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2003-NSFC-大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用

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2003-NSFC-大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用 学科代码: C030204 受理部门: 收件日期: 受理编号: 检查保护(P) 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别:面上项目 亚类说明:自由申请项目 附注说明:本课题是在我们首次发现大鼠心肌细胞存在钙敏感受体(国 际合作研究课题)的基础上,继续深入研究。 项目名称:大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再 灌注损伤中的作用 申 请 者:徐长庆 电话:0451-6674548 依托单位:...
2003-NSFC-大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血再灌注损伤中的作用
学科代码: C030204 受理部门: 收件日期: 受理编号: 检查保护(P) 国家自然科学基金 申 请 书 资助类别:面上项目 亚类说明:自由申请项目 附注说明:本课是在我们首次发现大鼠心肌细胞存在钙敏感受体(国 际合作研究课题)的基础上,继续深入研究。 项目名称:大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再 灌注损伤中的作用 申 请 者:徐长庆 电话:0451-6674548 依托单位:哈尔滨医科大学 通讯地址:哈尔滨市南岗区保健路 157 号 邮政编码:150086 单位电话:0451-6669470-5 E-mail :xucq@ems.hrbmu.edu.cn 申报日期: 2003年2月18日 国家自然科学基金委员会 您现在还不能填写文档或打印,请根据以下三个步骤操作: 1)如果您是 Word2000 或以上版本用户,请把 Word 宏的安全性设为:"中" 方法: Word 菜单->工具->宏->安全性->安全级,设置为"中" (如果您是 Word97 用户,继续执行以下步骤) 2)关闭本文档,重新打开本文档 3)点击"启用宏"按钮,即可开始填写本文档或打印了 国家自然科学基金 第 2 页 共 28 页 基本信息 申 请 者 信 息 姓 名 徐长庆 性别 男 出生 年月 1945 年 4 月 民 族 汉族 学 位 学士 职称 教授 主要研究领域 心肌缺血/再灌注损伤 的机制和保护 电 话 0451-6674548 E-mail xucq@ems.hrbmu.edu.cn 传 真 045-6669576 个 人 网 页 工 作 单 位 哈尔滨医科大学\基础医学学院病理生理教研室 在研项目批准号 依 托 单 位 信 息 名 称 哈尔滨医科大学 代 码 15008601 联 系 人 刘凤玉 E-mail liufy@ems.hrbmu.edu.cn 电 话 0451-6669470-5 网站地址 www.hrbmu.edu.cn 合 作 单 位 信 息 单 位 名 称 代 码 [在此录入修改] [在此录入修改] [在此录入修改] 项 目 基 本 信 息 项目名称 大鼠心肌细胞钙敏感受体的生物学活性及其在心肌缺血/再灌注损伤中的作用 资助类别 面上项目 亚 类 说 明 自由申请项目 附注说明 本课题是在我们首次发现大鼠心肌细胞存在钙敏感受体(国际合作研究课 题)的基础上,继续深入研究。 学科代码 C030204:病理生理学 C010402:生物膜的结构与功能 基地类别 预计研究年限 2004年 1 月 — 2006 年 12 月 研究属性 基础研究 总预算经费 申请经费 摘 要 项目研究内容和意义简介(限 400 字): 1) 钙敏感受体在大鼠心肌组织的分布和正常生理作用。 2) 心肌缺血/再灌注对大鼠心肌组织钙敏感受体表达的影响。 3) 钙敏感受体激活与再灌注心律失常发生的内在关系。 4) 钙敏感受体激活引起心肌细胞内游离钙浓度增加的机制及信号传导途径。 在我们已证实其机制是通过 PLC-IP3 的基础上,进一步是通过百日咳毒素敏感性 G 蛋白, 还是通过非百日咳毒素敏感性 G 蛋白,或是两种方式均有。同时把有丝分裂原激活的蛋白 激酶(MAPK)和酪氨酸激酶途径作为观察重点。 5) 探讨钙敏感受体激活引起心肌细胞发生钙振荡,钙波和“钙爆炸” 的特点,规律和机 制,揭示钙敏感受体激活在心肌缺血/再灌注损伤中作用。 关 键 词(用分号分开,最多 5个) 钙敏感受体;心肌;大鼠;精胺;钙爆炸 国家自然科学基金申请书 第 3 页 共 28 页 项目组主要成员 编号 姓 名 出生年月 性别 职 称 学 位 单位名称 电话 E-mail 项目分工 每年工 作时间 (月) 1 徐长庆 1945 年 4 月 男 教授 学士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 xucq@ems.hrbmu.edu.c n 项目负责人 10 2 Wang Rui (王 睿) 1956 年 11 月 男 教授 博士 加拿大萨斯卡彻温大学 (306) 966-6592 wangrui@duke.usask.c a 技术指导及 部分实验 1 3 张伟华 1972 年 1 月 女 讲师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 zhangwh@ems.hrbmu.ed u.cn 分子生物学 检测 12 4 赵雅君 1964 年 7 月 女 高级实验师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-66745 48 zhaoyj@ems.hrbmu.edu .cn 心肌精胺代 谢与功能 12 5 张艳桥 1963 年 2 月 女 副教授 硕士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 zhangyq@hotmail.com 信号传导途 径 12 6 时飒 1980 年 11 月 女 助教 硕士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 shisa@ems.hrbmu.edu. cn 膜片钳实验 8 7 李弘 1976 年 5 月 女 讲师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 lihong@hotmail.com 分子生物学 检测 8 8 李全凤 1976 年 1 月 女 高级实验师 硕士 哈尔滨医科大学 0451-66745 48 liqf@ems.hrbmu.edu.c n 细胞培养和 激光共聚焦 6 9 韩丽萍 1982 年 5 月 女 硕士生 硕士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 hanglp@hotmail.com 激光共聚焦 10 10 张红雨 1984 年 12 月 男 硕士生 学士 哈尔滨医科大学 0451-6674548 zhanghy@yahoo.com.cn 生化测定 12 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 16 3 2 1 2 4 4 说明: 1. 高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请者负责填报,总人数自动生成。 说明: 2. 第一人必须是申请者,信息从前面自动读入。 国家自然科学基金申请书 第 4 页 共 28 页 经费预算 (单位:万元) 科 目 预算金额 备注(计算依据与说明) 一.研究经费 27.0000 1.科研业务费 7.0000 (1)测试/计算/分析费 2.5000 心肌钙敏感受体 mRNA 测序,引物合成,电镜检测费等 (2)能源/动力费 0.5000 水电费等 (3)会议费/差旅费 2.0000 会议费:0.4×3人次, 科研调研旅差费 0.8 (4)出版物/文献/信息传播事务费 2.0000 国内外发表费 1.2, 文献资料费 0.3,信息传播事务费 0.2, 各种评审评奖费 0.3 (5)其他 0.0000 2.实验材料费 14.0000 (1)原材料/试剂/药品购置费 12.0000 分子生物学、激光共聚焦、膜片钳、高效液谱仪等检测用各种 kit, 胶原酶,萤光探针,离子通道和信号传导通路阻断剂等, (2)其他 2.0000 高效液谱仪分离柱和流动相,高纯 CO2 气, 混合气,进口微量可 调加样器,玻璃吸管、高容积 ZIP 软盘等 3.仪器设备费 1.0000 (1)购置 1.0000 微量控温灌流装置 (2)试制 0.0000 4.实验室改装费 1.0000 膜片钳防震台改装等 5.协作费 1.0000 6.其他 0.0000 二.国际合作与交流费 3.0000 1.项目组成员出国合作交流 1.0000 项目组成员 1 人次去加拿大萨斯卡测温大学 WANG Rui 教授实验 室短期研究的国际旅费 2.境外专家来华合作交流 2.0000 加拿大 WANG Rui教授来华短期工作来往交通费和生活费 三.劳务费 2.0000 研究生劳务生活补助 025×8 人年 四.管理费 1.0000 五.其他 0.0000 经 费 总 预 算 33.0000 申 请 经 费 28.0000 其他经费来源(单位:万元) 自然科学基金其他项目资助经费 0.0000 国家其他资助经费 0.0000 其他经费资助(含部门匹配) 5.0000 合 计 5.0000 国家自然科学基金项目申请书 第 5 页 共 28 页 报告正文 (一)立项依据与研究内容(4000-8000 字): 1、 项目的立项依据(附主要的参考文献目录)。 (1)国内外研究现状及分析; 钙敏感受体(Calcium-sensing receptor,CaSR) 是一种 G 蛋白偶联受体,其主要激活剂是细胞 外钙。1993 年﹐BrownEM 等人首次从牛甲状旁腺克隆出 CaSR,论文在 Nature 上发表【1】。目前﹐钙 敏感受体的研究已成为国际研究热点。国际著名数据库 Medline收录涉及 CaSR的论文多达 7千余篇。 国内基本尚未起步,中国著名万方数据资源系统(中国数字化期刊)仅收录 1 篇有关钙敏感受体的文 章(“慢性肾功能衰竭甲旁亢大鼠甲状旁腺钙敏感受体改变”)【2】。 CaSR属于G蛋白偶联受体超家族中的C家族(mGluR、GABAB受体和信息素受体也是该家族成员)。 哺乳动物、鸟、两栖动物、爬虫动物和鱼类均有CaSR【3】。CaSR 有3个主要区域 :1)氨基端的细胞外 区(ECD):含多个糖基化位点﹐细胞外Ca2+ 或其它配体结合于此区,大多数激活和失活突变多发生该 区;2)跨膜区(TMD):7个跨膜区(此为G蛋白偶联受体的特征)和3个细胞内环;3) 细胞内COOH端尾部。 在细胞内环和COOH尾﹐有PKC和PKA的磷酸化位点【3,4】。判断某组织是否存在CaSR,可通过分子生物 学和功能性检验:(1)[Ca2+]o 增加可引起[Ca 2+ ]i增加;(2) 内钙增加来源于钙库动员;(3) 外钙内流 (经非电压敏感性通道);(4) Gd3+ 和Ca 2+ 是激动剂;(5) CaSR转录和表达的存在(用PT-PCR,免疫组 化,northern blot, western blot等证实)【5】。CaSR激活引起细胞内钙增加的主要机制是细胞内钙 库动员(ER或SR)。绝大多数CaSR→G蛋白介导的第二信使系统→钙动员增加→[Ca2+]i迅速升高(激活 PLC - IP3 [促使内钙释放];DAG [激活PKC,开放电容性钙通道,外钙内流]) 【3,5】。近年来,丝裂原 活化蛋白激酶(MAPK)和酪氨酸激酶在CaSR信号传导中的作用开始受到重视【6】。 CaSR除分布在参与机体钙稳态调节的甲状旁腺、肾脏、甲状腺C细胞、肠道上皮细胞、成骨细胞 和破骨细胞外,也广泛表达在中枢和周围神经系统、胃、食道、肝、胰腺、水晶体、脑垂体、骨髓 和外周血、乳腺和动脉平滑肌细胞等【3,5,7-16】。CaSR的功能主要是维持机体钙和其它金属离子稳态, 同时在细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程 中亦发挥重要作用【3,5,11,12,17】。CaSR基因的激活突变,可引起家族性低钙尿性高钙血症(FHH)和新生 儿严重甲状旁腺机能亢进(NSHPT)。失活突变,可见于常染色体显性甲状旁腺功能减退症(ADHH)和家 族性低血钙症【3,5】。CaR 已成为治疗因CaR活性过强或低下所致疾病的新靶点。 尽管钙敏感受体已成为研究热点,但在心肌细胞是否存在 CaSR,迄今未见报道。只有一篇论文 提到该室在进行大鼠肾脏 CaR 克隆时未在心肌细胞测出 CaR 的表达【14】。 去年﹐项目申请人徐长庆教授接受加拿大萨斯卡彻温大学医学院 Rui Wang教授的邀请﹐在其实 验室开展合作研究。该室用分子生物学方法证实,大鼠心肌细胞有 CaR的 mRNA和蛋白表达的存在(见 附图一)。徐长庆教授用 Fura-2 作为钙离子荧光探针﹐从机能学角度加以确定。实验表明﹐[Ca2+]o 浓度增加及其它 CaR 激动剂,如 Gd3+﹐spermine 等,可引起大鼠心肌细胞内游离钙增加,在阻断 Na-Ca 交换和 L-型钙通道的情况下亦然。但磷脂酶 C(PLC)的抑制剂 (U73122)和肌浆网(SR)钙泵 抑制剂(thapsigargin)则可明显降低或取消 CaR激动剂所致细胞内钙的增加。这说明在大鼠心肌细 胞确实存在 CaSR, 其导致细胞内钙的机制是通过 PLC-IP3通路引起 SR 内钙释放。这两方面实验结 果整合到一篇论文,投往著名国际性杂志,徐长庆教授是并列作者(并署名单位-哈医大)。我 们的工作是有关心肌细胞存在钙敏感受体的首例报道。 国家自然科学基金项目申请书 第 6 页 共 28 页 A. The detection of CaSR mRNA by RT-PCR in rat heart in the presence or absence of reverse transcriptase (RT). M, DNA marker; B.The detection of CaSR proteins by Western blot in rat heart using anti-CaSR antibody. C. The failure to detect CaSR proteins by Western blot in rat heart in the absence of anti-CaSR antibody. Immunohistochemical detection of CaSR in rat cardiac tissues Tissue sections of rat liver (A-C) and rat heart (D-F) were processed in the presence (A, B, D and E) or absence of anti-CaSR antibodies (C and F). 附图一 2002 年 11 月 1-5 日在广州召开了国际心脏研究会(ISHR)中国分会,与会代表 500 余人。 Circulation杂志副主编、美国Baylor医学院DeBakey心脏中心Mark L. Entman教授,J Mol Cell Cardiol 杂志副主编、美国 Cincinnati 大学 M. Ashraf 教授等 20 多位国外专家以及中国科学院韩启德院士等 20 多位国内专家就心血管病防治研究的新技术、新成果、新进展在大会上作专题报告。徐长庆教授 在大会作了有关“心肌细胞钙敏感受体与钙爆炸”的专题报告,受到与会代表欢迎,论文刊登在中 国病理生理杂志【18】。可见,我们的工作得到国内外学者的认可。 虽然我们已经证实了钙敏感受体在大鼠心肌组织的存在,但这只是―万里长征走了第一步‖,还 有许多问题,比如心肌细胞 CaSR 的种属分布,生理功能和病理意义,调控机制和特点等,有待于我 们去揭示。 我们在实验过程中已发现许多有意义的现象﹐说明 CaSR 可能在心脏生理和病理过程中发挥作 用。比如﹐灌注高钙或其它激动剂时出现钙波的心肌细胞,往往同步收缩﹐说明 CaSR可能参与了心 肌兴奋-收缩偶联;许多 CaSR 激动剂和信号传导途径的相关因子发挥生物效能﹐必需有一定细胞外 钙的存在﹐表现出钙依赖性;心肌细胞在无钙到复钙﹐常使细胞钙稳态发生破坏﹐同一时间和同一 视野的不同细胞钙波不尽相同,有的出现钙振荡,波形极象心律失常的心电图波形,说明钙敏感受 体激活可能与心律失常的发生有关(见附图 2)。 采用激光共聚焦技术,人们观察到细胞内钙增加的现象有钙振荡(calcium oscillation), 钙 火花 (calcium sparks)和钙波(calcium wave)等。它们已成为国内外研究的主题和关注热点【19】。 我们在大鼠心肌细胞 CaSR 的研究中,亦观察到上述现象,并意外地发现 CaSR 的激动剂之一的精胺 (spermine),在细胞外存在 1mM 钙离子的前提下,呈剂量依赖性引起心肌细胞内游离钙离子浓度增 加,而且高浓度(10mM)的 spermine 可引起细胞内钙离子瞬间急剧增加,出现钙爆炸( Calcium Burst) 国家自然科学基金项目申请书 第 7 页 共 28 页 现象。在荧光屏上出现如同原子弹爆炸一般的景象:蘑菇云骤然升起,爆炸后留下“尸横遍野 ”---- 到处是细胞残骸(见附图 3)。 国家自然科学基金项目申请书 第 8 页 共 28 页 钙火花偶联于心肌横小管和肌浆网的 Ryanodine 受体钙通道,是钙波引发和传播的位点,构成 心肌细胞兴奋-收缩偶联的基础[20]。我们首次观察到的“钙爆炸”与钙振荡,钙火花和钙波等有显着 不同,主要表现在:1)可导致细胞破坏;2)骤然上升的细胞内钙,可波及细胞外周地区。钙爆炸的 机制不详,除细胞内钙释放增加外,可能与局部离子强度瞬然升高或氧自由基的大量形成有关。我 们观察到,灌流液中事先加入 SOD( 超氧化物岐化酶)可防止钙爆炸的发生(见附图 3) 。探索并揭示 精胺致大鼠心肌细胞钙爆炸的机制和病理意义, 是本课题希望解决的问题。 附图 2 Ca2+ 1.0mM spermin(10mM)即刻 1min 后 附图 3 项目主持人徐长庆教授所在教研室曾承担国家七五、八五攻关课题,国家自然科学基金重点和 面上课题多项,发表论文百余篇。本项目的主要国际合作伙伴—王睿(Rui Wang) 博士,是国际著名 的心血管专家和建树颇丰的海外学人,现任加拿大萨斯卡彻温大学医学院终身教授(同时为哈医大 客座教授)和加拿大生理学会理事(业绩后详)。上述这些,为本项目的顺利实施,奠定了坚实基础。 (2)研究意义: 在我们首次证实大鼠心肌细胞存在钙敏感受体的基础上,深入研究钙敏感受体在心肌细胞的基 因表达,生理作用,信号传导途径,揭示心肌细胞 CaR 在心肌缺血/再灌注损伤中的作用和意义,提 出并验证我们提出的心肌缺血/再灌注损伤的钙敏感受体激活假说,并为新型钙敏感受体激动剂和阻 断剂的研制奠定初步的理论基础。 国家自然科学基金项目申请书 第 9 页 共 28 页 参考文献 1. Brown EM et al.Cloning and characterization of an extracellular Ca 2+ -sensing receptor from bovine parathyroid. Nature. 1993 Dec 9;366(6455):575-80. 2.宦金星,等. 慢性肾功能衰竭甲旁亢大鼠甲状旁腺钙敏感受体改变. 肾脏病与透析肾移植杂志 2000;9(3):258-259 3. Brown EM, et al. Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling.Physiol Rev. 2001 Jan;81(1):239-297. Review. 4. Conigrave AD, et al. Cooperative multi-modal sensing and therapeutic implications of the extracellular Ca 2+ -sensing receptor.Trends Pharmacol Sci. 2000 Oct;21(10):401-7 5. Wonneberger K,et al. Evidence for a calcium-sensing receptor in the vascular smooth muscle cells of the spiral modiolar artery.J Membr Biol. 2000 1;175 (3):203-12. 6. Kifor O, et al. Regulation of MAP kinase by calcium-sensing receptor in bovine parathyroid and CaR-transfected HEK293 cells. Am J Physiol Renal Physiol. 2001 Feb;280(2):F291-302. 7.Cheng I,et al. Expression of an extracellular calcium-sensing receptor in rat stomach. Gastroenterology. 1999 Jan;116(1):118-26. 8.Canaff L, et al. Extracellular calcium-sensing receptor is expressed in rat hepatocytes. coupling to intracellular calcium mobilization and stimulation of bile flow. J Biol Chem. 2001 Feb 9;276(6):4070-9. 9. Chattopadhyay N,et al. Identification and localization of extracellular Ca 2+ -sensing receptor in rat intestine. Am J Physiol. 1998 Jan;274(1 Pt 1):G122-30. 10. Rutten MJ,et al.Identification of a functional Ca 2+ -sensing receptor in normal human gastric mucous epithelial cells.Am J Physiol. 1999 Sep;277(3 Pt 1):G662-70. 11. Chattopadhyay N,et al. Evidence for extracellular calcium-sensing receptor mediated opening of an outward K+ channel in a human astrocytoma cell line (U87). Glia 1999 26(1): 64-72 12. Squires PE, et al. The extracellular calcium-sensing receptor on human beta-cells negatively modulates insulin secretion. Diabetes. 2000 Mar;49(3):409-17. 13. Cheng I, et al. 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Fill M, et al. Ryanodine receptor permeation and gating: glowing cinders that underlie the Ca 2+ spark. J Gen Physiol. 1999;114(1):159 21. Kifor O, et al. Regulation of MAP kinase by calcium-sensing receptor in bovine parathyroid and CaR-transfected HEK293 cells. 国家自然科学基金项目申请书 第 10 页 共 28 页 Am J Physiol Renal Physiol. 2001 Feb;280(2):F291-302. 22. Paschen W.Polyamine metabolism in reversible cerebral ischemia.Cerebrovasc Brain Metab Rev. 1992 ;4(1):59 30. Breitwieser GE, et al. Calcium-sensing receptor activation induces intracellular calcium oscillations. Am J Physiol Cell Physiol. 2001 Jun;280(6):C1412-21. 33. Aime-Sempe C,et al Myocardial cell death in fibrillating and dilated human right atria. J Am Coll Cardiol. 1999 Nov 1;34(5):1577-86. 2、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。 (此部分为重点阐述内容) 研究内容 (1) 钙敏感受体在大鼠心肌组织的分布和在正常生理功能中的作用。 (2) 心肌缺血/再灌注对大鼠心肌组织钙敏感受体表达的影响。 (3) 钙敏感受体激活与再灌注心律失常发生的内在关系。 (4) 钙敏感受体激活引起心肌细胞内游离钙浓度增加的机制及信号传导途径。 在我们已证实其机制是通过 PLC-IP3 的基础上,进一步是证实是通过百日咳毒素敏感性 G 蛋白, 还是通过非百日咳毒素敏感性 G 蛋白,或是两种方式均有。同时把有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK) 和酪氨酸激酶途径作为观察重点。 (5) 揭示多胺系统(包括精胺,精咪和腐胺)在心血管系统中分布,代谢和生理作用,探讨高浓 度精胺引起心肌细胞内游离钙浓度骤升并导致内钙外溢和心肌细胞发生不可逆性损伤的机制,观察 钙敏感受体激活引起心肌细胞发生钙振荡,钙波和“钙爆炸” 的特点,规律,揭示钙敏感受体激活在 心肌缺血/再灌注损伤中作用。 研究目标 在首次证实大鼠心肌细胞存在钙敏感受体的基础上,继续深入研究钙敏感受体在心肌细胞的基 因表达,生理作用,信号传导途径和病理意义,揭示心肌细胞钙敏感受体在心肌缺血/再灌注损伤中 的作用,验证我们提出的心肌缺血/再灌注损伤的钙敏感受体激活假说,使我国在该领域的研究居世 界领先水平。 拟解决的关键问题 心肌组织钙敏感受体究竟有何生理功能?其信号传导途径是什么?钙敏感受体激活与心肌细 胞的增殖,分化,凋亡(程序性细胞死亡)和病理性死亡有何关系?在什么情况下钙敏感受体可发挥 生理性功能?又在什么情况下则表现出病理性心肌损伤作用?两者之间的辨证统一关系是什么? 通过系统研究,深入探讨钙敏感受体在正常生理状态下的功能和在病理状态下的作用,揭示其 作用特点,规律和机制,为我们首次提出的心肌缺血/再灌注损伤的―钙敏感受体激活‖ 假说提供理 论依据。 国家自然科学基金项目申请书 第 11 页 共 28 页 3、 拟采取的研究及可行性分析。 (包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明) 研究方法 1) 细胞内游离钙荧光成像测定方法: 以 Fura-2/AM作为游离钙的荧光探针,340和 380nm为激发波长,用激光扫描荧光 成像仪,观察细胞外钙及其它激动剂或影响因素对心肌细胞[Ca2+ ]I 升高的影响,以便 观察有关机制和信号传导途径。 2) 心肌钙敏感受体表达的分子生物学测定方法: 用 PT-PCR技术和 Northern blot 检测心肌细胞钙敏感受体(CaSR)RNA的表达;用 Western blot 和免疫细胞组化技术观察心肌细胞 CaSR 蛋白的表达。用原位杂交进行组 织表达定位。 3) 单个心肌细胞离子电流和跨膜电位测定方法: 采用全细胞式记录方式,使用膜片钳仪和 PCLAMP 软件,观察无钙后复钙及其它钙 敏感受体对动作电位和相应天然离子电流(如 ICa ,IK1,Ito,Ikr,Iks 等)的影响。采用 基因钳仪双电极记录技术,观察其对蛙卵(oocyte) 表达的克隆离子通道的影响。测定 电流时,充分利用离子通道的电压依赖性和各种阻断剂等工具药。 4) 自由基测定方法:采用水杨酸法,利用高效液谱仪检测细胞浴槽灌流液,冠脉 流出液和心肌组织中的氢氧自由基(OH.)含量。 5) 心肌超微结构电镜检查: 观察钙敏感受体激动剂灌注对心肌形态结构(常规方 法)及钙定位(镧示踪) 的影响,并观察有无凋亡小体的出现及其规律。 6) 多道生理记录仪记录心功参数和心电图等。 技术路线 研究对象: 大鼠 研究层次: 器官水平 细胞水平 分子水平 动物模型: 心肌缺血/再灌注 单个心肌细胞 心肌细胞钙敏感受体 复制方法: 离体心脏灌流 离体心脏灌流 分子生物学技术 (预灌 - 旷置 - 复灌) (胶原酶消化) (RT-PCR 等) 实验分组: 对照组;CaR 激动剂 CaR 激动剂组 缺血/再灌注组 ( 正常 缺血 再灌注 ) 其它因素组 正常对照组 观察指标: 冠脉流出液和组织匀浆中 细胞内游离钙 CaR 的 mRNA 表达 氧自由基和 LDH 离子电流 CaR 蛋白质表达 心电图,心功能测定 细胞凋亡 (Northern,Western 等) 心肌超微结构 (Caspase-3) 国家自然科学基金项目申请书 第 12 页 共 28 页 (Ca2+ 定位,凋亡小体,免疫组化) 研究目的 揭示心肌钙敏感受体的调控机制和生理病理意义 实验方案 科研设计依据随机,对照和重复的三大原则。 根据不同情况,分别采用组间和自身前后对照,并进行相应的统计分析。 主要的实验方案如下: 1) 观察细胞外钙增加或其它钙敏感受体引起心肌细胞内游离钙升高的机制(信号传 导) : 采用胶原酶(20-30mg/40-60ml) 循环灌注的方法分离大鼠心肌细胞。用昆布氨酸 (laminine) 将细胞贴壁。用 fura-2/AM 作为萤光探针,用激光共聚焦检测系统,波长 为 340和 380nm,检测细胞内游离钙浓度。 用 NiCl2 (100mM) 阻断 Na-Ca 交换;用 CdCI3 (200µM) 阻断 L-型钙通道;用 SR 钙 泵抑制剂 thapsigargin(10µM)阻断 SOCC(钙库操纵性钙通道) 。排除钙敏感受体引起心 肌细胞内游离钙升高,与上述三种外钙内流的途径有关。 用 PLC 的抑制剂 U73122 和结构类似物 U73343 (10µM);Ryanodine (10µM) 和 Caffeine (10mM);揭示细胞内游离钙升高,是否通过 PLC-IP3 和 RyR通路引起 SR内钙 释放所致,并是否对百日咳毒素敏感。 同时重点观察心肌钙敏感受体是否也通过 MAPK 和酪氨酸激酶途径作为信号传导 途径。例如用 MAPK 特异性阻断剂 PD98059(50 µM) 是否取消钙敏感受体引起心肌细 胞内游离钙升高。 2) 探讨心肌钙敏感受体的生理功能(即在正常心肌兴奋-收缩偶联的作用) : 观察特异性 calcimimetic 激活剂(例如 NPSR-467) 和 calcilytic 失活剂(例如 NPS2143) 对正常离体心脏的心电图和心功能指标及对单个心肌细胞动作电位的影响; 用同位素标记细胞外钙,观察正常时和阻断 L型钙通道和钠钙交换时细胞内钙的浓度变 化及同位素标记者所占比例。 观察 CaSR 基因敲出小鼠(knockout mice)心肌结构和功能的改变,进一步确认心 肌钙敏感受体的正常功能。 3) 钙敏感受体与心律失常内在关系的探讨: 在观察到心肌细胞无钙复钙导致不同细胞钙波不同,甚至出现类似心律失常样钙振 荡的基础上,继续观察单个细胞动作电位和离子电流的改变,是否有早期后出极化(EAD) 或延迟后出极化(DAD) 等;离体心脏灌流,无钙灌流到复钙期间心律失常的发生情况, 以及钙通道阻断剂、钠钙交换抑制剂、钙敏感受体激动剂和阻断剂等对其的影响等。 4) 大鼠心肌钙敏感受体组织分布和缺血/再灌注对其表达的影响: 分别剪取正常大鼠心肌和缺血/再灌注大鼠心肌的不同部位(心室,心房,房室间隔 等部位) 的心肌组织。按文献(1,7,8,9,21 等)报道的方法,将剪取心肌组织液氮速 冻,均浆。提取总 RNA,并用 RT-PCR 检测 CaR mRNA 转录;用 Northern blot ,检 国家自然科学基金项目申请书 第 13 页 共 28 页 测 CaR mRNA 转录的大小; 用 Western blot 免疫印迹法,检测 CaR 的蛋白表达; 用免疫组化和原位杂交, 检测 CaR的蛋白表达和定位。 (1) RT-PCR (检测 CaR mRNA 转录) : 异硫氰酸胍法提取大鼠心肌总 RNA,逆转录合成第一链 cDNA(作为模板),根据已知大鼠肾脏 CaSR 序列设计正向和反向引物(编码 CaR 的 NH2 区片断),增扩样 本 RNA,自动测序仪双向测序,用 GeneWorks software 分析 (待测者和已知者比较) 。 (2) Northern blot (检测 CaR mRNA 转录大小) : 总 RNA 经寡聚(dT)纤维素获得富含 Poly(A)+ 的 RNA 样本,经变性和琼脂糖凝胶电泳,转移到尼龙膜。取与 RaKCaR cDNA 相一致的 Bgl II-Sac I 片 断,亚克隆到 pBlue script(SK+) 载体 ,质粒用 Bgl II 线性化。预杂交后,尼龙膜加入 32P-标记的核酸探 针 ,杂交过夜,冲洗,转移至 X-ray film 薄膜, -肌动蛋白 cDNA 探针染色 ,确定 CaR 的 mRNA 转 录大小。 (3) Western blot (免疫印迹法检测 CaR 的蛋白表达) : 分离心肌细胞,在含抑肽酶的缓冲 液中匀浆, 离心 800 g 去除细胞核, 悬浮液再离心 43,000 g 获取质膜碎片,再次用 1% Triton X-100 溶 解匀浆,Bradford 法蛋白定量, 5 µg 蛋白加入 SDS 聚丙酰胺凝胶 每个点样孔中电泳,确定片段大小 后,电印迹转染到聚偏乙烯 膜,加叠氮化钠室温 1h,继之用 CaR 第一抗体 4°C 过夜孵育,TTBS 冲洗, 在用 结合辣根过氧化物酶的二抗 孵育。化学发光法显现蛋白带,转移至 Kodak X-Omat AR 薄膜,照像, 用 SigmaGel software 对条带进行密度分析。 (4) 免疫组化 (检测CaR的蛋白表达) : 心肌样本福尔马林固定,石蜡包埋, 切片(2- 5µm ), 脱腊,PBS 清洗, 在含 H2O2 PBS 孵育,消除内源性过氧化物酶活性。然后用一抗 CaR 抗体(多克隆抗 CaR) 4°C 孵育,PBS 冲洗,用过氧化物酶标记的羊抗兔的第二抗体室温下孵育,PBS 冲洗, 0.01%亮绿逆染 色; 加盖玻片,倒置显微镜下观察并照像。 5) 钙敏感受体激动剂诱导心肌细胞损伤机制的探讨: 采用 Langendoff离体灌流装置,正常对照组和钙敏感受体激动剂组,又向下分成 正常,缺血和再灌注三组,在预灌注末期,缺血(旷置或冠脉结扎)末期和再灌注期分别 留取冠脉流出液做相应的生化指标(自由基,LDH 等)检查;再灌注结束时,取心肌作超 微结构(注意观察凋亡小体和钙定位)。 6) 观察精胺引起分离大鼠心肌细胞发生钙爆炸的规律和机制研究: 除上述判定引起细胞内游离钙升高可能机制的实验方案外,尚需观察给药方式(如 将高浓度直接加入浴槽后稀释成所需浓度;还是事先配好后经蠕动泵缓慢进入浴槽), 不同的药物浓度,加入不同保护剂(如自由基清除剂,钙通道阻断剂,细胞膜稳定剂, 能量合剂,钾通道开放剂及某些心肌保护机制明确的中药) 等对钙爆炸的影响,并检测 发生钙爆炸前后心肌细胞浴槽液中的自由基含量。 可行性分析 1) 理论上的可行性: 钙敏感受体(CaR)存在于哺乳动物各系统的许多细胞内(3),我们已首次用分子生物 学和细胞内钙测定的机能学方法,证实它在心肌细胞的存在。多胺是 CaR 的激动剂(3), 有实验表明脑缺血和再灌注细胞坏死时,多胺可由细胞释放(22)。另外,我们发现高浓 度精胺可引起大鼠心肌细胞发生―钙爆炸‖,并初步证实 SOD 可取消之。这些说明,再灌 国家自然科学基金项目申请书 第 14 页 共 28 页 注损伤可能有 CaR 激活的参与。我们已完成的研究已表明,细胞外钙增加导致细胞内钙 增加的机制之一是通过 PLC-IP3通路引起 SR 内钙释放。另有报道,在某些细胞 CaR 可 激活 MAPK 信号传导途径,后者在决定细胞周期性增生,凋亡及其它方面起关键作用 (21)。这些均说明本课题的提出和设计是有理论根据和切实可行的。 2) 技术和组织上的可行性: 本课题采用的实验方法先进,原有基础良好,学校拥有所需全部设备,课题组人 员构成合理,有关技术均有人熟悉掌握。 因此,只要能得到国家自然基金委还会的基金资助,我们将如期完成课题,使我 们提出的心肌缺血/再灌注损伤的―钙敏感受体激动‖ 假说,获得国内外同行的认可。 4、 本项目的特色与创新之处 我们用分子生物学和细胞内钙荧光标记技术,证实在心肌组织有功能性钙敏感受体的存在,这 是世界上的首例报道。 本课题在我们首次发现心肌钙敏感受体的基础上,根据有关钙敏感受体的研究进展和我们在实 验过程中发现的许多有意义的现象,继续深入研究钙敏感受体在心肌细胞的基因表达,生理功能, 信号传导途径和生理病理意义,这是国内外在这方面的初探。 无论从研究领域来看,还是从研究思路来看,本项目均有创新之处,是在填补国内外的研究空 白。本项目的实施将揭示心肌钙敏感受体和心肌缺血/再灌注损伤的内在联系,验证由我们提出的心 肌缺血/再灌注损伤的“钙敏感受体激活”假说,使我国在该领域的研究居世界领先水平 5、 年度研究计划及预期研究结果。 (包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等) 2004.1 –2004.12 (1) 钙敏感受体在大鼠心肌组织的分布和正常生理作用。 (2) 钙敏感受体激活引起心肌细胞内游离钙浓度增加的机制及信号传导途径,。 2005.1 –2005.12 (1) 心肌缺血/再灌注对大鼠心肌组织钙敏感受体表达的影响。 (2) 钙敏感受体激活与再灌注心律失常发生的内在关系。 2006.1 –2006.12 (1) 探讨钙敏感受体激活与心肌细胞凋亡的关系及引起心肌细胞 “钙爆炸” 的可 国家自然科学基金项目申请书 第 15 页 共 28 页 能机制,揭示其在心肌缺血/再灌注损伤中作用。 (2) 课题总结,申报成果。 (3) 预期研究成果 整个课题期间,Prof. Wang Rui 每年来国内工作至少 15-30 天,指导并参与课题的实施。 本课题将揭示钙敏感受体在正常大鼠心肌组织的表达分布,生理功能;心肌缺血/再灌注对心肌 细胞钙敏感受体表达的影响;钙敏感受体激活引起心肌细胞内游离钙浓度增加的机制,信号传导途 径及与细胞凋亡的关系;高浓度精胺引起心肌细胞“钙爆炸”的发生规律和机制;钙敏感受体在心肌细 胞“钙反常” 中的作用等。通过实验,验证我们提出的心肌缺血/再灌注损伤的“钙敏感受体激活”假说, 使之得到国内外同行的认同,使我国在该领域的研究居世界领先水平。 整个课题预期在国内外核心期刊发表论文 6 篇以上,其中在 SCI 收录 2 篇以上;获部省级以上 科技进步奖 1 项。 (二)研究基础与工作条件 1、 工作基础 (与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩) 课题申请人在加拿大萨斯卡彻温大学开展合作研究期间(8-12/2001),在合作伙伴-RuiWang 教 授用分子生物学方法证实了存在 CaR 的 mRNA 和蛋白表达的基础上,首次用机能学方法证实,在大鼠 心肌细胞确实存在钙敏感受体(CaR) ,其导致细胞内钙升高的机制是通过 PLC-IP3 通路。这两方面 结果整合到一篇论文,已投往著名国际性杂志,本人将是并列作者(并署名国内单位)。我们在研究 中发现许多有意义现象﹐比如在灌注高钙时出现钙波的心肌细胞,往往同步收缩;心肌细胞从无钙 到复钙常使同一时间和同一视野的不同细胞的钙波不尽相同,有的出现极象心律失常心电图波形的 钙振荡;首次观察到高浓度精胺可引起心肌细胞―钙爆炸‖ 等。我们的研究成果在 2002 年的国际心 脏研究会(ISHR)中国分会大会上作专题报告。论文刊登在中国病理生理杂志【18】。 课题申请人在加
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