生物基因工程论文：野生型PTEN诱导卵巢癌SKOV3细胞生物特性改变

第 31 卷 第 5 期 2010 年 9 月 中山大学学报（医学科学版） JOURNAL OF SUN YAT-SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES） Vol．31 No．5 Sep． 2010 抑癌基因PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten）编码的蛋白具有蛋白 酪氨酸磷酸酶和丝氨酸 ／苏氨酸磷酸酶双重特异 性磷酸酶活性及脂质磷酸酶活性， 它参与多条细 胞内信号通路的转导，调控细胞周期，对细胞的增 殖与转化等多种生物学行为有重要作用 ［1－2］。 现已 证实该基因不同位点的突变、 失活和表达减少与 多种肿瘤的发生、发展密切相关， 成为继 p53 后 野生型 PTEN诱导卵巢癌 SKOV3细胞生物特性改变 唐小龙 1， 何 敏 1， 江振友 2， 庞雪云 1， 张荣波 3， 汪雪峰 3 （1． 广东省中医院检验科， 广东 广州 510120； 2． 暨南大学医学院， 广东 广州 510120； 3． 安徽理工大学医学院生物工程研究所， 安徽 淮南 232001） 摘 要： 【目的】 探索野生型 PTEN 基因对卵巢癌细胞生物学特性的影响。 【方法】 将野生型 PTEN 基因克隆到 pAdxsi 腺病毒载体并感染 SKOV3 细胞。 荧光镜下检测腺病毒载体对 SKOV3 细胞的感染效率；用 CCK-8 法检测细胞增殖的抑制效 率；RT-PCR 与 WB 分别检测 PTEN mRNA 与蛋白表达水平变化； 免疫化学法与间接荧光法检测 PTEN 在细胞内的定位及细 胞内 NEDD4-1 和 RAD51 等分子表达。 【结果】 稳定转染 PTEN 后，24 h 内 PTEN 分布于细胞质与核内，而 72 h 后则主要集 中于细胞核内；显著增加细胞质内 NEDD4-1 和细核 RAD51 等分子表达。 【结论】 野生型 PTEN 可影响 SKOV3 细胞增殖，并 诱导细胞表达 RAD51 与 NEDD4-1 分子，有利于细胞 DNA 修复与细胞增殖抑制。 关键词： 转染； NEDD4-1； PTEN 基因 中图分类号： R737．31 文献标志码： A 文章编号： 1672-3554（2010）05-0602-06 Wild-type PTEN Induced Changes in Biological Characteristics of Ovarian Cancer SKOV3 Cells TANG Xiao-long1， HE Ming1， JIANG Zhen-you2， PANG Xue-yun1， ZHANG Rong-bo3， WANG Xue-feng3 （1． Clinical Laboratory， Guangdong Province Hospital of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510120， China； 2． Medical College， Jinan University， Guangzhou 510632， China； 3． Research Section of Biomedical Engineering， Medical College， Anhui University of Science and Technology， Huainan 232001， China） Abstract： 【Objective】 To explore the effect of wild-type PTEN gene on biological characteristics of ovarian cancer cells． 【Methods】 The wild-type PTEN gene was cloned into pAdxsi adenovirus vector and infected into SKOV3 cells， the infected efficiency of adenovirus on SKOV3 cells was detected by fluorescence microscopy； the inhibition efficiency on cell proliferation was assayed by CCK-8；RT-PCR and WB was used to detect the level of PTEN mRNA and protein expression changes respectively； the location of PTEN NEDD4-1，RAD51 and other molecules in cell were showed by immunochemical and indirect fluorescence． 【Results】 The PTEN could be observed in the cytoplasm and nucleus after 24 h of stable transfection， while after 72 h they could be presented mainly in nucleus； the transfection of PTEN could increase the expression of NEDD4-1， nuclear RAD51 molecules significantly in the cytoplasm． 【Conclusion】 The wild-type PTEN can effect the proliferation of SKOV3 cells and induce expression of RAD51 and NEDD4-1 molecules， thus would contribute to cellular DNA repair and cell proliferation inhibition． Key words： transfection； NEDD4-1 （neural precursor cell expressed， developmentally down-regulated 4 isoform 1）； PTEN （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten） ［J SUN Yat-sen Univ（Med Sci），2010，31（5）：602－607；613］ 收稿日期： 2010－02－14 基金项目： 国家自然科学基金（30973693） 作者简介： 唐小龙，博士，副教授，E-mail：txljd2006＠126．com 第 5 期 又一个与多种肿瘤发生发展密切相关的抑癌基 因。 近期研究显示妇科肿瘤与 PTEN 基因异常关 系密切， 其突变和缺失多发于乳腺癌、 子宫内膜 癌、卵巢癌等 ［2］。 本研究将野生型 PTEN 基因通过 腺病毒载体导入 SKOV3 卵巢癌细胞系中，探讨其 核内外的表达对卵巢癌细胞生物学功能的影响， 为卵巢癌的基因治疗进行初步的探索并提供有意 义的参考数据。 1 材料和方法 1．1 材料与试剂 CCK-8为日本同仁化学研究所产品； 胎牛血清 购于杭州四季青生物公司；脂质体 LipofectamsneTM2000 为 GIBCO公司产品。质粒 pEGFP-N1-PTEN 与人卵 巢癌细胞株 SKOV3 由本室保存；pAdxsi 腺病毒载 体系统、改建的人胚肾细胞 293T 均为北京诺赛基 因公司提供；PTEN 和 GAPDH 引物由北京赛百盛 公司合成 ；兔抗人 NEDD4-1（neural precursor cell expressed， developmentally down-regulated 4 isoform 1）、 鼠抗人 PTEN 抗体为美国 Santa Cruz 公司产 品；HRP 标记羊抗鼠 IgG、HRP 标记羊抗兔 IgG 抗 体均购自北京生物技术有限公司； 鼠抗人 RAD51 （DNA repair protein RAD51）购于上海锐聪科技发 展有限公司。 1．2 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN腺病毒载体的构建 首先构建 pShuttle-GFP-CMV-PTEN 重组穿梭 质粒：EcoRⅠ ／ SacⅡ酶切 pShuttle-GFP-CMV 重组 穿梭载体，CIP 去磷酸化处理，回收 5．1 ku 载体片 段， 同时 EcoRⅠ ／ SacⅡ酶切 pEGFP-N1-PTEN 回 收目的片段； 酶连切好的 PTEN 与 pShuttle-CMV- GFP 片段 （PTEN 前后的酶切位点分别是 EcoRⅠ 与 SalⅠ 、KpnⅠ和 SacⅡ ）， 得到 pShuttle-GFP- CMV-PTEN；转化并扩增，抽提质粒 pShuttle-GFP- CMV-PTEN。 再构建重组腺病毒载体质粒：Ⅰ-Ceu Ⅰ ＋Ⅰ-SceⅠ双酶切处理 pAdxsi 骨架质粒与 pShuttle-GFP-CMV-PTEN 质粒，切好的两目的片段 酶连， 产物转化并扩增带 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN 病毒质粒的 DH5a； 提取 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN 质粒。 产物分别进行酶切鉴定与测序。 1．3 重组腺病毒包装、扩增和滴度测定 293 细胞用含 100 mL ／ L FBS 的 DMEM 培养。 待细胞长满约 80％时，PacⅠ酶切线性化 pAdxsi- CMV-PTEN，转染 293 细胞，3 ～ 5 d 后，细胞开始 出现细胞病变，待大部分细胞病变并脱落时收获， 收集细胞及上清液， 反复冻融 3 次， 离心收集上 清，用上清继续感染 293 细胞大量扩增病毒，获取 大量病毒液于－80 ℃ 冻存备用；同时测定病毒滴 度。 1．4 细胞培养与腺病毒转染及其表达 SKOV3 细胞置于含 100 mL ／ L 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液中， 于 37 ℃、 体积分数为 5％ CO2 的细胞培养箱中常规培养，隔天传代。 Adxsi- GFP-CMV-PTEN 病毒以 100 PFU ／ cell 量加入培养 瓶中，作为腺病毒载体实验组（SKOV3 ／ PTEN），继 续培养 ； 同时设立无腺病毒载体感染对照组 （SKOV3 ／ CON）与空病毒 pAdxsi-CMV-GFP 感染的 对照组（SKOV3 ／ GFP），分别于不同阶段收集细胞， 提取各组细胞总 RNA， 行 RT-PCR 检测目的基因 表达情况。 引物序列如下：PTEN 上游 5′-ACCGCC AAATTTAATTGCAG-3′，下游 5′-GGGTCCTGAATT GGAGGAAT-3′，扩增片段长度为 469 bp；内参照 GAPDH 上 ：5′ -GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3′ ， 下：5′-TGAGGAGGGGAGATTCAGTG-3′，扩增片段 长度为 400 bp。 PCR 反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃ × 40 s， 55 ℃ × 60 s， 72 ℃ × 60 s， 28 个 循环；72 ℃ × 10 min。取 10 μL PCR 产物于 2％琼 脂糖凝胶上电泳并与 Marker 比较判断 PCR 产物 片段大小。 1．5 PTEN 转染对 SKOV3 细胞生长的影响 SKOV3 细胞进行 PTEN 转染后 24 h 胰酶消 化，调整细胞为 5 × 104 ／ mL，以 0．2 mL ／孔移入 96 孔板， 8 孔 ／板， 按同样方法处理 SKOV3 ／ GFP 和 SKOV3 ／ CON 等组细胞。 从第 2 天开始，每天同一 时间取一块板， 于实验各孔分别加入 CCK-8 试剂 10 μL，37 ℃继续孵育 1 h， 测定吸光度值 D（450 nm），根据 CCK-8 测定结果分析 PTEN 对 SKOV3 生长影响。 1．6 Western Blot 检测 分别收集不同时间 SKOV3 ／ PTEN 组细胞， 裂 解细胞并抽提细胞质与细胞核蛋白上清液 ，跑 SDS-PAGE 胶，恒压 120 V，电泳 2 h 后用湿转移 法， 电转印到 0．22 μm 孔径的 PVDF 膜上， 在为 5％脱脂牛奶 TBST 的封闭液中，室温 1 h，TBST 漂 洗 2 次；分别加鼠抗人 PTEN、兔抗人 NEDD4-1 与 鼠抗人 RAD51 一抗， 4 ℃振荡过夜。 TBST 液漂洗 唐小龙，等． 野生型 PTEN 诱导卵巢癌 SKOV3 细胞生物特性改变 603 中山大学学报（医学科学版） 第 31 卷 数次，每次 15 min，加入 HRP 标记的二抗，室温振 荡 1 h 后漂洗 3 次， ECL 显色。 1．7 免疫细胞化学与间接荧光检测 各组细胞爬片，进行相应的实验后固定细胞， 并行 TritonX-100 透化，分别加入相应的一抗（兔 抗人 NEDD4-1、鼠抗人 PTEN 与 RAD51） 4 ℃孵 育过夜后，再用 HRP 标记的二抗孵育，DAB 显色； 或与 CY3－羊抗兔 IgG、CY5 羊抗鼠 IgG 等二抗 孵育后镜检 ， 以检测细胞中 PTEN、RAD51 与 NEDD4-1 等相关分子表达与分布情况。 1．8 统计学处理 实验数据以 3 次相同实验结果的均数 ± 差（x ± s）表示，用 SPSS 10．0 进行统计，采用单因 素方差分析（one-Way ANOVA）。 2 结 果 2．1 pShuttle-GFP-CMV-PTEN 与 pAdxsi-GFP- CMV-PTEN 的鉴定 pShuttle-GFP-CMV-PTEN EcoRⅠ ／ SacⅡ酶切， 阳性克隆将得到 5．1 ku 和 1．3 ku 两条带（图 1A）； 而阴性克隆只有 5．1 ku 一条带 。 XhoⅠ酶切 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN，因重组腺病毒载体骨架序 列上自带 6 个 XhoⅠ酶切位点，PTEN 片段从穿梭 质粒上带来 1 个 XhoⅠ酶切位点， 因此 XhoⅠ酶 切阳性克隆后应 14、11．8、3．5、2．93、2．47、1．45 和 0．6 ku 等 7 条带 （图 1B）； 而阴性克隆只有 14、 11．8、4．0、2．47、1．45 和 0．6 ku 等 6 条带（图 1C）。 2．2 重组腺病毒的产生和扩增 PacⅠ酶切线性化的 pAdxsi-GFP-CMV-PTEN 重组腺病毒质粒经脂质体 Lipofectamine2000 转染 293 细胞 72 h 后， 细胞开始细胞病变效应；5 d 后 细胞全部悬浮，收集病毒混悬液。 2．3 腺病毒滴度测定 在重复扩增、收集病毒颗粒后，为了便于病毒 感染细胞时能确定病毒用量， 本实验采用的是 PFU 空斑计数法， 对病毒滴度进行了计算， 得到 ADxsi-CMV-PTEN 重组腺病毒的滴度为 2．5 × 109 PFU ／ mL；使用同样的方法测定对照组，空载腺病 毒 ADxsi 的滴度为 3．5 × 109 PFU ／ mL。 2．4 转染后 SKOV3 细胞内 PTEN 表达与分布 普通显微镜下观察：ADxsi-CMV-PTEN 重组腺 病毒转染前 SKOV3 细胞呈圆形，边缘清晰，染色 均匀，细胞膜表面稍有隆起，细胞贴壁生长，增殖、 生长良好；转染 24 h 后，荧光镜下可见细胞内表 达腺病毒自带的报告基因 EGFP （图 2A）；3 d 后 SKOV3 ／ PTEN 组细胞行 PTEN 蛋白的免疫细胞化 学检测， 显示超量表达的野生型 PTEN 蛋白在细 胞核和细胞质中都存在， 但 PTEN 存在于绝大部 分细胞质内， 少部分细胞核内明显富集了 PTEN （图 2B，C）； 进一步行 PTEN 基因 RT-PCR 产物经 琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组腺病毒感染 2 d 与 8 d 后，SKOV3 ／ PTEN 组证实于 469 bp 处扩增的目的 条带（图 3A）。 应用细胞核蛋白提取试剂盒，分别 提取 Adxsi-GFP-CMV-PTEN 转染后 2、4、8 和 16 d的 SKOV3 ／ PTEN 组细胞的核蛋白进行 Western blot 检测，PARP 核膜蛋白作内参照，结果 PTEN 蛋 白在细胞核内持续表达 （图 3B）， 提示SKOV3 ／ PTEN 组细胞显著上调细胞核 PTEN 水平，与对照 组 SKOV3 ／ CON 和 SKOV3 ／ GFP 均有显著差异性 （P ＜ 0．01）。 2．5 转染后 SKOV3 细胞内相关分子的表达与 分布 载体感染对照组 、 空病毒对照组与 Adxsi- GFP-CMV-PTEN 转染后实验组（SKOV3 ／ PTEN 组） 的分别进行免疫细胞化学与间接荧光检测， 结果 载体感染对照组与空病毒对照组的细胞质中 NEDD4-1 分子有极低水平的表达 （图 4A），但 RAD51 检测不到 （图 4C）； 而 Adxsi-GFP-CMV- PTEN 转染后实验组的细胞质中 NEDD4-1 表达显 著增强（图 4B），在部分细胞核内 RAD51 分子也 604 第 5 期 显著表达（图 4D）。 2．6 各组细胞中 NEDD4-1 与 RAD51 分子的表 达与分布 分别采用蛋白提取试剂盒分别提取载体感染 对照组、 空病毒对照组的实验结果及 Adxsi-GFP- CMV-PTEN 转染后的实验组（48 和 96 h）的细胞 质与细胞核蛋白，进行 Western blot，依次检测细 胞质内 NADD4-1、细胞核内 RAD51 分子，GAPDH 作内参照，结果空载体感染对照组、空病毒对照 组NADD4-1 均有低水平的表达 ， 而 Adxsi-GFP- CMV-PTEN 转染后的实验组（48 h，96 h）表达水平 唐小龙，等． 野生型 PTEN 诱导卵巢癌 SKOV3 细胞生物特性改变 605 中山大学学报（医学科学版） 第 31 卷 显著升高；同时载体感染对照组、空病毒对照组的 细胞内不表达 RAD51，但 PTEN 表达的实验组（48 h，96 h）细胞核内 RAD51 持续表达（图 5）。 2．7 PTEN 基因转染后对 SKOV3 细胞的生长的 影响 CCK-8 检测显示 ：SKOV3 ／ PTEN 组相对于 SKOV3 ／ CON 与 SKOV3 ／ GFP 组的增殖能力明显 降低 （P ＜ 0．01），而 SKOV3 ／ GFP 组与 SKOV3 ／ CON 组相比差异无统计学意义（P ＞ 0．05，图 6）。 3 讨 论 PTEN 是最易突变的抑癌基因之一 ，是多种 细胞生长、分化和维持生存的抑制物，突变或者被 敲除后，可能引起前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和脑 癌。 PTEN 蛋白大多位于细胞质中，有时也出现在 细胞核。 胞质中的 PTEN 功能已明晰，具有拮抗酪 氨酸激酶活性， 表现为脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶 活性； PTEN 是磷酸肌醇－3－激酶（PI3K）信号传导 级联的关键负调节子，其底物磷酯酰肌醇－3， 4， 5 三磷酸（PIP3）能特异性地使磷酯酰肌醇 D3 环 去磷酸化，从而拮抗 PI3K 底物磷酸化，负性调控 PI3K ／ AKT ／ PKB 通路 ［3－4］。 国内外大量研究显示 PTEN 的失活频频发生于卵巢癌组织中 ［5－6］，提示 PTEN 基因异常与卵巢癌的发生、 发展有着密切 联系。 我们应用 pAdxsi 腺病毒载体系统构建了携带 野生型 PTEN 基因的重组腺病毒， 导入卵巢癌细 胞 SKOV3，RT-PCR 与 Western blot 结果均证实 ： Adxsi-GFP-CMV-PTEN转染后 PTEN mRNA与 PTEN 蛋白在细胞中稳定高效表达 （见图 2，3）。 应用 CCK-8 等检测 PTEN 对卵巢癌细胞 SKOV3 的增殖 与活性影响，其原理是通过试剂中 WST-8［2－（2－ 甲氧基－4－硝基苯基）－3－（4－硝基苯基）－5－（2，4－ 二磺酸苯 ）－2H－四唑单钠盐 ］ 在电子载体 1- Methoxy PMS［1－甲氧基－5－甲基吩嗪硫酸二甲酯］ 的作用下被细胞线粒体中的乳酸脱氢酶（LDH）还 原为具有高度水溶性的甲臢 （Formazan dye），生 成 Formazan dye 量与活细胞数量成正比的原理而 进行细胞增殖分析 ［7 ］。 从图 6 可以发现 ，使用 PTEN 可以明显抑制细胞生长，表现出抑制肿瘤增 殖的活性。 细胞的自身网络调控作用常常导致外源性基 因表达和或功能受到限制。 我们在研究过程中也 发现 PTEN 分子在转染的早期（48 h 之内）主要分 布于细胞质中，而转染 72 h 后，则在细胞质与细 胞核均有存在， 是什么因素导致 PTEN 分子的异 位分布尚不清楚。先前文献认为 NEDD4-1（neural precursor cell expressed， developmentally down- regulated 4 isoform 1）通过泛素化介导 PTEN 的赖 氨酸（Lys）K289 以及其他几个位点氨基酸残基等 多位点泛素化，过度表达的 NEDD4-1 增加细胞质 内的 PTEN 降解， 抑制 PTEN 功能而增强细胞转 化； 同时泛素化还可以调节 PTEN 在细胞中的定 位，单泛素化使 PTEN 向细胞核运动，并在细胞核 中稳定存在 ［9－10］。 细胞核 PTEN 对抑制肿瘤至关重 要 ，核内 PTEN 诱导 Rad51 表达 ，维持染色体稳 定和调控 DNA 修复。我们在检测细胞内 NEDD4-1 的表达情况时发现， 当 Adxsi-GFP-CMV-PTEN 转 606 第 5 期 染后 24 h， 细胞质内 NEDD4-1 开始上调表达，而 48 h 后，细胞核内的 PTEN 水平显著增高，甚至出 现部分细胞核浓集现象， 我们推测可能是因细胞 质 PTEN 过表达而诱导细胞应激性增加 NEDD4-1 水平来调控细胞内 PTEN 的水平与 PTEN 再分布， 这一方面可以诱导细胞内过表达的 PTEN 降解， 另一方面也可促进细胞质内的 PTEN 分子通过单 位点泛素化而进入细胞核发挥其生物学功能，但 NEDD4-1 被怎样调节、NEDD4-1 介导的 PTEN 泛 素化而导致细胞质内 PTEN 的大量丧失有哪些组 织和生理学背景； 泛素化 PTEN 进入细胞核内是 由扩散引起的被动运输、 还是由 PTEN C 末端的 细胞核定位信号引起的主动运输、或由 N 末端细 胞核定位结构域以及多种细胞核排出基序介导 的依赖于 Ran 的输入均不清楚，有待进一步深入 研究。 为探索细胞核内的 PTEN 或是泛素化的 PTEN 是否具有生物学功能，我们检测了与 PTEN 功能密切相关的分子 RAD51。 结果显示：当外源 性 PTEN 进入细胞核后 ， 核内开始可检测到 RAD51 分子表达。 基因组稳定与否是肿瘤产生的 重要原因之一，而基因组的稳定受控于许多机制， 其中之一是染色体同源重组机制，而 RAD51 是染 色体同源重组和 DNA 双链断裂点（DSB）修复的必 须组分之一，RAD51 的参与可使细胞中 DNA 双链 断裂点（DSB）减少，在受损 DNA 无差错修复行为 中发挥核心作用 ［10－11］；同时亦参与维持正常细胞 周期［10－12］，所以核内高水平的 PTEN 分子对染色体 异位等差错以及维持正常细胞周期具有直接与间 接作用，虽未见 PTEN 直接活化 RAD51 启动子的 报道， 但 PTEN 的表达可增加 E2F 介导的反式活 化或其它方式来活化 RAD51 表达 ［10－12］，从而来调 节肿瘤细胞染色体的修复， 显然对肿瘤的控制具 有重要的生物学意义。 总之， 本实验研究结果表明：PTEN 通过影响 多种细胞信号传导途径 ， 可明显抑制卵巢癌 SKOV3 细胞增殖， 以野生型 PTEN 基因可反式诱 导细胞质内 NEDD4-1 上调表达， 另一方面 PTEN 入细胞核后诱导核内 RAD51 表达， 表明外源性 PTEN 分子有利于通过上下游相关分子抑制细胞 增殖，修复细胞内 DNA 双链断裂点（DSB），维护基 因组稳定。 因此，核 PTEN 是必不可少的肿瘤抑制 因子， 由此可以推测维持细胞核内 PTEN 水平的 稳定， 对那些存在 PTEN 突变的肿瘤可能是一种 治疗策略。 显然，对于能选择性阻断 PTEN 多位点 泛素化，而利于其单位点泛素化；有效阻止 PTEN 降解，且促进其进入细胞核内的药物，有可能成为 治疗 PTEN 突变引起的肿瘤的新希望， 进而为进 一步的基因治疗卵巢癌研究奠定基础。 至于调节 PTEN 稳定性、 活性和位置的生理学信号是什么？ PTEN 的全部功能是否在任何方面对肿瘤抑制都 是重要的？ 等问题也有待进一步研究。 参考文献： Tang Y， Eng C． PTEN autoregulates its expression by stabilization of p53 in a phosphatase-independent manner ［J］． Cancer Res， 2006， 66（2）： 736－742． Gil A， Andrés-Pons A， Fernández E， et al． Nuclear localization of PTEN by a ran-dependent mechanism enhances apoptosis：involvement of an N-terminal nuclear localization domain and multiple nuclear exclusion motifs ［J］ ． Mol Biol Cell， 2006， 17（9）： 4002－ 4013． Nemenoff RA， Simpson PA， Furgeson SB， et al． Targeted deletion of PTEN in smooth 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