泌尿外科男科实验室新技术

泌尿外科男科实验室新技术 随着基础研究的深入，与男性不育相关实验检测项目愈来愈多，内容涉及形态学、免疫学、生物化学及分子生物学等多学科领域。在这些繁冗的检测项目中究竟哪些最具诊断价值以及如何正确运用这些检测项目来进行不育症的病因学诊断，是长期困扰男性不育实验诊断临床应用的技术难题。为了进一步推动我院男科学的发展，在院领导的大力支持下，特成立男科实验室，将当今较为成熟、有良好应用价值并获得国际专家学者广泛认可的实验项目全面开展起来，具体介绍如下： 一、计算机荧光辅助精子分析（Computer-aided sperm analysis, CASA） 计算机辅助精子分析系统较人工方法具有以下优点：（1）高精确性；（2）提供精子动力学的量化数据，但如何准确、自动识别精子是精子自动分析中的难题，目前CASA主要包括灰度识别和DNA荧光识别两种技术。我院引进的清华同方计算机荧光辅助分析系统是根据DNA荧光染色分析技术可将精子分成绿色（活精子）和橙色（死精子），能更好地将精子与杂质区分开来，准确度优于灰度识别法。 二、静止性生殖道感染检测指标     精液中的泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞形态在湿片状态下是无法区分开的，它们统称为圆细胞（Round cells）。只有通过特殊检查才能将白细胞与其他类型圆细胞区别开，从而达到判断感染是否存在的目的。 精液白细胞过氧化物酶(Leukocyte Peroxidase)染色、精液白细胞群(Leukocyte subpopulations)定量和精浆弹性蛋白酶(Elastase)定量是目前用于精液感染性检测的常用指标。因前二者实验操作较繁杂，无法大批量操作，不太适合临床推广，而精浆弹性蛋白酶定量检测的是白细胞抗炎效应复合物，实验操作简单、可批量、结果准确可靠、适合临床生殖道感染的检测及抗感染疗效的评估，特别是无临床表现的生殖道感染筛查。 三、免疫性不育检测指标     目前血清抗精子抗体检测已在临床广泛开展。对于男性不育患者而言，以血清抗精子抗体作为免疫性不育辅助诊断指标并无多大临床意义，原因如下：（1）由于男性血-睾屏障的存在，血清内精子抗体的存在无法真实反映当前生殖道内精子是否存在抗体；（2）血清抗精子抗体诊断试剂盒特异性较差。目前国内外所用血清抗精子抗体诊断抗原多直接从精子内获得，它同时包含精子膜抗原和大量精子膜内抗原物质。迄今为止已发现的人类精子特有抗原物质多达几十种（但尚不清楚引发免疫性不育最具特异性的抗原成份），这些提取抗原可与正常人血清存在明显的交叉反应。尽管在制作工艺上可使试剂盒最大限度地减少这种假阳性结果，但其特异性仍存在较大疑问；（3）该项目试剂盒检测方法多采用ELISA间接法，易造成假阳性。     精子膜表面抗体（亦称精子包被抗体）是WHO推荐的用于免疫性不育的诊断指标。其优点在于：（1）检测标本为活力精子，更有临床意义；（2）可以对精子表面抗体产生部位进行定位；（3）检测过程中能保持被检测精子膜的完整性，膜内抗原不对外释放，检测更具特异性；（4）操作简单快捷。 临床上许多血清抗精子抗体检测结果呈阳性的男性，其精子包被抗体检测却并无异常。 四、前列腺分泌功能检测指标 1．精浆锌(Zinc)  WHO推荐指标。锌直接参与精子生成、成熟、激活和获能；能延缓精子膜的脂质氧化，维持胞膜结构的完整性和稳定性，从而使精子保持良好的活动力；锌是前列腺功能指标之一，与抗细菌感染有关。病原微生物感染对前列腺分泌功能有影响，可使精浆锌降低。 2．精浆柠檬酸(Citric acid)     WHO推荐指标。精浆柠檬酸来自前列腺，其作用是通过与钙离子结合，影响射精后精液液化过程。前列腺炎可导致精浆柠檬酸降低。 3．精浆酸性磷酸酶(Acid phosphatase )     WHO推荐指标。前列腺炎可引起精浆酸性磷酸酶降低，前列腺肥大或早期前列腺恶性肿瘤者其含量增高。 五、精囊分泌功能检测指标 精浆果糖(Fructose)是WHO推荐的精囊分泌功能评价指标。精囊分泌的果糖是精子能量的主要来源。精囊炎时其含量降低；不完全射精或射精过频，果糖含量亦降低；精囊缺如果糖测定为阴性。常用于梗阻性无精症患者梗阻发生部位的定位诊断。 六、附囊分泌功能检测指标 精浆中性α-葡糖苷酶(Neutral alpha-glucosidase )是WHO推荐的附囊分泌功能评价指标。中性α-葡糖苷酶较左旋肉毒碱和甘油磷酸胆碱对附睾更特异更灵敏。结合激素和睾丸其他指标，对远端输精管阻塞有较好的诊断价值。 七、精子功能评价指标     精子顶体酶 (acrosin)是受精过程中重要的蛋白水解酶，当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。 精子顶体酶是目前被国内外学者广泛研究和认可的评价指标。虽然顶体酶的作用机制现在尚未完全明了且存在一定争议，精子顶体酶活性检测也暂未列入《WHO人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》，但其在辅助生殖中的意义已得到多数学者的承认，将其作为ART助孕方式选择的评价指标之一已获得良好的应用效果。 八、精子发生评价指标 精子核蛋白组型转换（Spermatozoan Nucleoprotein Transition）在正常睾丸精子发生过程中，精子核蛋白中与DNA结合的组蛋白逐渐被鱼精蛋白所取代，这个过程称为精子核蛋白组型转换。受精前精子基因在鱼精蛋白特殊保护下紧密浓集，抑制了精子基因表达，使遗传物质保持稳定。核蛋白组型转换缺陷或异常直接影响精子受精能力和受精后原核的形成及胚胎的发育，可引起不育或胚胎早期夭折流产。 九、其他评价指标 1．精子形态学染色（Sperm morphology）     WHO推荐检测指标。是了解精子质量状况最基本的检测指标，用于不育原因及ART助孕方式的选择。WHO新的技术规范不仅要求区分精子形态正常与异常百分率，同时对畸形精子分类进行了细化，即计算多重精子缺陷指数，增加了畸形精子指数(Teratozoospermia index, TZI)和精子畸形指数(Sperm deformity index, SDI)两个新指标。有研究表明，TZI>1.6与未经治疗不育夫妇的低生育率有关，而且SDI 1.6是体外受精失败的阈值。 2．精子低渗膨胀试验（Sperm hypo-osmotic test, HOS） WHO推荐检测指标。WHO不主张将HOS作为精子功能试验予以应用，认为它是一种可供选择的检查精子存活力的补充试验方法。而部分学者认为HOS可作为精子膜功能指标之一使用。有研究结果表明：HOS与去透明带仓鼠卵母细胞试验之间有较好的符合率，对继发性不育者更有价值。目前国内外学者将HOS作为ART助孕方式选择的一个评价指标加以应用。 3．精液LDH-X同工酶 LDH-X为精子在生殖道运动提供充足能源。睾丸萎缩患者LDH-X相应降低或消失，精子发生缺陷时则无LDH-X形成。精液检查正常者也可能因LDH-X活性下降而引起不育。 测定精液LDH-X并结合激素水平测定，可作为评价生精上皮状态指标。严重少精症者，精液LDH-X活性很高，提示病人精子发生正常。而不育患者精子计数正常，精液LDH-X活性低下，则提示精子分化受到损害或抑制。 LDH-X也是评价精液质量的可靠指标。罗比等对不育男性的精子和精浆中的LDH-X活性进行了测定，表明精浆/精子中LDH-X的比值在生育组、精液常规正常不育组（Ⅰ）及精液常规不正常的不育组（Ⅱ）和少精症组依次为0.528、0.88、2.85和4.01，各不育组与生育组间均有显著性差异，不育Ⅰ和Ⅱ组精浆中的LDH-X活性大于正常男性，精子LDH-X的活性（以 mu/106 表示）则小于正常男性。表明在考虑男性不育原因时，除生精上皮的功能完整性及其他因素外，精子膜的完整程度及其损坏原因也需引起足够重视。 4．精子膜凝集素受体 精子膜凝集素受体在精子发生、成熟、获能和受精过程中有重要功能。精子膜上的特异决定簇一旦与卵细胞透明带表面精子受体相识别，将会激发顶体反应等一系列连锁过程，最终完成受精。研究表明，精子膜麦芽凝集素（WGA）受体与精子受精功能密切相关，射出精子WGA受体缺失是不育原因之一，并将此作为临床诊断不明原因不育症的一种手段。 WGA受体位置改变及数量减少可引起不育。精子WGA受体缺失可有两种类型：Ⅰ型是精子膜WGA受体缺失伴膜结合精子抗体阳性，即抗精子抗体遮盖了精子膜表面的WGA受体，这是精子膜WGA受体假性缺失；Ⅱ型是WGA受体真性缺失，属精子膜分子病。WGA受体检测降低，应注意检测精子抗体是否阳性。 附：检验申请单及标本留取注意事项 佛山市第一人民医院男科实验室检验申请单   住院/门诊号：                         科      房      床       电话/地址： 姓名                ○ 男  ○女 岁 ○计算机辅助精液常规分析 ○精子膜抗体混合抗球蛋白试验 ○精子膜抗体免疫珠试验 ○夫妇协同间接免疫珠试验 ○精浆弹性硬蛋白酶定量 ○精浆果糖定量 ○精浆中性α-葡糖苷酶定量 ○精浆锌定量 ○精浆酸性磷酸酶定量 ○精浆柠檬酸定量 ○精浆LDH-X同工酶定量 ○精子LDH-X同工酶定量 ○精子顶体酶定量 ○精子核蛋白组型转换 ○精子低渗膨胀试验 ○精子凝集素受体定量 ○精子形态学快速染色 ○精液沉渣镜检 ○尿液沉渣镜检 ○其它（没列出的项目可在本处填写） 诊断                禁欲时间    天 标本：（              ） ○精液         ○血液 ○尿液         ○前列腺液 注：请在需检验的项目前打“√” 医师：            工号： 日期：            年     月    日 标本采集时间：       年    月    日    时    分    采集者：       工号： 咨询电话：83833633-2235 佛山市第一人民医院 The first people’s hospital of Foshan 泌尿外科 版本：A 检  验  须  知 1.精液标本留取注意事项:①精液检查前需禁欲3-6天,最好不长于7天;②精液采集最好在医院内进行,精液射出后立即送检。若在医院留取精液有困难，则精液排出后应在60分钟内送到实验室,冬天应密切注意标本保温,以免冻伤精子。精液排出后应立即在化验单上准确标本留取时间；③精液采集最好以手淫方式进行,不得以安全套或中断性交方式留取标本(导致精子死亡或精液丢失);射精过程应彻底，精液收集要完整，不得遗漏；④盛装精液的容器洁净度要求很高,交费后请到泌尿外科男科实验室领取专用精液样本杯。 2.夫妇协同间接免疫珠试验:选择此项检查以男方精子有一定活力为前提，要求同时送检男方精液和配偶血液(干燥管2ml)或宫颈粘液（>0.1ml）。 3.精液量少于1ml者，要求同时留取精液和排精后的第一次尿液送检。 4.精液标本必须在每个工作日上午11点前，下午4点30分前送检。 5.单选项目分析明细内容: 精子膜抗体混合抗球蛋白试验(包括MAR IgG类型); 精子膜抗体免疫珠试验(包括IBT IgG、IgA、IgM三种类型); 夫妇协同间接免疫珠试验(包括IgG、IgA、IgM三种类型);