精液常规分析（世界卫生组织标准）

精液是评估男子生育力的重要方法，也是男科病诊断、疗效观察的实验依据，但精液分析的各参数也不是特异的，它并不能够确定达到受精位置的少数精子的受精能力，因此要正确评估男子生育能力还需要结合临床进行综合评估。 精液的分析结果易受射精频度，温度，实验室条件，检验人员的技术熟练程度，主观判断能力等诸多因素影响，其结果易发生偏差，因此精液采集与分析必须严格按照适宜的标准化程序进行，才能提供受检者临床状况的必要信息。不育夫妇初诊时，男方至少要按标准程序做两次精液分析，两次分析如有明确差异，还要进行第三次分析。 精液标本可能含有致病菌和病毒（如HIV病毒，肝炎病毒，单纯疱疹病毒等），因此应视为生物危险品。实验室技术人员应注意防护，要使用一次性手套和各种器皿。用过的器皿要消毒处理。精液培养，用于生物测定，宫腔内受精或体外受精，在处理过程中必须严格用无菌材料和无菌操作。   一，精液标本的采集和运送   精液采集规范化是做好精液分析的前提条件，因此在精液采集前务必要详细告知受检者有关精液采集和运送的方法及注意事项。 1，标本采集前应禁欲至少48小时，但不超过7天。为减少精液分析结果的波动，禁欲的天数应尽可能恒定。每一份精液分析都应写明：病人姓名、禁欲时间、标本采集的日期和时间、标本采集是否完整以及标本从采集到分析的时间间隔等。 2，初检者应做两次精液分析，两次精液采集的间隔应大于7天，但不能超过3周。如果两次的结果有明显的差异，应再取标本进行第三次分析。 3，标本的采集最好在实验室附近的取精室内单独进行。否则，应在采集后1小时内送到实验室。 4，最好用手淫的方法取精液，收集精液要用对精子无毒性作用的广口玻璃或塑料容器中。温度应保持在20~40℃,以避免降低精子活力。如果要做微生物学方面的检查，病人应先排尿并洗净双手和阴茎，用无菌容器收集。 5，如手淫取精有困难，可用特制的避孕套进行精液采集。因日常用的乳胶避孕套会影响精子的存活，故不能用于采集精液。性交中断法也不能用于采集精液，因为射精最初部分可能丢失，而这部分精子密度常常是最高的。而且，标本会受到细菌和微生物的污染；同时酸性的阴道分泌物对精子活力也会产生不利的影响。 6，精液采集一定要完全，不完整的精液不宜进行分析。 7，标本在运送到实验室的过程中，温度应保持在20℃以上，但不能超过40℃。 8，收集精液的容器必须标明受检者姓名（和/或身份证号码）以及标本采集的日期和时间。   二，精液的肉眼观察   1，精液的液化 室温下，精液射出体外立即会凝固，随后进入液化过程，此过程多在15分钟内完成，如超过60分钟精液不液化应视为异常。因此，建议取精后20分钟、30分钟、60分钟观察液化情况并液化所需时间，及是否完全液化。正常精液可以含有不液化的胶冻状颗粒，这一现象似乎没有任何临床意义。精液液化时间延长，不完全液化或不液化，通常与前列腺分泌功能低下，蛋白溶解酶缺乏有关。 精液不液化，需另行处理，可用机械混匀或菠萝蛋白酶消化（菠萝蛋白酶1g/L）。加入等量的培养液并重复用加样器吹打也可以使某些标本液化。应注意的是，所有这些处理方法都可能影响精浆的生化、精子活力和精子形态学的测定结果。 2，精液的外观 精液标本液化后首先应在室温下肉眼观察其外观。正常的精液质地均匀、呈灰白色，禁欲时间长精液可略带黄色。如果精子密度非常低或无精子，精液可显得稀薄。如有红细胞，精液可呈红褐色。如有黄疸或服用某些维生素，精液可呈黄色。 3，精液量 精液量可用锥形底的刻度量筒测量。正常男子每次射精，精液量不少于2ml。精液量少常与取精时部分精液丢失有关。如精液无丢失，量少且不凝固，无精子，体检时输精管缺如，应考虑精囊腺先天发育不全。 4，精液粘稠度 评估粘稠度的方法可用一宽孔的5ml吸管轻轻吸入精液，正常精液由于重力作用在管口形成不连续的小滴，粘稠度异常时液滴会形成＞2cm的拉丝。检测粘稠度的另一个方法，是将一玻璃棒插入精液，提起玻璃棒，并观察拉丝长度，拉丝长度超过2cm视为异常。高粘稠度精液可阻碍精子的运动。 5， PH值 PH值应在射精后1小时内测定。将一滴精液滴在PH试纸上（PH试纸范围为6.1～10.0或6.4～8.0），30秒后，浸湿区域的颜色应该均匀一致，与标准带比较读出其PH值。无论使用哪种PH试纸，都应该用已知标准核查其准确性。   三，精液的显微镜检查   精液显微镜检包括精子密度、精子活力、精子存活率、精子凝集、非精子细胞成分的测定和精子的形态学分析。 精液镜检建议使用相差显微镜，普通光学显微镜亦可，但要调好聚光器。 1，镜检标本的制备 精液取样的体积和盖玻片的尺寸应标准化，以使精液在大约20μm的厚度下进行分析。在精确检测精子密度之前，应粗略测定精子密度。具体方法是： 用加样器将10μl的精液滴在干净载玻片上，再盖上22㎜×22㎜的盖玻片。盖玻片的重量使标本展开以达到最佳观察效果，注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡。 放置1分钟使其稳定。检测可在20～24℃室温下进行，由于温度会影响精子的活力分级，因此实验室的温度必须标准化。精子活力和运动速度与温度高度相关，建议行活力的评估时，最好使用保温镜台，台面温度恒定在37℃。制备好的标本应先在100倍镜下观察是否有粘液丝形成、精子凝集以及标本在载玻片上展开的是否均匀，然后在400倍镜下进行检查。 2，精子密度的初检 在精确计数精子密度前要进行精子密度的初检，初检结果将作为精液稀释倍数的依据。不同显微镜放大400倍视野的直径是不同的，一般直径范围为250～400μm，相当于1～2.5nl，厚度为20μm的样本。视野的直径可由微标尺或记数池中的格子确定。计数每个视野的精子个数，乘以106/ml就是粗略估算的精液标本的精子密度。此估算结果用来决定用血细胞记数板测精子密度的稀释倍数：<15个精子，1：5稀释；15～40个精子，1：10稀释；40～200个精子，1：20稀释；>200个精子，1：50稀释。 如果每个视野的精子数目差异较大，提示标本是不均匀的。在这种情况下，精液标本应再次混匀，重新取样、检测。精液粘稠度异常、液化不全、精子在粘液丝中聚集或精子凝集都会影响精液混匀。 如果精子数目少（400倍镜下每视野少于1～2个），可以用离心方法浓缩标本后再测定精子密度。取1ml精液（或尽可能多的精液）600g离心15分钟。弃去已知体积的精浆，充分混匀沉淀后计数。最终密度根据弃去的精浆体积进行校正。标本离心后也可以进行精子活力和形态学方面的评估。如果离心浓缩后精子数目还少（每视野少于1～2个），报告精子密度为<2×106/ml，同时注明是否见有活动精子即可。 所有显微镜检查未见精子的标本都应离心确定在沉渣中有无精子。建议使用>3000g离心15分钟。只有当所有沉渣重新悬浮，经彻底和系统检查后发现无精子，这时才能作出无精子的判断。 3，精子活力的评估 精子活力是指精子前向运动的能力，为便于操作将精子活力分为a、b、c、d四级。 “a”级：快速前向运动（即37℃时速度≥25μm/s,或20℃速度≥20μm/s）。 “b”级：慢速或呆滞的前向运动。 “c”级：非前向运动（<5μm/s）。 “d”级：不动。 评估精子活力，至少要系统地观察5个视野，分析的精子不少于200个。首先计数a和b级精子，随后在同一视野计数非前向运动的c级和不动的d级精子。用计数器计数各级精子的数目并计算出各级精子占所有计数精子的百分比。同一份精液要进行两次取样分析，并计算其平均值，两次分析之间的变异应小于10%。通常说的精子活动率是指a、b、c三级活力百分率的总和。临床上只有前向运动的精子才有可能到达受精的位置。因此WHO将a级≥25%，a+b级≥50%作为正常精液精子活力的参考值。 4，非精子细胞成分 精液中常含有一定的非精子细胞成分，统称为“圆细胞”，其中包括泌尿生殖道的上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞。一般而言，一份正常精液中所含圆细胞数不应超过5×106/ml。 白细胞，主要是中性粒细胞，存在于大多数人的精液中。过多的白细胞（白细胞精子症）可能与感染和精液质量差有关，白细胞数目不应超过1×106/ml。非精子细胞的计数也可用血细胞计数板。方法同精子密度计数。精子计数仅包含精子，其它类型生精细胞和白细胞的密度可用相对精子密度来计算。计算方法如下： C：需计数的特定类型细胞浓度（106/ml） N：计数100个精子时同视野的特定类型细胞数 S：样本的精子密度（106/ml） N×S   100 C=   白细胞和生精细胞可用过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗体法鉴别。 当精液中白细胞数目多时，应该进行微生物学检验以证实有无副性腺感染，但未见白细胞却不能完全排除副性腺感染的可能性。 不同类型的未成熟生精细胞在精液中出现常提示精子发生异常。  5，精子凝集 精子凝集是指活动精子以不同方式，头对头、尾对尾或混合型（如头对尾）彼此粘在一起。 凝集的出现提示不育可能是免疫因素引起的，但不足证明这一点。评估凝集可在检测精子活力时进行。精子凝集的类型应当记录，如头对头、尾对尾或混合型。亦可采用半定量的分级方法：没有凝集（-），有凝集可根据其程度用（+）、（++）、（+++）示，所有活动的精子都凝集在一起（+++）。不活动精子之间，活动精子与粘液丝之间，活动精子与非精子细胞成分、细胞碎片等粘在一起，不能视为凝集。 6，精子存活率 精子存活率用活精子所占检测精子总数的百分比来表示，可用0.5%伊红Y溶液染色排除法或低渗膨胀实验来鉴定死活精子。如果不动精子的百分数超过50%，应检测精子存活率。不动的精子不都是死精子。 死精子因细胞膜通透性改变被伊红染为红色，活精子不着色。用光学显微镜或相差显微镜至少计数200个精子，并区分活精子（未染色）和死精子（染色）。 精子存活率评估可核查精子活力评估的准确性，因为在计数误差范围内死精子比例不应超过不动精子比例。活的但不动的精子占很大比例提示精子鞭毛有结构缺陷。 7，精子密度的测定 目前常规的精子密度测定仍提倡用血细胞计数板方法，按事先估算的精子密度用稀释液将精液稀释成不同倍数（1：5、1：10、1：20、1：50）备用。（标准稀释液的配制方法：在蒸馏水中加入50g碳酸氢钠（NaHCO3）、10ml35%（v/v）的福尔马林和0.25g台酚蓝（Color Index C.I.23850）或5ml饱和龙胆紫溶液，并使该溶液的最终体积达到1L。） 用一滴水湿润手指，轻轻湿润计数池的两侧，确保盖玻片紧贴在血细胞计数板上。向血细胞计数板的上下两个计数池分别注入约10μl充分混匀后的稀释精液。具体步骤是将加样器头小心地接触盖玻片的边缘，通过毛细管作用使样品充满每个计数池。计数池不应过满或不满，并且盖玻片不应移动。再将血细胞计数板放在湿盒内以免干燥，静置5分钟。然后开始计数，最好使用相差显微镜，放大倍数为200到400倍。应计数有完整结构的精子（有头和尾）。有缺陷的精子（尖头和无尾头）也应分开计数并记录。 用血细胞计数板计数精子的方法如下。计数板的中央方格含有25个大格子，每个大格包含16个小格。如果每大格标本所含精子少于10个，应计数所有25个大方格内的精子数；如每大格标本所含精子在10和40之间，应计数10个大方格；如每大方格标本所含精子多于40个，计数5个大方格即可。如果一个精子位于相邻两格分界线上，只计数位于方格上界和左界的精子。 必须计数200个以上精子以减少计数误差。为核查两次计数结果，应计算它们的总数和差异，并计算其平均数。两次计数之间的变异不大于10%，如变异大于10%应重新混匀标本，再取样计数。 确定原始精液标本的精子密度（百万/ml ）,可以将计数精子平均数除以表（一）中合适的转化因数即可。   表（一）血细胞计数板的稀释和转换因数 每400倍视野 中的精子数 稀释倍数 （精液和稀释液） 转化因数 计数的大方格数目 25 10 5 <15 1： 5（1+ 4） 20 8 4 15～40 1：10（1+ 9） 10 4 2 40～200 1：20（1+19）  5 2 1 >200 1：50（1+49）  2   0.8   0.4   计数池，临床上用的有Makler和Microcell计数池，它们也可以用来计数精子密度，且不必稀释样本，很方便，但它们缺少血细胞计数板方法的准确性和精确度。使用时，建议与血细胞计数板方法比较以保证它们的可靠性。 8，精子形态学评估 人类精子形态易变化，致使精子形态学评估非常困难，但是观察女性生殖道（尤其是性交后宫颈粘液中）或从透明带表面回收的精子，有助于人们明确正常形态精子外观。进行精子形态评估，应先制备精液涂片，固定，染色后封片并在油镜下分析。一份新鲜精液至少涂两张片子重复评估 ①涂片的制备 载玻片首先应彻底洗净，并用70%酒精洗涤后干燥，滴一小滴精液（5~20μl）于载玻片中央。（如果精子密度超过20×106/ml，取5μl精液；如果精子密度＜20×106/ml，应取10~20μl精液。）然后将第二张载玻片表面朝下盖在其上，精液便在两片之间扩散；轻拉两片分开即可同时制得两张片子。 精子密度低、精液过于粘稠、充满碎屑的标本，或需用计算机辅助分析精子形态时，可用生理盐水稀释精浆并离心弃去精浆。沉淀的精子团重新悬浮在适量的生理盐水中，以获得尽可能高的密度，但不应超过80×106/ml。操作方法，在室温下，视精子密度取0.2～0.5ml的精液，用生理盐水稀释到10ml。在800g下离心10分钟，而后弃去大部分上清液，轻轻弹动试管使离心后的精子团重新悬浮于剩余的盐水中，一般为20～40μl，而后取5～10μl悬浮液按上述方法涂片。400倍镜下观察精液涂片是否均匀，每视野至少有40个精子，精子没有成团或重叠。如果精液涂片的精子太密，应取更少体积的精液或进一步稀释标本，重新制备一涂片。如涂片上的精子太稀，应取更多的精液以获得满意数量的精子。这些涂片行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。 ②染色方法 巴氏染色是男性学实验室最广泛使用的方法，也是世界卫生组织推荐的方法。它可以使精子和其他细胞很好地染色。精子头部的顶体和顶体后区、胞浆小体、中段和尾部都能着色。对于普通形态观察，Shorr染色的染色效果与巴氏法相似。 上述染色方法。精子头部顶体区呈淡蓝色，顶体后区染成深蓝色，中段可染为淡红色，尾部也染成蓝色或淡红色，胞浆小滴常位于头部后面或中段周围，在巴氏染色中染成绿色。 ③精子形态分类 染色后精子头部比原始精液中活精子的头部稍小一些，但没有明显形态差异。在评估精子正常形态时应采用严格标准。只有头、颈、中段和尾形态都正常的精子才算正常。精子头部的形状必须是椭圆形，考虑到固定和染色所致的轻度收缩，精子头部长度为4.0～5.0μm，宽为2.5～3.5μm.长宽之比应在1.50～1.75之间。顶体的界限应是清晰的，占头部的40%～70%。中段应细，宽度<1μm，大约为头部长度的1.5倍，并且在轴线上紧贴头部。胞浆小滴应小于正常头部大小的一半。尾部应是直的、均一的，比中段细，非卷曲的，其长约为45μm。所有形态学处于临界状态的精子均列为异常。 精子形态分析关键是评估正常形态的精子，计算其百分比，因为只有正常形态的精子才有临床意义。建议不必常规区别精子头部大小和形态的差异，或各种精子中段和尾部缺陷的变化。 常见的精子形态缺陷类型有： （a）        头部缺陷：大头、小头、锥形头、梨形头、圆头、无定形头、有空泡的头（未染色的空泡区域占头部的20%以上）、顶体过小头（小于头部的40%）、双头以及上述缺陷的任何组合。 （b）        颈部和中段的缺陷：颈部“弯曲”（颈和尾形成的角度大于头部长轴的90%）、中段非对称地接在头部、粗的或不规则的中段、异常细的中段（即无线粒体鞘）和上述缺陷的任何组合。 （c）        尾部缺陷：短尾、多尾、发卡形尾、尾部弯曲（>90度）、尾部宽度不规则、尾部卷曲或上述缺陷的任何组合。 （d）        胞浆小滴大于正常精子头部的一半。 只有带有尾部的可确认精子，才考虑进行不同形态精子计数，未成熟精子细胞包括圆形精子细胞阶段，不能作为精子进行计数。精子头脱落或无精子头的不作为精子计数，但应分开记录。卷尾的精子可能与精子活力低相关，或提示精子已暴露于低渗透压。偶尔，许多精子可能有特异的结构缺陷，例如，顶体不发育，导致“小圆头缺陷”或“球形精子症”。 ④精子形态计数 涂片经染色后，在100×的油镜亮视野及至少10×的目镜下观察。应系统地选择涂片上多个区域进行形态学的评估，注意区域不能重复。要从一个视野到另一个视野系统地检查涂片，所有的正常精子都被评估和计数，同时记录异常精子的缺陷。不应评估重叠的精子和头部位于边缘的精子，后者可通过上下调整焦距加以识别。要用目镜上的微标尺测量精子头部的大小。在每批涂片的检查中，即使是经验丰富的观察者，在检查精子头部的大小时，也应使用目镜上的标尺。 精子形态分析至少连续分析并计数200个精子。当病人的诊断和治疗主要依赖于正常形态精子的百分比时，应分析两次，每次均不少于200个精子，以增加精确性。 近年来随着辅助生育技术的发展，许多研究都证明了正常精子形态率与体外受精率有非常密切相关。正常形态率低于15%时，体外受精率降低。   四，计算机辅助精子分析（CASA）   以往对精子运动指标检测多采用主观目测来评定，随着现代科技的发展，利用录像带的计算机视屏技术已产生了新的诊断仪器，它能确定和跟踪个体精子的运动，计算出一系列运动参数。这就是计算机辅助精子分析(CASA)。这系统包括一台可摄像的相差显微镜，还有一部可供图像分析的计算机。CASA系统计算精子运动所需时间约1秒，录相速率25～35格/秒，测定温度保持在37℃。如精子密度大于50×106/ml，通常会增加碰撞的频率，并可能由此得出错误结果，因此，需用同源精浆或精子培养液稀释标本，稀释的标本密度为20～50×106/ml。计数池使用有固定深度的Makler(10mm深)和Microcell(20mm深)计数池。这样可保持一层精子游动，便于单个精子分析。放大倍数一般为67倍(物镜10×，目镜6.7×)。每份标本至少追踪分析200～400个精子。CASA系统分析精子运动的指标有  VCL=曲线速度(mm/s)。精子头沿其实际的曲线，即显微镜下见到二维方式运动轨迹的时间平均速度。 ‚ VSL=直线速度(mm/s)。根据精子头在开始检测时的位置与最后所处位置之间的直线运动的时间平均速度。 ƒ VAP=平均路径速度(mm/s)。精子头沿其空间平均轨迹移动的时间平均速度。这个轨迹是根据CASA仪器的算法对实际轨迹平整后计算出来的，计算方法因仪器不同而有所不同。 „ ALH=精子头侧摆幅度(mm/s)。精子头沿其空间平均轨迹侧摆的幅度，以侧摆幅度的最大值或平均数值表示之。不同的CASA仪器用不同的计算方法计算ALH。故数值不能直接比较。 … LIN=直线性。即曲线轨迹的直线性。即VSL/VCL。 † WOB=摆动性。精子头沿其实际轨迹的空间平均路径摆动的尺度。VAP/VCL。 ‡ STR=前向性。空间平均路径的直线性。VSL/VAP。 ˆ BCF=鞭打频率(鞭打次数/秒)。精子曲线轨迹超过其平均路径轨迹时间平均速率。 ‰ MAD=平均移动角度(度)。精子头沿其曲线轨迹瞬间转折角度的时间平均绝对值。 CASA较人工方法有三个优点：① 精子运动指标的检测更客观、更精确；② 能提供精子动力学的量化数据；③ 检测的速度快，可捕捉的信息量大。但它也有不足之处：① 设备价格昂贵；② CASA评估精子密度的精确度还受精液中细胞成分和非精子颗粒物质影响，有待于进一步改进，因此CASA还不能用于临床常规分析。近年来使用DNA荧光染色的CASA出现，为精确测定精子密度提供了可能。但精子形态学的自动分析尚未解决。   五，常规精液分析参考值   精液量≥2.0ml pH值≥7.2 精子浓度≥20×M/ml 精子总数≥40×M/ml/一次射精 精子活力    60分钟内a级和b级≥50%或a级≥25% 正常形态率  ≥15% 精子存活率  ≥50% 白细胞  <1M/ml