半枝莲抑制肿瘤血管生成的作用及其机制研究

《癌症》ChineseJournalofCancer，2005，24(12)：1459—14631459 半枝莲抑制肿瘤血管生成的作用及其机制研究 张妮娜1， 1、 平2， 朱海杭1， 沈维干2 InhibitoryEffectsofScutellariabarbataeD．Donon TumorAngiogenesisandItsMechanism ZHANGNi—Nal，BUPin92，ZHUHal—Han91，SHENWei—Gan2 1苏北人民医院消化内科 江苏扬州225001 2扬州大学医学院 中西医结合研究所， 江苏扬州225001 』．DepartmentofGastroenterology， SubeiPeople0Hospital， Yangzhou，Ji(mgsu，225001， PR．China 2InstituteofIntegrativeTraditional ChineseandWesternMedicine， MedicalCollege， YangzhouUniversity， Yangzhott，Jiangeu，225001， PR．C^梳Ⅱ 通讯作者：r平 Correspondenceto：BUPing Tel-86～514—7978801 E—mail：boping@yzueducn 基金项目：国蒙中医药管理局资 助项目(No．2000一J129)；江苏省自 然科学基金资助项目(No． BK200I149) Grants：ResearchFoundationfrom TraditionalMedicineAdmlnistration BureauofChina(No．2000一J一29)； NaturalScienceFoundationof JiangsuProvince(NoBK2001149) 收稿日期：2005—05—09 修回日期：2005—06—30 ．基础研究· [ABSTRACT]BACKGROuND＆OBJECTIVE：Variouschemicallysynthetic anti—angiogenesisagentshaveserioussideeffectsThelraditionalChinese mediclRehasattractedconsiderableattentionbecauseofItslowtoxicityThis studywasloexploretheinhibitoryeffectsofScuteIlanabarbataeD Don．a kindoftraditionalChinesemedicinalanti—cancerherb．ontumOrangiogenesis． andinvestigateitsmechanismMETHODS：Matrigelplugandhumanumbilical vascularendotheliafcells(HUVECs)wereusedtoconstruct『几vivoandm wfr。modelsofangiogenesisloassesstheeffectofScuteIlariabarbataeD DononangiogenesisAfterculturedwithScutellariabarbataeD Don，the migrationofendothelialcellswasexaminedbyTranswellchamber：the expressionofvascularendotheliaIgrowthfactor(VEGF)lnHeLacellswas detectedbyenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)RESULTS： ScutellariabarbataeD DonsignificantlyinhibitedangiogenesisinMatrigel； thetubeformationnumberwassignificantlylowerIn20％and40％medIcated serumgroupscontainingScuteIlariabarbataeD Donthanin20％and40％ drug-freeserumgroups(56±11 vs98±13，P=0001；10±07vs134± 11，P<0001)Migratedendothelialcellswassignificantlyfewerin20％and 40％medlcaledserumgroupscontainingScuteIlariabarbataeD Donthanin 20％and40％drug—freeserumgroupsf1975±263vs 2425±206．P= 0038：1400±258vs265±465．P=0006)Whentreatedfor24hand48 h．theexpressionofVEGFinHeLaceilswassignificantlylowerin40％ medicatedserumgroupcontaIningScuteIlariabarbataeD Donthanin40％ drug—freeserumgroup(13867±950vs 19582±243，P=0006；9384± 4111 vs19368±1837．P=0036)CONCLUSl0N：ScuteIlariabarbataeD Doncouldefficientlyinhibitangiogenesisintumortissuewhichmightrelate withinhibitionofendothelialcellmigrationanddown—regulationofVEGFin tumorcells KEYWORDS：ScutellariabarbataeDDon／pharmacology；HeLacells：Vascular endothelialgrowthfactor；Angiogenesis 【摘要】背景与目的：以血管再生作为靶点的诸多化学合成药物在有效抑制血 管生成的同时具有不可抵抗的副作用．近年来国内外都在致力于从天然药物巾开 发肿瘤血管生成阻断剂。作为传统抗癌有效药物半枝莲，其阻断血管生成的作用 研究少见报道。本实验拟探讨其对肿瘤血管生成的抑制作用及其可艟的机制。方 法：采用Matfigel栓、原代人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalvascularendotheial cell，HUVEC)建立体内外血管生成模型．观察半枝莲对血管生成的影响；通过 Transwell小室趋化实验检测半枝莲对宫颈癌细胞HeLa培养上清诱导内皮细胞迁 移能力的影响；采用酶联免疫吸附法(enzyme—linkedimmunosorbentassay，ELISA) 检测半枝莲对HeLa细胞血管内皮细胞生长因子(vascularendothelialgrowth factor，VEGF)蛋白水平的影响。结果：半枝莲能明显抑制Matrigel栓内微血管的形 成；体外小管形成实验发现，20％、40％半枝莲含药血清组小管形成数为(5．6± 万方数据 1460 张妮娜，等半枝莲抑制肿瘤血管生成的作用及其机制研究 11)、(1，0±0．7)，与同浓度空白血清组(98±13和13．4-+11) 相比有屁著性差异(P值分别为0．001、0ooo)。经20％、40％ 半枝莲含药血清处理后内皮细胞迁移数分别为(1975± 2．63)、(1400-+2．58)，明显少于问浓度空白血清组(2425-+ 206和26．50±465)(P值分别为0038、0．006)。40％含药血 清作用24、48h后HeLa细胞VEGF达量分别为(13867-+ 9．50)、(93．84-+4111)．与牵白血清组(195．82-+2．43和 】93．68±J837)相比具有显著性差异(尸值分别为0006、 0036)。结论：半枝莲能有效抑制肿瘤血管生成，其机制口r能 与阻断内皮细胞迁移、下调VEGF蛋白表达有关。 关键词：半枝莲／药理学：HeLa细胞；VEGF；血管生成 中图分类号：R7302 文献标识码：A 文章编号：1000—476X(2005)12—1459—05 1971年Folkman提出实体瘤的生长及转移具 有血管依赖性，抑制血管生成可能成为治愈肿瘤的 新途径。目前国内外临床不乏有效的抗血管生成 药物，但大多有效药物在抑制血管生成的同时存在 不可抵抗的副作用．如出／凝血异常、加重心血管疾 病、影响成年妇女卵泡发育和正常的月经周期等⋯， 因而限制了其临床应用。鉴于天然药物毒副作用 小，人们开始从天然药物中寻找有效的血管生成抑 制剂，目前见诸报道的有人参皂甙R93⋯、白芨提 取物剐等。我们从临床有效方药中拆方⋯筛选出有 效肿瘤血管生成抑制药物半枝莲，探讨其抑制肿瘤 血管生成的作用及其机理。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1动物及细胞株新西兰大耳白兔8只，雌雄 各半，体重(2．5-+0．3)kg。清洁级ICR小鼠18只，雌 性，体重(17_+3)g。动物均由扬州大学动物实验中心 提供f合格证号No．SCXK(苏)2002—0009]。人宫颈 癌细胞株HeLa由扬州大学医学院沈维千副教授 惠赠。 1．1．2材料及试剂半枝莲(镇江)购}1扬州市医 药公司：人新鲜脐带由江苏省苏北人民医院产科提 供；Transwell培养小室为美国Coming公司产品；鼠 尾胶原I型、Matrigel为美国BD公司产品：碱性成 纤维细胞生长网子(basicfibroblastgrowthfactor， bFGF)、内皮细胞生长支持物(endothelialcell growthsupplement．ECGS)、I型胶原酶均为美国 Sigma公司产品；内皮细胞vWF因子相关抗原兔抗 人多克隆抗体免疫组化试剂盒、人血管内皮细胞生 长网子(vascularendothelialg'K．wthfactor，VEGF) 酶联免疫吸附测定(enzyme．1inkedimmunosorbent assav，ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物技术有 限公司：细胞培养液DMEM、M199为美国Gibco BRL公司产品：小牛血清、胎牛血清为杭州四季青 生物工程材料有限公司产品。 1．2方法 1．2．1含药m清的制备将8只新西兰大耳白兔 随机分为半枝莲及生理盐水2组，每组灌药5次， 每天2次。半枝莲组32g·kg。·d～，分2次灌胃，生 理盐水组给予等量生理盐水。连续给药2天后，晚 间禁食12h，第3天末次给药(禁食不禁水)后1h 无菌条件下心脏采血，1500r／rain离心15min，分 离上层|1Il清，同种血清混匀，56％灭活30rain，o．22 仙m滤膜抽率分装．一20％保存。 1．2．2人脐静脉内皮细胞(hmaanumbilicalvascular endothelialcell，HUVEC)的原代培养和鉴定参 照bu等⋯方法。加以改进。无菌条件下取剖宫产 新生儿脐带约20Cln，I型胶原酶37℃消化15 rain，离心收集HUVEC，M199培养基(含20％胎牛 血清，青霉素1×105u／L，链霉素100mg／L，L一谷氨 酰胺2mmol／L)于37℃、体积分数5％CO：培养箱 中培养。传代细胞培养基加入50ng／mlECGS，2-8 代用于实验测定。采用免疫细胞化学ABC法检测 vWF因子相关抗原．应用RY．2000瑞医病理图文分 析系统计算阳性细胞率。 1．2．3 Matrigel栓体内血管生成模型的建立参 照Kim等[6]方法。将200／xlMatrigel、0．1灿g成纤维 细胞生长因子、5单位肝素、半枝莲含药血清100 “l置冰上混匀后注入小鼠腹股沟皮下。空白血清 为空白对照组，每组3只小鼠。7天后断髓法处死 小鼠取出Matrigel栓，甲醛固定，梯度脱水，石蜡包 埋切片．HE染色镜下观察血管生成情况。实验重复 3次。 1．2．4HUVEC体外小管形成模型的建立将I型 胶原稀释为1mg／ml，1mmol／LNaOH调整pH为 7．0包被24孔板，37。C聚合1h，以2x105／ml密度 将HUVEC接种于24孔板，16h后铺第二层胶原， 1 h聚合后加入10％、20％、40％含药血清与无血清 M199培养液混匀．终体积1ml，每组4孔。37℃、体 积分数5％C02培养18h，100倍Olympus倒置显 微镜下观察小管形成的情况，每孔取5个视野计数 小管形成数，取平均值。 1．2．5 Transwell小室趋化实验参照Phillips等Ⅲ 方法并有所改进。Transwell聚碳酸脂膜(膜孔径为 8斗m)上加入稀释后的Matrigel20Ⅲ，37℃放置30 万方数据 张妮娜，等半枝莲抑制肿瘤血管生成的作片}及其机制研究 1461 min后聚合成凝胶。HUVEC经10％、20％、40％含药 血清作用24h后用无血清M199培养液调整细胞 密度为lxl06／ml悬液，取100trl加人上室，下室』JⅡ 人600¨lHeLa细胞培养上清，常规培养18h。取 出滤膜，擦去上层细胞，10％甲醛固定30min，HE 染色后取出滤膜，中性树脂封片，200倍光镜下计 数膜背面侵袭的细胞数，计算中间和四周共5个视 野．各组计数4份样本，求平均值。 1．2．6 ELISA法检测HeLa细胞培养上清VEGF蛋 白的表达分别取10％、20％、40％半枝莲含药血 清及空白血清作用12、24、48h，密度为2x105／ ml的HeLa细胞种于24孔板．无血清培养液作用 24h后取上清，一70℃保存。具体方法参照ELISA 试剂盒说明书．每个标本重复3孔。 1．2．7统计学方法实验数据以As表示，以 SPSS8．0软件进行统计学分析，采用t检验。 2结果 2．1 HUVEC的原代培养与鉴定 原代HUVEC镜下呈铺路石状或扁平多边形 镶嵌排列，经SABC免疫组化染色检测vWF因子 抗原．原代培养的HUVEC胞浆内均有棕色沉淀． 并以核周最为明显(图1)，vWF因子抗原检测内皮 细胞阳性率为92％。 2．2半枝莲对体内血管生成的影响 空白血清组形成丰富的微血管和较多的红细 胞．内皮细胞连接紧密。而半枝莲含药血清明显抑 制Matrigel种植体内的微血管生成，表现为Matrigel 种植体内的微血管闭锁、内皮细胞脱落、红细胞数 目减少(图2)。 图1 原代培养人脐静脉内皮细胞vWF因子阳性 (ABC×100) Figure1 PositiveexpressionofvWFfactor(inbrown)on membraneandincytoplasmofhumanumbilicalvascular endothelialcells(HUVECs)(ABCx100) 2．3半枝莲对体外小管形成的影响 空白血清在各个浓度组都可形成密度较高的 小管，20％、40％空白血清组小管形成数分别为 (9．8-+1．3)、(13．4-+1．1)。半枝莲含药血清浓度为 20％时，对小管形成即有明显影响，不仅小管数目 减少(5．6±1．1)，而且管腔不完整；浓度为40％时， 几乎无小管形成(1．0-+0．7)。两组间有显著性差异 (P