食品检测论文甲醛检测论文

�流行病学研究� PCR 检测冷冻食品中 活的非可培养状态! 的副溶血弧菌 龚玉姣, 贺征, 陈建东, 区继军, 杨智聪 �摘要� ∀ 目的 ∀ 比较应用传统培养和 PCR技术检测引起食物中毒的食品和患者肛拭子副溶血弧菌的 方法。方法 ∀ 按照国家标准 GB4789和有关规范采集引起食物中毒的食品和患者样品, 采用传统培养 方法分离鉴定病原菌, 并结合分子生物学技术提取食品和患者样品的总 DNA、PCR扩增病原菌特异 性基因。结果 ∀ 12 份患者肛拭子样品中有 8份样本分离培养出同一血清型 O3: K6 的副溶血弧菌, 8 份样本 PCR 扩增副溶血弧菌毒力基因结果也呈阳性; 患者食用过的海鲜等 18 份冷冻食品采用传统培 养方法均未分离到活的副溶血弧菌, 但其中有 2 份食品 PCR 扩增结果呈阳性。结论 ∀ 本研究表明, 患者的肛拭子用传统培养方法分离鉴定副溶血弧菌结果与 PCR 扩增结果一致; 而冷冻的海鲜食品中 副溶血弧菌也许进入了 活的非可培养 ( VBNC)! 状态 , 难以通过分离培养方法检测出来, 但用 PCR 技术能扩增出其存在的特异性基因, 从而提高检测病原菌的敏感性。 �关键词� ∀ 副溶血弧菌; 传统培养; PCR检测; 冷冻食物; 活的非可培养状态 中图分类号: R155� 55, R378� 3∀ ∀ 文献标识码: A ∀ ∀ 文章编号: 1009�6639 (2010) 10�0988�03 Detection of viable but non�culturable Vibrio parahaemoly ticus in frozen food by reverse transcription PCR ∀ GON G Yu� j iao , H E Zheng , CH EN J ian�d ong , OU J i�j un, YA NG Zhi� cong� Guangz hou Municipal Center f or D isease Pr evention and Control , Guangdong 510080, China Cor resp ond ing author : YA NG Zhi�cong , E�mail : gd gz cdc@ 21cn� com �Abstract� ∀ Objective∀ To detect V ibrio parahaemo lyt icus from food samples leading fo od borne disease and anal sw abs o f patients w ith classic cultur ing and PCR technique� ∀ Methods∀ A12 anal swabs of clini� ca l patients and 18 samples of left food that patients at e w ere co llected following the nat ional standard pro cedure of GB4789� The samples were tested fo r pathogens w ith classic cultur ing method and also RT� PCR fo r special g enes� ∀ Results ∀ Among the 12 ana l swabs o f clinical patients , eight strains of V� Parahaemolyticus, serum type O3: K6 were isolated fr om eight anal swabs, and the same eight anal swabs were also positive for RT�PCR testing� The RT�PCR confirmed 2 out 18 fo od samples po sitiv e fo r V� Parahaemolyticus, although culturing method gave negativ e result for a ll the food samples� ∀ Conclu� sion ∀ The RT�PCR method could detect v iable but non�cultur able V� parahaemolyticus in fro zen fo od and should be used fo r pathogen testing fo r suspect food testing� �Key words� ∀ Vibr io p arahaemoly ticus ; Classic cultur ing; PCR assay ; F ro zen food; V iable but non� culturable ( VBNC) ∀ ∀ 副溶血弧菌 ( vibr io par ahaemoly t icus ) 是一种 嗜盐的革兰阴性肠道致病菌, 可引起食物中毒、腹 泻、胃肠炎、反应性关节炎和心脏疾病。副溶血弧菌 广泛分布于自然界, 尤其以海产品携带率最高, 因 此, 副溶血弧菌是沿海一带引起食物中毒和急性腹泻 的重要病原菌[ 1] 。广州地处华南沿海, 人们经常食用 基金项目: 广东省医药卫生科技项目 ( A2006562) 作者单位: 广州市疾病预防控制中心, 广东广州 ∀ 510080 作者简介: 龚玉姣, 硕士, 博士在读, 主管技师, 主要从事病原微生 物快速检测方法的研究 通讯作者: 杨智聪, E�mail: gdgzcdc@ 21cn� com 冷冻海鲜产品, 因而由副溶血弧菌引发食物中毒出现 频率较高。 1 ∀ 材料与方法 1� 1 ∀ 材料 1� 1� 1 ∀ 样本: 某学校食物中毒腹泻患者肛拭子 12 份, 吃后剩余海鲜等食品 18份。 1� 1� 2 ∀ 标准 参考 株: 副溶 血 弧菌 标 准菌 株 ATCC33847 ( TDH 阳性, TRH 阴性)、副溶血弧菌 标准菌株 A TCC17802 ( T DH 阴性, T RH 阳性)、 大肠埃希杆菌 AT CC25922 均购自北京菌种检定所。 1� 1� 3 ∀ 培养基和试剂 : 氯化钠结晶紫增菌液; 嗜盐 #988# 中国预防医学杂志 2010年 10月第 11卷第 10期∀ C hin Pr ev M ed, October 2010, Vol� 11 No� 10 菌选择性琼脂; T CBS 琼脂; SS 琼脂、3� 5%氯化钠 三糖铁斜面; 嗜盐性生化试验培养基等, 均按要求自 行配制, 并进行高压灭菌; 兔血我萋氏培养基、羊血 我萋氏培养基购自广东环凯生物公司; 血清试剂 (日 本株式会社) ; PCR 引物由大连宝生公司合成, T aq 酶、10 ∃ buffer, M gCl2 , dNT Ps 以及 DNA marker 均购自大连宝生公司; DNA 提取试剂盒 ( Dneasy Tissue 50次) 购自 QIAGEN公司。 1� 2 ∀ 方法 1� 2� 1 ∀ 副溶血弧菌分离鉴定: 按照国家标准 GB 4789 对食物中毒采集的样品进行副溶血弧菌的分离 培养、生化鉴定和血清学反应以及动物试验 [ 2] , 分离 菌株用 VITEK�120全自动分析仪复核分析。 1� 2� 2 ∀ 动物实验: 将符合副溶血弧菌生化反应的菌 株接种于 3� 5% 氯化钠胨水中, 培养 18 h, 用麦氏 比浊法调整菌悬液浓度约为 1� 0 ∃ 108 细菌/ ml, 注 射于 5只体重约为 13~ 15 g 小白鼠腹腔内, 每只注 射 0� 3 ml。同时设立阳性对照组和阴性对照组。阴 性对照组小白鼠每只注射无菌的 3� 5%氯化钠胨水 0� 3 ml。阳性对照组的菌悬液用标准副溶血弧菌制 备, 菌悬液浓度及注射剂量同上。各组小白鼠放于笼 内常规饲养, 观察 2~ 3 d。 1� 2� 3 ∀ DNA提取: 按照 DNA 提取试剂盒说明书操 作 ( Dneasy T issue Handbook)。 1� 2� 4 ∀ PCR检测 : 应用一种在种的水平上鉴定副溶 血弧菌的 PCR 方法, 检测靶标为副溶血弧菌种的特 异性基因 to xR[ 3] , 副溶血弧菌的耐热直接溶血素基 因 ( tdh) 和相对耐热直接溶血素基因 ( tr h) [ 4]。从 GenBank上获得副溶血弧菌 tdh、t rh、toxR 基因的 DNA 序列, 应用 DNAStar 软件分别设计特异性引物 如 下: tdh 上 游 引 物 为 5%�CTT CCA TCT GT C� CCT TT T�3%, 下游引物为 5%� CTGCCATT GT AT� AGT CTT TAT C�3%, 扩增片段大小为 243 bp; t r h上 游引物5%� A TT GT GGAGGACT AT TGG�3%, 下游引 物 5%�T TGTGAAGACCGT AGAAG�3%, 扩增片段大 小为 190 bp; toxR 上游引物为 5%�CAA CAAAGCG� GCAACGAA�3%, 下 游 引 物 5%�CTAAAGACG� GCT CT ACGA�3%, 扩增片段大小为 373 bp。PCR反 应体系为 25 �l, 含 1 ∃ buffer、MgCl2 1� 5 mmol/ L, dNT Ps 0� 2 mmol/ L , 引物各 1 �mol/ L, T aq 酶 25 U/ m l及 1 �l 模板 DNA。反应程序为: 94 & 预变 性 DNA 4 min 后, 按 94 & 30 s, 56 & 45 s, 72 & 60 s 进行 30 个循环, 最后 72 & 延伸 8 min。用含 0� 5 mg / L 溴化乙啶的 1� 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩 增产物, 通过凝胶成像系统观察结果。 2 ∀ 结果 2� 1 ∀ 分离鉴定 18份食物均未分离出副溶血弧菌; 12份患者肛 拭子中 8 份样本分离出副溶血弧菌, 血清型为 O3 ∋K6, 神奈川试验阳性, 即菌落均能在兔血我萋 氏培养基上生长并产生溶血环, 而在羊血我萋氏培养 基上生长而不产生溶血环, 说明均为耐热直接溶血素 ( TDH ) 阳性, 相对耐热直接溶血素 ( TRH ) 阴性。 2� 2 ∀ 生化试验 分离菌株上仪器 VITEK�120 全自动分析仪 GNI+ 卡, 系统生化鉴定见表 1, 副溶血弧菌符合率 为 98%。 表 1∀ 分离的副溶血弧菌生化反应结果 试验项目 结果 三氯新 葡萄糖氧化 阳性生长控制 乙酰氨 七叶苷 植物尿蓝酶 尿素 枸橼酸盐 丙二酸盐 苯丙氨酸 - + + - - - - - - - 试验项目 结果 多粘菌素B耐药 乳糖 麦芽糖 甘露醇 木糖 棉子糖 山梨醇 蔗糖 肌醇 侧金盏花酵 - - + + - - - - - - 试验项目 结果 香豆酸 H2 S ��半乳糖苷酶 鼠李糖 阿拉伯糖 葡萄糖发酵 精氨酸 赖氨酸 鸟氨酸 氧化酶 - - - - + + - - - + 2� 3 ∀ 动物实验 对小白鼠腹腔注射毒力试验, 阴性对照组观察 72 h 仍正常; 阳性对照组和实验组小白鼠 5 h 后开 始发病, 竖毛、食欲不振、呼吸困难、四肢抽搐, 10 h 内全部死亡。将死亡小白鼠进行解剖检查, 发 现小肠有出血、水肿, 肠黏膜脱落, 内有黄色希薄黏 液, 取肠内容物分离培养鉴定, 仍获原注射接种菌, 实验结果表明此食物中毒分离的副溶血弧菌具有较强 的致病性。 2� 4 ∀ PCR检测结果 副溶血弧菌 TDH 阳性参考株、8份肛拭子样本 和 2份食物 DNA 提取液均扩增出大小为 243 bp tdh 基因产物和 373 bp tox R 基因产物, 副溶血弧菌 TRH 阳性参考株扩增大小为 190 bp tr h 基因产物和 373 bp toxR 基因产物, 而肛拭子和食物样本的 tr h #989#中国预防医学杂志 2010年 10月第 11卷第 10期 ∀ Chin Prev Med, Octob er 2010, Vol� 11 No� 10 基因扩增结果为阴性; 阴性参考菌株大肠杆菌扩增基 因结果均为阴性, 见图 1。8份肛拭子样本、2份食 物 DNA 提取液的 tdh 和 toxR 基因片段测序结果与 副溶血弧菌 TDH 阳性参考株的 tdh 和 toxR 基因序 列的一致性为 100 %。 注: M , 100 bp DNA ladder Marker; 1~ 8, 患者肛拭子; 9~ 10, 食物; 11, 副溶血弧菌 T DH 阳性参考株; 12, 副溶血弧菌 T RH 阳 性参考株; 13, 大肠埃希菌阴性参考株 图 1 ∀ 副溶血弧菌 tdh、tr h、tox R 基因 PCR扩增产物凝胶电泳图谱 3 ∀ 讨 ∀ 论 副溶血弧菌常存在于近海海水、海产品及盐渍食 品中, 是我国沿海地区夏秋季食物中毒和急性腹泻的 主要病原菌, 耐热直接溶血素 ( thermostable direct hemo lysin, T DH ) 和相对耐热直接溶血素 ( T DH� related hemo lysin, TRH ) 被认为是副溶血弧菌的主 要毒力因子, 与副溶血弧菌的致病能力密切相关[ 5]。 在致病力强的副溶血弧菌菌株中存在着一种被称为 神奈川现象! 的特殊溶血活性, 此现象即是由于编 码耐热直接溶血素的基因 ( td h) 高度表达而产生 的[ 6]。引起本次食物中毒的副溶血弧菌, 从基因扩增 结果可知均为耐热直接溶血素基因阳性而相对耐热直 接溶血素基因 ( tr h) 阴性, 与神奈川试验结果一致, 动物试验结果小白鼠均在 10 h 内死亡, 并且据流行 病学调查, 这次食物中毒患者临床表现病情严重, 最 初表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、洗肉样水便等消 化道症状, 随后出现发热、头晕、抽筋、肌肉痛, 甚 至脱水、昏迷等症状, 这说明引起这次食物中毒的副 溶血弧菌具有较强的致病力。 本次食物中毒经 PCR分析有 2 份海鲜食物副溶 血弧菌特异性基因呈阳性, 并且 PCR 扩增产物与患 者肛拭子以及副溶血弧菌 TDH 阳性参考株都具有同 源性, 说明本次食物中毒是由该食物引起的, 但所有 食物经传统分离培养均没有分离出活的副溶血弧菌, 也许在经过低温冷冻的海鲜食品中副溶血弧菌转入 活的非可培养 ( viable but non�cultureable state, VBNC) ! 状态[ 7]。刘端等 [ 8] 首次报道了低温、寡营 养等环境因子能导致细菌进入 VBNC 状态, 研究表 明病原微生物进入 VBNC 状态并没有失去致病力, 但用常规培养法已无法分离检测出来。本研究用 PCR方法检测冷冻海鲜食品中的副溶血弧菌具有敏 感、快速、特异性强等优点, 提高了副溶血弧菌的检 出率, 缩短检出时间, 为食物中毒及早诊断和食品安 全提供依据。 参考文献 [ 1] ∀ 刘秀梅, 陈艳, 王晓英, 等� 1992- 2001 年食源性疾病暴发资 料分析: 国家食源性疾病监测网 [ J ]� 卫生研究, 2004, 33 ( 6) : 725�727� [ 2] ∀ 中华人民共和国国家标准 (食品卫生微生物学检验) GB4789- 2003 [ S ]�2003� [ 3] ∀ Kim YB, Okuda J, M atsum oto C, et al� Ident ificat ion of Vib rio parahaem olyticus st rain at the species level b y PCR targeted to th e toxR gen e [ J]� J Clin Microbiol, 1999, 3 ( 7) : 1173�1177� [ 4] ∀ T ada J, Ohashi T , Nishimura N, e t al� Detect ion of the ther� mos table di rect hemolysin gene ( tdh) and th e thermostab le di� rect hem olysin� related gen e ( tr h) of Vibrio parah aemolyt icus b y p olymerase chain r eact ion [ J]� M ol C ell Probes, 1992, 6 ( 3 ) : 477�487� [ 5] ∀ 朱雪兰, 陈艳� 副溶血性弧菌溶血素基因及其检测的研究进展 [ J ]� 国外医学卫生学分册, 2007, 34 ( 4) : 233�236� [ 6] ∀ 杨振泉, 焦新安� 副溶血弧菌毒力因子及其致病机理研究进展 [ J ]�中国人兽共患病学报, 2008, 24 (11) : 1070�1073� [ 7] ∀ 郑桂丽, 廖绍安, 翟俊辉, 等 � 环境中 活的非可培养 ( VBNC )! 细菌的研究进展 [ J]� 微生学免疫学进展, 2004, 32 ( 4) : 58�66� [ 8] ∀ 刘端� 细菌 活的非可培养状态! 研究进展 [ J]� 疾病监测, 1998, 9 ( 6) : 350�354� (收稿日期: 2010�07�22) (李川 ∀ 编辑) #990# 中国预防医学杂志 2010年 10月第 11卷第 10期∀ C hin Pr ev M ed, October 2010, Vol� 11 No� 10