干细胞论文：脐带血间充质干细胞研究中的若干问题

实用肝脏病杂志2010年 12月第 13卷第 6期 J Clin Hepatol，December 2010.Vol.13 No.6·· ·· ·· *基金项目：扬州市科委三项基金（yz2007049） 作者单位：225001 江苏省 扬州大学医学院附属苏北医院（李 翠）；扬州市苏北人民医院消化内科（王 ） 第一作者：李翠 28岁，硕士研究生 通讯作者：王 ，E-mail:wangsuyd@sina.com. ·综述· 1988 年 Broxmeyer 等首先以实验证明脐带血（human umbilical cord blood，HUCB）中富含造血干细胞（hematopoi－ etic stem cells，HSCs）。同年，法国 Gluckman等[1]亦在巴黎圣 路易斯医院第 1次利用脐带血成功治疗了一名患有 fanconi 贫血症的儿童。自此以后人们对于一直被当成废弃物丢掉的 胎盘和脐带血有了全新的和认识。 随着脐血造血干细胞的广泛应用，脐带血干细胞作为一 种易获得的细胞逐渐受到人们的重视。同时各国学者进行了 大量基础性研究发现，脐带血不仅含有相当数量的造血干细 胞而且还含有丰富的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs），同骨髓源性 MSCs相似，脐带血间充质干细胞 （HUCB-MSCs）作为一种中胚层发育的早期细胞也具有自我 复制及多向分化潜能，并在体外特定的诱导条件下，可分化 为肌细胞[2]、成骨细胞[3，4]、脂肪细胞[5]、神经细胞[6]、肝细胞[7]和 心肌细胞[8]等多种细胞。因此 HUCB-MSCs也日渐被人们重 视，利用其多项分化潜能，在组织工程、细胞因子替代治疗， 以及器官移植等方面的应用研究已成为热点。 一、HUCB- MSCs的分离、培养及生物学特性 （一）MSCs的分离 分离方法目前有以下几种：①密度 梯度离心法：此方法最常用，先是用淋巴细胞分离液从脐血 中分离出单个核细胞，再依据 MSCs在体外培养中贴壁生长 的特性，用贴壁筛选法，将其从造血系统细胞中分离出来。② 流式细胞仪分离法：根据间充质干细胞大小不同或细胞表面 的一些特殊标记 CD44、CD29和 CD105等，采用流式细胞仪对其 进行分选；③免疫磁珠分离法：原理是使用表面覆有特异性 抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再用永久磁铁吸引出间充 质干细胞；④羟乙基淀粉沉淀法：此方法是将医用 HES与脐 带血按一定比例混合，静止沉淀一定时间，取上清液离心后 再根据其贴壁选择性，分离出 MSCs；⑤沉淀法与离心法结 合：是将脐带血用 HES沉淀后，再重复密度梯度离心法的操 作来获取 MSCs。除上述方法外，也有学者[9]利用单细胞克隆 的方法获得纯 MSCs的细胞株，但该方法不便于大量获得 MSCs。 （二）MSCs的培养 对于 MSCs的培养，目前还没有统 一的。所采用的培养基大致有以下几种：IMDM 培养 基，LG-DMEM 培养基，DMEM+F12 培养基以及 Mesencult TM培养基；所应用的血清浓度也有不同的报道：Lee OK[10] 所用浓度为 20%；程范军[11]等则将 2%与 10%血清浓度做对 比得出的结论是，采用低浓度血清培养体系，更有利于 MSCs的倍增和增值维持；而对于 MSCs种植密度的选择也 没有统一的认识。但多数实验研究认为，原代培养的脐带血 MSCs多在培养 24～48h后出现贴壁，1周左右呈梭形，并成 克隆性生长，4～5周可达 80%以上的融合。起初培养的干细 胞中可见多核，形态扁平的破骨样细胞混杂，一般传代至第 3代时即可获得纯度较高且形态均一的长梭形的间充质干 细胞。 （三）MSCs的生物学特性 通过流式细胞仪检测结果显 示，脐血 MSCs均一稳定地表达间充质细胞相关的抗原标 记：CD29、CD44、CD95、CD105，而不表达与造血有关的表面抗原 CD14、CD34、CD40、CD45、HLA-DR。但由于缺少特异性表面标志 物，目前还没有直接的方法可鉴定得到 MSCs。 二、HUCB- MSCs的应用研究 脐带血间充质干细胞的可获得性、可扩增性及可多向分 化性为我们展示了良好的研究和应用前景，故可作为一种新 的细胞来源用于细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程等应 用研究 （一）MSCs移植的研究 1．治疗血液性疾病 许多研究发现 MSCs通过细胞间接触、分泌各种造血因 子及生成骨髓基质而有利于造血干细胞的体外扩增、造血干 细胞移植后的归巢及植入、可缩短移植后骨髓造血功能恢复 的时间[12～15]，并在许多动物实验和临床治疗中得到证实[16，17]； 另外，间充质干细胞还可通过直接的细胞接触、分泌细胞因 子、诱导嵌合体形成、诱导免疫耐受、对机体免疫具有负调控 脐带血间充质干细胞研究中的若干问 * 李 翠 王 【摘要】 随着脐血造血干细胞研究的不断深入，人们对脐血中存在的另一种干细胞—间充质干细胞（mes－ enchymal stem cells）的生物学特性及分化能力有了进一步的认识，并且作了大量的研究。近年来在脐带血间充质干 细胞的分离培养，以及其作为一种新的细胞来源用于细胞替代治疗、基因治疗以及组织工程等方面，有了更进一步 的研究和发现，同时也存在很多尚未解决的问题。本文就此几点进行综述。 【关键词】 间充质干细胞；基因治疗；组织工程 doi:10.3969/j.issn.1672-5069.2010.06.028 470 ··实用肝脏病杂志2010年 12月第 13卷第 6期 J Clin Hepatol，December 2010.Vol.13 No.6 ·· ·· 作用[18]，从而为临床治疗异基因造血干细胞后 GVHD的发生 开辟了一条新途径[19～21]。 2.修复损伤神经 目前许多学者正尝试将 MSCs作为种子细胞用于神经 退行性疾病[22]，神经免疫性疾病，神经损伤性疾病[23]以及脑血 管疾病的治疗。廖文斌等[24]通过建立大鼠脑出血和脑缺血模 型，将 MSCs注射到局部后，与对照组对比发现，MSCs 可以 有效促进脑缺血和脑出血大鼠的神经功能恢复，并有免疫抑 制和抗炎作用。 3.修复损伤或衰老的组织器官 近几年，干细胞移植治疗中晚期肝病成了一个热点话 题。目前对 MSCs向肝细胞的诱导分化多数还是采用诱导因 子进行体外诱导。业已证明利用 FGF4和 HGF可将 UCB- MSCs诱导为具有肝细胞形态和表型的细胞，并有可能通过 将来的进一步研究，使其为肝细胞工程、生物人工肝提供种 子细胞，以期用来治疗各种急、慢性肝功能衰竭和肝脏代谢 性疾病。此外，柯红燕等[25]将 MSCs移植到心肌梗塞模型的大 鼠心肌内，发现 MSCs在大鼠体内能够存活并能分化为心肌 样细胞，但 MSCs分化为心肌细胞的机制以及能否在体内转 化为有功能的心肌细胞还有待于进一步的研究。另外，MSCs 将来亦可有望用于治疗糖尿病 [26]，骨及软骨组织病 [28，29]等组 织器官的修复和再生。 （二）组织工程或基因治疗中应用 组织工程或基因治 疗是近年来医学领域乃至生命科学领域研究的热点和前沿， 为人类征服许多疾病提供了新的途径和希望，而这其中一个 关键问题就是种子细胞或转基因载体细胞的选择。所以 UCB-MSCs因其高度的自我更新和多向分化潜能在这些领 域展现了广阔的应用前景。Turgeman G等[30]取骨质疏松患者 的骨髓 MSC行体外培养扩增并转染 BMP22，将转染后 MSCs 细胞移植入体内，发现可以异位生成骨和软骨，并能修复鼠 桡骨骨损伤。陈晓梨等[31]将逆转录病毒（pLEGFP2N1）转染的 人凝血因子Ⅸ（hFⅨ）基因转入 MSCs 中，与对照组对比发 现，转染 hFⅨ后的 MSCs可检测到有凝血活性的 hFⅨ，这为 MSCs作为生产 FⅨ的理想靶细胞提供了理论基础，又由于 MSCs的低免疫原性，使其在作为基因治疗的载体细胞治疗 血友病 B上展现了极大的优势。此外，MSCs作为新型的基因 治疗的靶细胞，在神经系统疾病和循环系统疾病等方面亦展 现了可喜的应用前景。 （三）MSCs免疫调节活性的应用 MSCs本身免疫原性 低[32]，表达中等水平的 MHC-Ⅰ类分子，不表达 MHC-Ⅱ类分 子，可以通过分泌可溶性细胞因子诱导 T细胞活化受阻[33]， 改变 T细胞和 DC的表型，以及在体外可以明显抑制 CD4＋、 CD8＋T细胞增殖[34]，所以 MSCs以其上述特性，向我们展现了 其在抑制异原性排斥反应和 GVHD，延长移植物存活时间等 方面的潜力和应用前景，并引起许多研究者极大的兴趣。 BALL 等最近报道 14 位患儿行亲属不全相合的 CD34＋细胞 联合 MSCs移植，结果所有患儿都获得快速稳定的造血植 入，并没有感染增加趋势，而历史对照中植入失败发生率为 15%[35]。Veronika等[36]在用 MSCs治疗糖尿病的研究时，将异 基因骨髓和 MSCs联合输注到亚致死剂量照射的Ⅰ型糖尿 病鼠模型内，血糖和胰岛素水平很快恢复正常，同时在老鼠 体内没有发现供者来源的 β细胞，作者分析可能是 MSCs的 免疫负调节作用，抑制了 β细胞特异性 T淋巴细胞活性而逆 转了 β细胞的功能。 三、HUCB- MSCs研究中存在的问题与展望 脐血源性 MSCs与骨髓源性 MSCs相比，具有获得方便， 无创伤性，污染机率低，免疫源性更原始等特点。尽管近年来 对脐带血 MSCs的研究取得了很大进展，但仍然存在许多问 题尚待解决，还有待于进一步的研究和改善。 （一）分离、扩增和纯化问题 对于脐血中存在 MSCs已 经毫无争议，越来越多的研究已经证实。但由于脐血中 MSCs 的数量少，生长周期相对缓慢，原代细胞培养时间较长，成为 制约 MSCs应用的障碍，所以怎样从脐血分离出更多数量的 MSCs，以及分离后以怎样的条件培养可以更好的扩增和纯 化，以及怎样更好的保持 MSCs的可扩增性，有待于进一步 的研究。 首先在分离方法上，密度梯度离心法、沉淀法虽然得到 的是异质细胞群，但成分复杂，纯度不高，多数情况有破骨样 细胞的存在，很难得到较为均匀的 MSCs，这也成为了制约 MSCs应用的障碍。而流式细胞仪法、免疫磁珠法虽然可获得 较为纯化的间充质干细胞，但是分离过程对细胞活性影响较 大，而且实验条件要求较高，花费高，所需的标本量大，不适 于一般。 在 MSCs的培养扩增和纯化方面，到目前为止没有统一 的认识，例如培养基的选择、PH值、血清浓度和种植密度，以 及是否添加生长因子及因子的选择和用量等，还没有一个较 为一致的方案。例如：Both等[37]研究发现，选用 α-MEM培养 基、低密度培养 MSCs优于 DMEM培养基、高密度下培养，并 发现添加地塞米松能够促进细胞的快速生长；而 Yang等[38] 采用 α-MEM培养基加 10％胎牛血清的方法，仅有 23％的标 本成功培养出 MSCs；Liu等[39]以 l×l07cells/cm2接种密度在含 有 20％FBS的 IMDM 培养基中原代培养脐带血来源的问充 质干细胞，在 144份脐带血中有 108份成功地培养出间充质 千细胞，占总数的 75％。这些细节问题对于 MSCs的培养扩 增及扩增能力的维持有较大的影响。同时，MSCs如何能够维 持其自我更新和扩增能力，主要分泌何种细胞因子，以及采 用什么样的途径进行细胞间的信号转导，这些机制尚还没有 突破性研究。 所以目前很多实验正致力于这些方面的研究，以期为脐 血 MSCs体外分离、纯化、扩增探索一条更为有效、快速和可 行的途径。 （二）MSCs的鉴定问题 目前，对 MSCs鉴定的方法都 是通过其在体外培养时发生的一系列形态学变化以及在培 养过程中出现的分化表型，然后判断是否为 MSCs。①由于 MSCs的形态多样化，同时还伴有破骨样和树突状细胞的混 杂，所以依据形态学鉴定存在一些弊端；②同时由于 MSCs 缺少特异性的表面表记物，对其鉴定，也只是通过 MSCs表 达 CD29、CD44、CD90、CD95、SH2 和 SH3 而不表达 CD14、CD34、 CD40、CD45和 HLA-DR，由此逆推得知是否为 MSCs；③有实 验研究利用基因表达系列分析技术，检测了由一个间充质干 471 实用肝脏病杂志2010年 12月第 13卷第 6期 J Clin Hepatol，December 2010.Vol.13 No.6·· ·· ·· 细胞形成克隆的整体基因表达情况，在分子水平揭示了 MSCs具有异质性和多样性；但同时 MSCs的这种特性，在其 鉴定方面也增加了一定的难度。所以对于 MSCs的鉴定，目 前还没有直接的方法，有待于进一步的研究探讨。 （三）MSCs在细胞治疗、基因治疗和再生医学应用中存 在的问题 MSCs的自我复制和多向分化潜能，使其在未来 的细胞治疗，基因治疗和再生医学中，具有很好的临床应用 价值。目前在 MSCs应用中，很多问题还需要进一步研究、解 决。如：①是否可以应用多分脐带血的 MSCs进行移植，以解 决 MSCs细胞数目有限的问题；②采用怎样的方式将 MSCs 移植到受试者体内，才能有效提高 MSCs的利用率；③由于 不是所用注入的干细胞具有一致的归巢能力并都可以到达 目的器官或组织，所以清楚细胞归巢机制，才可以提高 MSCs 归巢能力和利用率；④如何保证植入体内的 MSCs定向分化 为实体器官的特异细胞，减少其向其他非目的细胞的分化； 例如：在肿瘤起源的学说中有人提出“肿瘤细胞可来源于异 常分化的干细胞”[41]，肿瘤细胞和干细胞在自我更新的调控 上存在十分类似的分子机制[42]。最近有报道[43]，在应用胚胎干 细胞治疗大鼠帕金森氏病时，多个大鼠死于由干细胞形成的 肿瘤，提示干细胞和肿瘤细胞有着密切关系。⑤如何保证干 细胞分化而来的细胞具有目的细胞的特性和功能，如何与实 体细胞融合，以及 MSCs定向分化为目的细胞的机制是什 么；⑥目的基因植入 MSCs后，如何保持其生存活性，以及基 因治疗所面临的靶向性、转染效率、持续表达和可控性等普 遍性问题。 以上各方面的问题，还有待于更深入的研究，但随着 MSCs在分离纯化技术、体外扩增、分化方向的调控等方面问 题的解决，相信在不久的将来，MSCs必定在细胞移植、组织 工程、基因治疗等方面带给人类一份惊喜。 参考文献 [1] GLUKMAN E，BROXMEYER HA，AUERBACH AD，et al. 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