯小平, 等.坑道储水影响因素及卫生保护研究 进展 [ J] .人民军医, 2009, 52 ( 6) : 338- 339. [ 7 ] 朱琨,陈慧,梁莹,等. 二氧化氯消毒液在常规条件下的储存方法 [ J] .中国消毒学杂志, 2006, 23 ( 2) : 129- 131. [ 8 ] 张永良,侯小平,关宏坤, 等.应用二氧化氯对坑道及人防工事空 气消毒的研究 [ J].军事医学科学院院刊, 2009, 33( 2 ) : 154- 156. (收稿日期: 2010- 05- 20) (上接第 2472页 ) 3� 讨论 � � 近年来, 随着结核发病率的回升, 进一步提高结核的诊断 水平成为结核病防治人员面临的一个重大课题。结核病的主 要诊断依据是临床症状, x线照片表现,痰菌检查, 虽然病原学 检查是诊断结核的金标准,但是由于痰涂片阳性率较低; 痰培 养需时太长, 因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。聚 合酶链反应 ( PCR )虽有很高的敏感性,但是技术复杂, 设备昂 贵, 限制其广泛应用 [ 4]。因此,结核病的血清学诊断因其固有 的优势, 如操作简便、快速、便于推广、无需特殊精密仪器, 尤 其是对痰培养阴性和肺外结核病有较为重要的辅助诊断价值 而受到广泛的重视。 16kD蛋白主要存在于结核杆菌的细胞膜上, 38kD蛋白是 结核杆菌的分泌抗原 ,两者均存在于结核杆菌复合群中, 是结 核杆菌特异性较高的抗原 [ 5, 6], 具有较高的免疫原性, 能刺激 机体产生特异性抗体, 适宜做血清学诊断。但是, 由于结核分 支杆菌抗原的复杂性 ,在宿主体内表达的数量、种类或时机可 能随病人的个体免疫背景和病程而异,表现出不同的抗体谱, 检测时有的抗原不表达,未检测出相应的抗体, 有的抗体含量 高, 有的则低。因此, 单一抗原检测, 往往检测的灵敏度并不 近人意。本研究将结核杆菌 16kD基因片段和 38kD基因片段 制备成融合片段, 构建工程菌, 经诱导培养, 亲和层析一次就 可获得一个含有 16kD和 38kD两种蛋白成分的融合蛋白抗 原, 节省了大量的人力和物力。以此蛋白为抗原建立金标免 疫层析结核抗体检测卡,检测 201份结核病人血清,检出率达 到 73. 6% ( 148 /201), 明显高于单一使用 16kD或 38kD抗原的 检出率 56. 2% ( 113/201)、57. 7% ( 116 /201) ,特别是对痰检阳 性的血清抗体检出率达到 81. 9% ( 59 /72) ;对 179份健康人血 清的检测其特异性均较高,分别为 87. 2% ( 156 /179)、89. 9% ( 161 /179)、88. 8% ( 159 /179)。经初步研究表明 16kD - 38kD 融合蛋白抗原在结核病诊断方面具有很大的应用价值, 可以 作为结核病诊断的备选抗原之一。 [参考文献 ] [ 1 ] X ing Z. The hun t for new tub ercu losis vaccines: ant i- TB imm un ity and rat ional design of vaccines[ J] . Cu rrent pharm D es, 2001, 7( 11 ) : 1015 - 1037. [ 2 ] Ahm edN, C aviedes L, A lam M, et al. D ist inctiveness ofM ycobac terium tubercu losis genotypes from H um an imm unodeficien cy v iru s typel sero� pos it ive and seronegat ive patients in lim a[ J] . Peru J C linM icrob io,l 2003, 41( 4 ): 1712- 1716. [ 3 ] 丁建祖,干小仙,沈慧英,等. 快速检测日本血吸虫抗体金标免疫 渗滤法的建立及应用 [ J] . 中国寄生虫病防治杂志, 1998, 11( 4) : 308- 309. [ 4 ] 李洪敏,王巍,李素梅, 等.三种结核分支杆菌耐药基因的检测方 法 [ J].中国防痨杂志, 2002, ( 24) : 317- 319. [ 5 ] Ivanyi J, Botham ley GH, Jackett PS, e t a l. Immuno- d iagnostic assays for tub ercu los is and lep rosy[ J]. Br M ed Bu l,l 1988, 44: 635- 649. [ 6] 张小刚 ,庄玉辉 ,何秀云,等. 重组结核分支杆菌 38kD和 16kD蛋 白用于结核病血清学诊断的价值 [ J ]. 中国防痨杂志, 2001, 23 ( 5) : 281- 282. (收稿日期: 2010- 06- 03) 2475中国卫生检验杂志 2010年 10月第 20卷第 10期 � Ch in ese Jou rn al ofH ealth Laboratory Techno logy, Oct 2010; Vol 20� No 10