血小板血型系统

血小板血型系统及检测技术华中科技大学同济医学院附属协和医院王晓蓓教学内容血小板血型抗原及其抗体血小板血型检测技术血小板血型的临床应用适合型血小板输注教学目的重点掌握：血小板输注无效掌握：血小板血型检测技术熟悉：血小板血型抗原及其抗体血小板血型的临床应用了解：适合型血小板输注一、血小板血型抗原及其抗体（一）血小板血型抗原定义:指用同种免疫抗体检测出的血小板面抗原分类：血小板相关抗原血小板特异性抗原1.血小板相关抗原(platelet-associatedantigen)定义：血小板表面存在的与其他细胞或组织共有的抗原 分类：红细胞血型系统相关抗原(ABO等） 组织相容性抗原（HLA）血小板上的红细胞血型抗原 存在ABO、Lewis、I和P抗原 缺失Rh、Duffy、Kell、Kidd和Lutheran系统的抗原血小板HLA系统血型抗原　Chromosome6DPDQDRBCAClassIIClassI 存在HLA-A和B位点的抗原 HLA-C位点的抗原 未发现HLA-DP、DQ和DR等位点抗原。但经细胞因子刺激，可产生HLA-DR抗原2.血小板特异性抗原即人类血小板抗原（humanplateletantigen，HPA）血小板特有的，其他组织细胞没有表现血小板独特的遗传多态性均存在于血小板膜糖蛋白（GP）上HPA的命名1990年国际血液学化委员会(ICSH)/国际输血协会（ISBT）血小板血清学研讨会对血小板抗原系统进行国际命名2003年国际输血协会（ISBT）和国际血栓和止血协会（ISTH）建立的血小板命名委员会（PNC）命名规定在系统前冠以HPA按发现顺序用数字编号只有在2个对偶抗原全被检测出来后，才能被称为系统，对偶抗原按其在人群中频率由高到低，用字母命名，高的为a，低的为b尚未发现对偶抗原的，给予暂时命名，在等位基因数字后加后缀w表示（二）血小板抗体产生机理：机体对血小板表面或相关抗原免疫临床分类：血循环里的游离抗体结合于血小板上的抗体(PAIgG)血型学分类：血小板同种抗体自身抗体见于：血小板输注治疗无效同种免疫血小板减少症自身免疫血小板减少症药物、病毒、细菌引起的血小板减少症血小板表面存在众多复杂抗原，因此反复大量输注血小板的患者约50%以上产生血小板同种抗体据报道HLA抗体占多数，约80%左右HPA抗体单独存在的频率较低（2%-3%）HPA抗体与HLA抗体共存（18%）左右必须首先识别并去除血清中存在的HLA抗体，才能分析血小板抗体的特异性（二）血小板抗体 鉴别有无HLA抗体存在的方法 淋巴细胞毒试验 混合淋巴细胞培养 除去血小板表面HLA抗原方法 氯喹或酸溶液在0℃处理血小板二、血小板血型检测技术 血清学检测 分子生物学检测（一）血清学技术血小板免疫荧光试验简易致敏红细胞血小板血清学试验单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验流式细胞仪检测技术微柱凝胶血小板定型试验 当HLA类抗原在血小板定型时出现强表达时，要用氯喹或酸进行预处理，去除血小板上的HLA抗原1.血小板免疫荧光试验(plateletimmunofluorescencetest,PIFT)原理用多聚甲醛（PFA）或氯喹预处理的血小板，加入异硫氰酸荧光标记的抗血小板抗体，通过流式细胞仪或荧光显微镜检测血小板抗原抗体结合情况 1978年由vondemBorne等人发明的*临床应用 同种异体抗体与血小板的反应活性检测 血小板配型方法学评价优点荧光信号只评估血小板，避免了由细胞碎片引起的非特异性反应多特异性的抗球蛋白试剂可以识别IgG、IgA和IgM抗体最可靠的方法之一缺点对反应不敏感。血小板至少要结合1000个IgG分子才能得到阳性结果2.简易致敏红细胞血小板血清学试验（SimplifiedSensitizedErythrocytePlateletSerologyAssay,SSEPA）原理将血小板抗原固定在U型孔壁上，与被检血清反应后洗净，以抗IgG（或抗IgM)指示细胞反应结果如果血小板上结合了血小板抗体，则致敏在指示细胞上的抗IgG（抗IgM）与血小板抗体结合，指示细胞向孔底移动被组织，广泛覆盖在固定的血小板单层上，为阳性结果若血小板上无抗体，则指示细胞向孔底移动不受阻，聚集在孔底中央，呈扣状，为阴性结果阳性结果阴性结果*结果图示方法直接测定法：测定血小板表面结合的血小板抗体间接测定法：测定血清内的血小板抗体交叉配血试验：选择配合的血小板供体临床应用血小板抗体鉴定血小板血型研究开展母婴血小板血型及多种血液病的研究适合性血小板输注*方法学评价简单、微量，重复性、特异性和敏感性均较理想应用范围广，可用于检测血小板抗原抗体以及交叉配合试验；可开展大量样本的检测工作及研究工作固相化的血小板及指示细胞能长期保存备用不需要特殊的仪器设备，易于推广3.单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验(Monoclonalantibody-specificimmobilizationofplateletantigensassay,MAIPA)原理在血小板上先结合人的同种抗体，然后再结合鼠抗人血小板抗体，裂解血小板后，把裂解产物移至包被的羊抗鼠IgG微孔板内，通过辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG检测人的血小板同种抗体单克隆抗体特异的血小板抗原固定试验方法学评价优点：敏感性强。可检测出被污染的抗体、微量抗原（HPA-5）、低频率抗原。缺点：在未知抗原检测时必须使用一组单克隆抗体，而又不能对所有糖蛋白具有活性如果人抗体与单克隆抗体和同一个抗原决定簇反应，就会引起假阴性结果4.改进的抗原捕获酶联免疫吸附试验(ModifiedantigencaptureELISA,MACE)原理血小板与抗体致敏，将形成的抗原-抗体复合物分别加入包被有抗GPIb、GPIIb、GPIIIa、GPIX、HLA等鼠抗人单克隆抗体的微孔内，再加入酶标羊抗人IgG底物显色，终止反应后测405nm吸光度方法学评价及应用 优点：特异性较高 缺点：非特异的物质和某些血清中的IgG结合非常牢固 应用：对于已经去除了HPA-1a的大量标本的定型常使用竞争性ELISA技术5.流式细胞仪检测技术(Flowcytometry,FCM)原理免疫荧光标记技术，抗原抗体结一激光光源激发得到特异荧光色细胞体积、结构、荧光种类及性质等多种参数分析FCM检测血小板相关抗体R1(血小板门)M1R1M1R16.微柱凝胶血小板定型试验（microcolumegeltestforplatelettyping）原理向微柱凝胶中依次加入待检血清、血小板、指示红细胞阳性结果：若待检血清中存在血小板抗体，则形成血小板-血小板抗体-抗IgG-指示红细胞四位一体的免疫复合物不能通过凝胶柱阴性结果：若待检血清无血小板抗体，则不能形成免疫复合物，指示红细胞离心后沉于柱底方法学评价方法快速、敏感、操作简单操作标准化（试剂、设备、工作程序）标本试剂用量少结果判断客观准确结果保存时间长（数天或数周）安全：减少医源性传播（二）分子生物学检测22个HPA抗原中除HPA-14bw基因外，其它所有HPA基因多态性都表现为SNP（单核苷酸多态性），因此检测SNP的方法基本上适用于HPA基因分型共同特点：以聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）为基础，所不同的只是在于PCR引物设计以及检测PCR产物的方法*方法PCR-SSP:首选，最简单常用，快速经济PCR-RFLP:繁琐，无法对HPA-4基因分型PCR-ASO:繁琐，不太容易判断结果SSCP：不适合常规HPA检查DNA序列分析法:操作复杂，成本较高（三）血清学检测与分子生物学检测的关系血清学检测简单、快速成本低主要用于血小板抗体检测和交叉试验血型抗原的血清学定型是基因分型的前提三、血清学检测与分子生物学检测的关系分子生物学检测结果准确、可靠不需要特异性抗体的血小板基因组DNA的来源：可为尿沉淀物、口腔黏膜细胞和羊水细胞主要用于血小板血型抗原分型三、血小板血型的临床应用血小板输注无效输血后紫癜新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜特发性血小板减少性紫癜（一）血小板输注无效(platelettransfusionrefractoriness,PTR)1.定义指患者在输注合适剂量的血小板后没有产生“适当的反应”，即连续两次输注足量随机供者血小板后，没有达到合适的校正血小板计数增加值（CCI），临床出血表现亦未见改善长期依靠血小板支持治疗这是临床输血中颇为棘手的问题2.原因免疫因素（17.5%）：HLA抗体、HPA抗体、ABO抗体、自身抗体、药物抗体、循环免疫复合物等非免疫因素（67.5%）：发热、败血症、脾肿大、骨髓移植、DIC、静注抗菌素等；血小板质量非免疫+免疫因素（15%）3.判定指标临床:出血趋势不减轻，或出现输血性紫癜，出血加重血小板计数较输注前不仅不增高，有时还会下降校正血小板计数增加值(correctedcountincrement,CCI)CCI=(输注后血小板计数-输注前血小板计数)×体表面积(m2)输入血小板总数（×1011／L）PTR判定标准:1小时CCI﹤7.5×109／L20-24小时CCI﹤4.5×109／L血小板回收率(percentageplateletrecovery,PPR)PPR=(输注后血小板数－输注前血小板数)×血容量(L)输入血小板总数×2/3PTR判定标准：1小时PPR﹤30%20-24小时PPR﹤20%4.预防措施选用单一供者血小板（机釆血小板）自身血小板输注去除血小板中白细胞：WBC＜5×106/L去除血小板表面抗原：用氯喹或枸橼酸解离技术去除HLA抗原紫外线照射灭活抗原提呈细胞（antigenpresentingcell,APC）功能5.处理流程首先要考虑血小板质量问题，可输注ABO同型的非库存血小板，以排除ABO系统的抗体或血小板质量因素↓若有发热、感染、DIC等导致血小板消耗增加的因素存在，积极治疗原发病，并增加输注剂量↓若有同种抗体存在，则挑选HLA、HPA相合的供者血小板，或使用激素、免疫抑制剂或静脉注射免疫球蛋白↓若病人持续输注血小板效果不佳而又找不到明确的原因，则应考虑药物性抗体的存在，停用或换用相关药物6.处理供者选择：ABO和Rh相合HLA相合HPA相合大量静脉注射免疫球蛋白（IVIG）血浆置换免疫抑制剂抗纤溶药物等PTR的病因及处理 病因 处理 免疫性因素 HLA同种抗体 输注HLA抗原配合的血小板或交叉配合试验相合的血小板 血小板特异性抗体 输注血小板特异性抗原（HPA）配合的血小板或交叉配合试验相合的血小板 自身抗体 IVIG、皮质类固醇、脾切除术 药物（如肝素） 停用诱发药物 非免疫性因素 脾肿大 治疗病因 药物（如两性霉素B） 若可能时，停用诱发药物 消耗增加 治疗病因 败血症 治疗病因（二）输血后紫癜(post-transfusionpurpura,PTP)1.定义及临床表现定义指输注全血或血小板后引起的急性、暂时性的同种免疫性血小板减少综合征临床表现在输血后1周左右突然发生皮肤瘀点、瘀斑和黏膜出血，严重者有内脏和颅内出血大多数的患者是女性，有输血或妊娠史2.病因出现血小板特异性同种抗体常见的是抗HPA-1a通常发生于HPA-1a阴性患者，欧美多见3.预防和治疗措施血小板抗体筛选血小板交叉配血试验，选择配合型的血小板供体输注免疫抑制剂血浆置换大量静脉注射免疫球蛋白（三）新生儿同种免疫性血小板减少性紫癜(neonatalalloimmunethrombocytopenicpurpura,NAITP)1.定义妊娠期间由于母婴间血小板血型不合，胎儿血小板抗原刺激母体产生血小板相关抗体，通过胎盘进入胎儿体内，导致胎儿和新生儿血小板减少常见，病死率较高，约13%内脏和中枢神经系统出血脑水肿出生时有严重而广泛的瘀点和瘀斑出生时正常，2-3天后出现血小板显著减少2.临床症状3.实验室检查血小板抗原的鉴定血小板抗体的检查治疗患者输入母体中同种抗体无不良反应性的血小板对患者进行换血治疗给新生儿静脉内注射免疫球蛋白预防随时监测母亲血清中血小板抗体效价高时可对母亲作血浆置换治疗，降低母亲血浆中抗体的含量4.治疗及预防（四）特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP)1.定义及临床表现定义：由于患者自身免疫系统失衡，体内产生针对自身血小板相关抗原的抗体，导致血小板大量破坏，引起免疫性血小板减少临床表现：出血症状，多为慢性，隐匿性女性常见血小板相关免疫球蛋白（PAIgG）：与血小板上的相关抗原结合，PAIgG升高的水平与血小板减少的程度有关血小板自身抗体可与自身和同种血小板结合，破坏血小板血小板自身抗体与巨核细胞结合，影响血小板的生成2.发病机制3.治疗血小板输注不仅没有疗效，还有可能因血小板表面各类血小板抗原的同种免疫作用，导致输血后紫癜等输血反应应用皮质激素等免疫抑制剂脾切除术大量血浆置换大剂量静脉注射免疫球蛋白长春生物碱类药物偶联单采血小板，给难治型ITP患者输注，获得较好疗效适合性血小板输注（一）影响血小板输注效果的因素与发热、感染、DIC、出血、脾肿大血小板同种抗体与输注量、病人血容量和一般情况有关（二）适合型血小板输血的措施适合型ABO、HLA、HPA同型输注适合型输注措施血小板抗体筛选血小板交叉配合试验HLA配合：血清学方法：淋巴细胞毒技术PCR技术HPA配合：血清学方法：SEPSA，微柱凝胶法等；PCR技术为了预防和减少输血小板治疗无效和输血后紫癜等同种免疫的发生，最好的对策是对患者进行血小板抗体筛选进而对含有血小板抗体的患者进行“适合性血小板输注”。*安全有效输血建立HLA、HPA已知型供者档案适合性血小板输血：做血小板抗体检查，输注交叉配型阴性的单采血小板滤除白细胞或除去白细胞活性的血小板Thankyou!!1978年由vondemBorne等人发明的****为了预防和减少输血小板治疗无效和输血后紫癜等同种免疫的发生，最好的对策是对患者进行血小板抗体筛选进而对含有血小板抗体的患者进行“适合性血小板输注”。*