啤酒发酵工艺论文：混合发酵蚕蛹复合蛋白饲料的初步研究

中国饲料 2010 年第 18 期 科学实验研究 蚕蛹含异味物质， 添加在蛋白质饲料中会影 响其适口性， 从而降低动物的采食量。 沈若荃等 （1987）研究得出，蚕蛹中异味主要来自黄烃类化 合物。Chang（1967）报道蚕蛹中的一些羰基化合物 会产生异味。 本试验用混合发酵法发酵蚕蛹复合 蛋白饲料，旨在去除蚕蛹的异味、豆粕中抗营养因 子和花生饼中的黄曲霉毒素， 以期获得具有良好 功能与营养特性的复合蛋白质饲料， 更加有利于 畜禽吸收利用。 1 材料与方法 1.1 试验材料 发酵原料：豆粕（东莞中谷油脂 有限公司）、 花生饼 （广东农科院作物所花生油 厂）、蚕蛹（广东省翁源县信达茧丝有限公司）。 发酵基质∶糖蜜，水；糖蜜的添加量为 1 %，料 水比 1∶1，初始 pH值 6。 发酵菌种： 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） X1、X2、X3、X4、 啤酒酵母菌 （Beer saccharomycete） Y、乳酸杆菌（Lactobacillus）Z 均为广东省农科院 农业生物技术研究所筛选菌种；其中 X4为经航空 诱变技术筛选出的高产蛋白酶菌株。 1.2 试验方法 1.2.1 培养基配制 枯草芽孢杆菌保存及液体种 子培养均采用 LB 培养基； 啤酒酵母保存及液体 种子培养均采用麦芽汁培养基； 乳酸菌保存及 液体种子培养基配方：胰蛋白胨 2 g，NaCl 5 g，葡 萄糖 2 g，KH2PO4 3 g，K2HPO4 3 g，MgCl2 0.2 g， CaSO4 0.05 g，淀粉 2 g，蒸馏水 1 L。 1.2.2 二级菌种培养方法 枯草芽孢杆菌和酵母 菌：分别从斜面培养基上挑取一环菌苔接入 100 mL 各菌种的液体种子培养基中， 在 250 mL 三角瓶 中 35 ℃，170 r/min 摇动培养 24 h （一级菌种）， 分别取 1 mL 一级菌种接入 100 mL 各菌种的 混合发酵蚕蛹复合蛋白饲料的初步研究 广东省农业科学院农业生物技术研究所 叶明强 邝哲师 赵祥杰 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 廖森泰 罗国庆 华 南 农 业 大 学 动 物 科 学 学 院 王希娥 [摘要] 本试验采用了四株枯草芽孢杆菌 X1、X2、X3、X4、啤酒酵母菌 Y 和乳酸杆菌 Z 对豆粕、花生饼和蚕蛹复合 蛋白饲料进行发酵，旨在提高蚕蛹在饲料中的利用率。 综合分析试验结果得出：X1、X4、Y、Z 的组合效果最佳，其接种 量分别为 1 %、2 %、2 %、4 %；豆粕∶花生饼∶蚕蛹的最佳配比为 6∶3∶1；饲料粒度 40 目，温度为 35 ℃，料水比为 1∶1，初 始 pH 为 6，糖蜜添加 1 %为最佳发酵基本条件。 [关键词] 混合发酵；蚕蛹；发酵工艺 [中图分类号] S816.6 [文献标识码] A [文章编号] 1004-3314（2010）18-0010-03 [Abstract] For improving the utilization of silkworm pupa in feed industry，the mixed fermentation condition of com- pound protein feed of soybean，peanut and silkworm pupas by Bacillus subtilis X1，X2，X3，X4，Beer saccharomycete Y and Lactobacillus Z was studied.The results showed that the best combination was X1，X4，Y，Z and the optimal quantity was 1 %，2 %，2 %，4 % respectively.The proportion of soybean，peanut and silkworm pupas was 6 ∶3 ∶1，feed brokenness of powder 40 mesh，temperature of 35 ℃，material to water ratio of 1∶1，initial pH value of 6 and molasses addition of 1 % were the optimal fermentation condition. [Key words] mixed fermention；silkworm pupas；fermented processing 基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金；粤港关 键领域重点突破项目（2006A25001002）；广东省科技 农业攻关项目（2007A0201000043） 10 中国饲料2010 年第 18 期 液体种子培养基中， 在 250 mL 三角瓶中，35 ℃， 170 r/min 摇动培养 20 h，得二级菌种（发酵用菌 种）。 乳酸菌： 从斜面培养基上挑取一环菌苔接入 100 mL液体种子培养基中， 在 250 mL 三角瓶中 于 30 ～ 35 ℃下静止培养 40 ～ 48 h （一级菌种）， 再取 1 mL 一级菌种接入 100 mL 液体种子培养 基中，在 250 mL 三角瓶中于 30 ～ 35 ℃下静止培 养 48 h，得二级菌种（发酵用菌种）。 1.2.3 发酵工艺 见图 1。 1.2.4 测定方法 黄曲霉毒素 B1（AFB1）的测定： 根据试剂盒操作进行。 脱毒率计算公式如 下： 脱毒率=（原料中 AFB1 含量-发酵后样品中 AFB1的含量）/原料中 AFB1的含量×100 %； 水溶蛋白和中小分子蛋白含量的测定参照大 豆肽水溶蛋白法（李小东等，2004）。 2 结果与分析 2.1 菌株组合的筛选 将枯草芽孢杆菌 X1、X2、 X3、X4随机分组与啤酒酵母菌 Y 和乳酸杆菌 Z 进 行组合，共 15 个处理组，以发酵后的水溶蛋白含 量为第一选择指标， 蚕蛹异味和脱毒率为辅助参 考指标，其筛选结果见 1。 由表 1 可以看出，经 过不同时间的发酵， 水溶蛋白随发酵时间的延长 而提高， 其中， 组合 X1X4YZ 提高幅度最大，72 h 时提高 5.70 倍，96 h 时提高 5.98 倍；脱毒率则是 X1X4YZ和 X1X3X4YZ 组合最高，分别达 20.70 %和 21.85 % ；X1X3YZ、X1X4YZ、X3X4YZ、X1X2X3YZ 和 X1X2X4YZ 五个组合的异味消除效果最好，综合评 价，X1X4YZ 组合效果最佳，72 h 作为发酵终止时 间。 2.2 发酵工艺的初步优化研究 2.2.1 各种菌种接种量及原料配比的选择 为了 确定四个株菌的最适接种量和原料比例， 本研究 设计了四水平五因素正交试验， 即枯草芽孢杆菌 X1、X4 以添加 0.5 %、1.0 %、1.5 %、2.0 %四个水 平，啤酒酵母菌 Y、乳酸杆菌 Z 以添加 1 %、2 %、 3 %、4 %四个水平，豆粕∶花生饼∶蚕蛹比例为 1∶1∶ 1、2∶2∶1、3∶1∶1、6∶3∶1 四个水平的正交试验设计，共 16个处理（见表 2）。 从表 2可以看出， 理论最佳接种量为枯草芽 孢杆菌 X1、X4分别为 1 %、2 %，啤酒酵母菌 Y 为 2 %，乳酸杆菌 Z为 4 %，豆粕∶花生饼∶蚕蛹为 6∶3∶ 1。 从极差分析来看，原料配比和各菌种对发酵效 果的影响程度为乳酸杆菌 Z > 原料比例 >啤酒酵 母菌 Y >枯草芽孢杆菌 X1 >枯草芽孢杆菌 X4。 由 于 16个处理中未出现最佳组合，所以使用最佳接 种量和原料配比再次发酵， 结果测定水溶蛋白含 量为40.12 %，高于其他试验组。 2.2.2 发酵条件选择 由表 3可以看出， 对于水 溶蛋白而言，最佳条件为：饲料粒度 40目，温度为 30 ℃， 料水比为 1∶1， 最初 pH 值为 6， 糖蜜为 1 %；对发酵效果的影响条件重要性为料水比>糖 蜜> pH >温度>饲料粒度；而对于中小分子蛋白而 言，最佳条件为：饲料粒度 40目，温度 30 ℃，料水 比 1∶0.8，最初 pH 值为 5，糖蜜 1 %；对发酵效果 的影响条件重要性为糖蜜>料水比>温度> pH > 粒度。 两者的增加趋势虽然一致， 但最佳条件并 不完全相同， 考虑到大批量发酵的条件与实验室 条件的差别，故将料水比取 1∶1，pH 值为 6 为选择 组合。因在所设计的试验中并未出现最佳组合，故 将条件确定为 40 目、35 ℃、 糖蜜1 %为最佳发酵 工艺条件进行再次发酵， 测得水溶蛋白含量为 菌种筛选 斜面培养 一级培养 二级培养 发酵原料粉碎 配料计量 底物混合 灭菌处理 底物接种 发酵 60 ℃烘干制样 表 1 菌株组合筛选试验结果 组别 菌种组合 水溶蛋白/% 异味 脱毒率/% 24 h 48 h 72 h 96 h 1 X1YZ 4.86 6.32 18.75 38.62 ××× 3.03 2 X2YZ 4.59 6.60 35.96 37.69 ×× 13.62 3 X3YZ 4.84 5.92 32.96 36.89 × 11.38 4 X4YZ 4.81 6.24 36.42 40.84 ×× 8.60 5 X1X2YZ 4.22 7.07 36.80 39.97 ×× 0.19 6 X1X3YZ 5.15 6.95 39.80 40.93 0.18 7 X1X4YZ 4.98 6.68 40.18 42.17 20.70 8 X2X3YZ 4.53 5.94 30.06 39.39 ×× -0.57 9 X2X4YZ 4.87 6.68 8.41 40.57 ×××× 0.06 10 X3X4YZ 4.79 6.19 27.46 40.70 0.49 11 X1X2X3YZ 4.50 7.96 36.05 40.60 1.36 12 X1X2X4YZ 4.64 5.87 23.00 40.52 0.62 13 X1X3X4YZ 4.80 6.78 10.84 39.67 ×× 21.85 14 X2X3X4YZ 4.59 6.57 7.15 36.60 ×××× -1.94 15 X1X2X3X4YZ 4.42 4.60 27.02 36.72 ××× 0.36 注：混合发酵原料 （豆粕 ∶花生饼 ∶蚕蛹=2∶2∶1）水溶蛋白含量为 7.05 %；异味程度用“×”表示 ，空 白表示无异味。 图 1 发酵工艺图 11 中国饲料 2010 年第 18 期 41.23 %， 中小分子蛋白同步提高至 26.70 %，与 目标结果相符。 3 讨论 3.1 菌株组合对发酵效果的影响 多菌种混合 发酵是利用各菌种之间互惠、偏利生等关系，进行 协同发酵（徐姗楠和邱宏端，2002），以达到一次发 酵多方效果的目的。在本试验发酵的整个过程中， 三个菌种因其生长特性不同在前中后期各自发挥 作用。 枯草杆菌类属好氧菌，所以在发酵的初期， 可以进行生长繁殖，产生丰富的酶类；随后，在氧 气减少的中期时， 发酵型的兼性好氧酵母菌可以 进行生长繁殖， 酵母菌通过将糖类转化成为 CO2 和乙醇来获取能量，得到菌体蛋白质的同时，分泌 的一些产物可以促进后期乳酸菌的生长繁殖，乳 酸菌可以使大豆寡糖、 非淀粉多糖等糖类抗营养 因子的活性失活，生成乳酸等有益产物（潘淑媛和 陈必芳，1999）。与以往单一原料发酵相比，三种菌 混合发酵蚕蛹复合蛋白饲料效果显著。 3.2 菌种接种量对发酵效果的影响 发酵菌种 的接种量过小， 将会导致菌体生长缓慢， 发酵迟 缓；接种量过大，则会因菌体生长过快而导致营养 和氧气缺乏，从而影响产物的生成。其原因为菌种 较多且接种量大，所需要的营养物质也增多，但培 养基中的营养物质有限， 当生长到一定程度后就 不能继续满足微生物的正常生长， 复合菌种之间 不再是协同作用，而变成相互竞争营养源，使生长 繁殖受到阻碍。 从本研究可以看出， 接种量对发酵产物水溶 蛋白的影响显著，当总接种量为 10 %左右时效果 最好。 同时获得了筛选出最优的接种量为枯草芽 孢杆菌 X1、X4分别为 1 %、2 %，啤酒酵母菌 Y 为 2 %，乳酸杆菌 Z为 4 %。 表 2 接种量及原料比选择的正交试验结果 2 0.5 1 2 2 221 6.33 26.70 × 3 0.5 1.5 3 3 311 6.23 25.99 4 0.5 2 4 4 631 10.79 39.91 5 1 0.5 2 3 631 6.13 36.06 6 1 1 1 4 311 6.58 34.95 7 1 1.5 4 1 221 6.73 30.31 ×× 8 1 2 3 2 111 20.25 30.94 ×× 9 1.5 0.5 3 4 221 8.11 31.73 ×× 10 1.5 1 4 3 111 11.98 29.93 ×× 11 1.5 1.5 1 2 631 6.96 35.56 12 1.5 2 2 1 311 7.06 32.94 13 2 0.5 4 2 311 6.44 31.54 × 14 2 1 3 1 631 7.41 30.08 ×× 15 2 1.5 2 4 111 18.12 39.17 均值 1 29.39 31.07 31.65 29.57 31.25 均值 2 33.07 30.42 33.72 31.19 29.97 极差 3.68 3.32 4.033 6.87 5.44 编号 A（X1） B（X4） C（Y） D（Z） E（原料比例） 48 h 水溶蛋白/% 72 h 水溶蛋白/% 异味 1 0.5 0.5 1 1 111 6.64 24.94 ×× 最优组合 A2B4C2D4E4 均值 3 32.54 32.76 29.69 30.78 31.36 均值 4 32.98 33.73 32.92 36.44 35.40 16 2 2 1 3 221 16.70 31.13 × 72 h 水溶蛋白/% 注：原料比例指的为豆粕∶花生饼∶蚕蛹；异味程度用“×”表示，空白表示无异味。 表 3 各种发酵条件选择的正交试验结果 编号 饲料粒度 温度/℃ 料水比 初始 pH 糖蜜/% 水溶蛋白/% 中小分子蛋白/% 1 未粉碎 30 1∶0.6 5 4 15.36 19.31 2 未粉碎 35 1∶0.8 6 3 24.76 17.22 3 未粉碎 40 1∶1 7 2 34.15 18.35 4 未粉碎 45 1∶1.2 8 1 28.00 15.97 5 20 目 30 1∶0.8 7 1 40.08 25.21 6 20 目 35 1∶0.6 8 2 20.41 13.50 7 20 目 40 1∶1.2 5 3 21.93 14.04 8 20 目 45 1∶1 6 4 35.15 18.36 9 40 目 30 1∶1 8 3 34.2 18.74 10 40 目 35 1∶1.2 7 4 30.07 17.10 11 40 目 40 1∶0.6 6 1 36.24 18.76 12 40 目 45 1∶0.8 5 2 36.31 19.52 13 60 目 30 1∶1.2 6 2 24.46 19.59 14 60 目 35 1∶1 5 1 39.90 25.09 15 60 目 40 1∶0.8 8 4 35.01 19.49 16 60 目 45 1∶0.6 7 3 8.29 8.32 水溶蛋白/% 均值 1 25.57 32.39 20.09 25.47 28.90 均值 2 29.39 28.78 31.08 34.03 22.30 均值 3 31.26 31.98 35.85 28.15 29.74 均值 4 30.77 23.98 29.76 29.40 36.07 极差 5.69 8.41 15.76 8.42 13.78 中小分子蛋白/% 均值 1 17.71 20.71 14.97 19.49 18.56 均值 2 17.78 18.22 20.36 18.48 14.58 均值 3 18.53 17.22 20.13 17.25 17.74 均值 4 18.12 15.54 16.39 16.92 21.26 极差 0.81 5.17 5.39 2.57 6.65 （下转第 23页） 12 中国饲料2010 年第 18 期 在日粮中添加酶、益生素、合生元、酸化剂+益生 素等来提高仔猪营养物质的消化率， 改善胃肠道 的微生物区系，从而有效降低仔猪腹泻。 此外，纤 维日粮无论在促进仔猪肠道发育， 还是在改善胃 肠道的微生物区系都有着至关重要的营养作用， 而且纤维的饲料来源广泛，价格低廉，有着巨大的 应用前景。 但是粗纤维是否可以在大肠内产生寡 聚糖，在理论上存在很大的可能性，但还没有试验 报道支持此观点， 若是粗纤维可被大肠内的微生 物降解产生寡糖，其饲料利用价值极高。 因此，值 得广大的畜牧工作者深入研究。 参考文献 [1] 陈代文，张克英，王万祥，等.酸化剂、益生素和寡糖对断奶仔猪粪中微 生物菌群和免疫功能的影响及其互作效应研究[J].动物营养学报，2006，18 （3）：172 ～ 178. 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