小鼠胚胎干细胞的培养

细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(3): 448 http://www.cjcb.org 小鼠胚胎干细胞的培养 完全培养基: 高糖DMEM (GIBCO 12430); 15% 胎牛血清(BIOCHROM S0615); 0.1 mmol/L非必需氨 基酸(GIBCO 11140-050); 2 mmol/L谷氨酰胺(GIBCO 25030); 0.1 mmol/L β-巯基乙醇(GIBCO 21985); 1 000 U/ml白血病抑制因子(CHEMICON ESG1107) 冻存液: 90%胎牛血清或完全培养液; 10%二甲 基亚砜(DMSO, Sigma D2650) 一 小鼠胚胎干细胞复苏 1. 操作前把培养液在 37 ℃水浴中温热。 2. 从液氮中取出一支冻存管的小鼠胚胎干细 胞, 放入 37 ℃水浴中晃动, 直到只剩下小冰晶。 3. 吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量完全培 养液的 15 ml离心管中, 1 000 r/min离心 5 min。 4. 吸弃上清液, 加 4~6 ml培养液, 吹打悬浮。 5. 重复吹打, 制成单细胞悬液, 尽量避免气泡。 6. 转移到1个已经铺好饲养层的25 cm2培养瓶 中培养。 7. 每天换液。 要点: 复苏过程中“速融”是关键。由于在 常温下DMSO对细胞有毒性, 应尽量缩短复苏的时 间。离心去掉 D M S O。 二 小鼠胚胎干细胞传代 1. 一般在复苏后第 2~3天传代, 视克隆的大小 和密度而定。 2. 吸弃废液。 3. 用 PBS (不含钙镁)轻轻冲洗两遍。 4. 加 0.5 ~1.0 ml的胰蛋白酶(0.25%)-EDTA (0.02%)溶液至培养瓶, 左右晃动, 使胰酶覆盖整个 瓶底, 消化细胞。 特约综述专介绍 5. 在显微镜下观察, 直到细胞层全部脱落(一般 需要 1~2 min)。 6. 加适量(4~5 ml)完全培养液终止消化。 7. 多次轻轻吹打细胞, 制成单细胞悬液。 8. 细胞悬液转移到15 ml离心管, 1 000 r/min离 心 5 min。 9. 吸弃上清液, 加足量的培养液, 吹打混匀, 细 胞悬液分装到各铺好饲养层的 25 cm2培养瓶中, 一 个培养瓶加 5~6 ml ES培养液。 10. 放入培养箱中。 11. 每天换液。 要点: 传代比例 1∶4~1∶10, 即长满一个培养 瓶的细胞可以传代至 4~10个同样大小的培养瓶中。 细胞离心后重悬液必须吹打成单细胞悬液。 三 小鼠胚胎干细胞冻存 1. 按传代的方法把细胞消化下来, 制成细胞悬液。 2. 1 000 r/min离心 5 min。 3. 弃上清液, 逐滴加已经预冷的冻存液并不断 摇动混匀。 4. 分装到冻存管中, 标记。 5. 将冻存管置程序降温盒, −80 ℃过夜, 转入液氮。 要点: 冻存液的配方是 90%完全培养液和 10% 的DMSO, 如果细胞株比较珍贵需要提高复苏存活率 的话可以增加冻存液中血清的比值, 甚至可以用血清 代替完全培养液。由于在常温下DMSO对细胞有毒 性, 应将配好的冻存液在冰上预冷。快速分装到各 个冻存管以后马上置程序降温盒, −80 ℃过夜。 (中科院上海生命科学研究院生化细胞所干细 胞技术平台　　徐　兰 刘敏英)