琼脂糖和聚丙烯酰氨凝胶电泳

null琼脂糖和聚丙烯酰氨凝胶电泳琼脂糖和聚丙烯酰氨凝胶电泳 提 纲提 纲电泳的基本原理和方法 影响电泳迁移率的因素 介绍几种常用电泳技术的原理、操作及应用 一、电泳的基本原理 一、电泳的基本原理 电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。 null电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。 二、主要方法二、主要方法 有支持物的电泳技术： 1、纸上电泳 2、醋酸纤维薄膜电泳 3、薄层电泳 4、非凝胶性支持体区带电泳 （支持体有：淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等) 5、凝胶支持体区带电泳 ①淀粉液 ②聚丙烯酰胺凝胶 ③琼脂糖凝胶 null 不用支持体的电泳技术： 1、Tiselius电泳 2、显微电泳 3、等电点聚焦电泳技术 4、等速电泳技术 5、密度梯度电泳 三、影响电泳迁移率的因素三、影响电泳迁移率的因素1、电场强度 2、溶液的pH值 3、溶液的离子强度 4、电渗现象 5、温度的影响 6、支持介质的筛孔 1、待分离生物大分子的性质1、待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2、电场强度 2、电场强度 电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势梯度。如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交界面的纸长为20cm，测得的电位降为200V，那么电场强度为：200V/20cm＝10V/cm。当电压在500V以下，电场强度在2～10v/cm时为常压电泳。电压在500V以上，电场强度在20～200V/cm时为高压电泳。电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量热量，应配备冷却装置以维持恒温。3、溶液的pH值 3、溶液的pH值 缓冲液的pH值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响。溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向，当缓冲液pH大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。 4、溶液的离子强度  4、溶液的离子强度  为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液pH值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在0.02－0.2，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。 另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 5、电渗 5、电渗 液体在电场中，对于固体支持介质的相对移动，称为电渗现象。由于支持介质面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则降低电泳速度。6、支持介质的筛孔6、支持介质的筛孔支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。四、电泳分析常用方法四、电泳分析常用方法（一）醋酸纤维素薄膜电泳 （二）琼脂糖凝胶电泳 碱性琼脂糖凝胶电泳 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 脉冲场琼脂糖凝胶电泳 （四）等电聚焦电泳技术 （五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 （六）IEF/SDS-PAGE双向电泳法  （一）醋酸纤维素薄膜电泳 （一）醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5μg的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。 （二）琼脂糖凝胶电泳 （二）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取来的，为一种聚合线性分子，一般含有多糖、蛋白质和盐等杂质，杂质的含量每个厂商和批号的产品不尽相同。对DNA 电泳迁移率的影响也不一样，经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂糖，其机械强度无明显变化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10～500 bP）的分离。琼脂糖凝胶的孔径取决于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳的原理 琼脂糖凝胶电泳的原理 DNA分子带负电荷，在电场中受到电荷效应、分子筛效应向正极移动过程中，因DNA分子的大小及构象差别而呈现迁移位置上的差异，对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比，电泳时加溴化乙锭，其与DNA结合形成一种荧光络合物，在254～365 nm紫外光照射下可产生桔红色的荧光，可用于检测DNA（此法可观察到凝胶中2 ng的DNA）。如有必要可从凝胶回收DNA片段，用于分子克隆或探针标记等操作。琼脂糖可制成不同孔径的凝胶，分离DNA的范围广，约200 bp～50 kb。null不同浓度琼脂糖凝胶及其分离线性DNA分子的有效范围 ⑴ 设 备 ⑴ 设 备 琼脂糖水平电泳槽 电泳仪 凝胶成像系统 微波炉小型琼脂糖水平电泳槽小型琼脂糖水平电泳槽一般用于小量核酸的检测、分离和回收大型琼脂糖水平电泳槽大型琼脂糖水平电泳槽一般用于大量核酸的分离和回收（2）试剂（2）试剂 1）电泳缓冲液（0.5 × TBE或1×TBE） 5×TBE(贮存液）：0.45mol/L Tris碱 0.45 M 硼酸 0.01 M EDTA （高压蒸汽灭菌后室温保存）。 2）载样液 6×载样液： 40％蔗糖 0.25%溴酚蓝 3）10mg/ml澳化乙锭（EB） 100mg EB溶于10ml水中 （避光保存）。 （3）操作步骤（3）操作步骤 ①琼脂糖凝胶板的制备 将1～2%琼脂糖凝胶加热溶化均匀，冷却到60～70℃加EB至浓度0.5 μg/ml，倒入制胶模具中，厚度约3～5mm，插上样品梳，检查梳子齿间和胶面有无气泡，如有可用吸管小心吸出气泡，待冷却成形后拔梳，胶块放入水平电泳槽中，缓冲液淹没胶面1～2 mm。 ②加样 5ul样品中加1ul上样缓冲液，混匀，加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA分子质量标准物（Marker）。 ③电泳 电压 ＜10 V/cm，电泳至溴酚蓝移至胶长2/3距离时，关闭电源。 ④检测 取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见桔红色DNA区带。（4）样品回收 （4）样品回收 电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需要的DNA分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回收： 1）电泳洗脱法 2）低融点琼脂糖法 3）醋酸铵溶液浸出法 4）DEAE—纤维素膜电泳法 但以上各种方法都仅仅适用于小分子量DNA片段（＜1kb ）的回收，随着DNA分子量的增大，回收量显著下降。 （5）注意事项（5）注意事项1）装梳子时，其载样孔底部的凝胶厚度为1～ 1.5mm， 以防样品渗漏。 2）TBE贮存液一般为10 X，浓度太高，贮存时易形成结 晶，影响使用浓度，所以一般配制5×贮存液。对于高 分子量DNA，TAE的分辩率高于TBE和TPE，可用于 Southern杂交中，但其缓冲能力较小。 3）琼脂糖加热时不可过于沸腾，以免水份蒸发引起凝胶浓 度改变，如发现体积减少，应立即用去离子水或二蒸水 补足，并摇匀。 4）样品孔的载样量不宜太多，以免造成DNA条带拖尾现象。 5）电压应小于5～8V/cm，因为在低电压时，线性DNA分子 迁移速率与电压成正比，此时分离效果较好。 null 6）打开电源后应检查电路是否接通，正负极是否正确，正确接通的电路，负极的铂金丝应有较多的小气泡冒出，而正极气泡较少。 7）当琼脂糖浓度较低时（<0.5%)，倒胶和电泳应在4℃进行。 8）由于EB是强致癌剂，所以一般不采用将EB直接溶于胶中的方法染色，以防造成EB的污染。而且这种方法的分辩率也要高。接触EB染色液时应戴一次性手套。 9) 254nm波长的紫外光进行观察的效果比300nm或366nm更好，但产生的切口DNA 量也较多，所以回收DNA时应用较长波长的紫外光，并尽量减少照射时间。同时紫外光对眼睛有害，观察时应戴上护目镜或防护面罩．若需计算DNA片段的准确长度，照相或扫描时应在凝胶旁边放一刻度尺，以测量DNA泳动距离。 琼脂糖凝胶中DNA的回收： DEAE—纤维素膜电泳 琼脂糖凝胶中DNA的回收： DEAE—纤维素膜电泳利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，然后紧靠目的DNA片段条带前方切一裂缝。将一长条DEAE 纤维素膜插入裂缝，继续电泳，直至目的条带中所有的DNA都收集到膜上。 此法也可以用来从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA。将一条聚丙烯酰胺凝胶放在琼脂糖凝胶中的裂缝内,前面插入一条DEAE纤维素膜，继续电泳，将目的片段转至膜上。 再从裂缝中取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度缓冲液中将DNA洗脱下来。从膜上洗脱下来的很高纯度的DNA，可用于大多数实验(如用于哺乳动物细胞转化)。 （具体操作请参考《分子克隆第三版》） （6）其它琼脂糖凝胶电泳技术（6）其它琼脂糖凝胶电泳技术碱性琼脂糖凝胶电泳 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳 脉冲场琼脂糖凝胶电泳①碱性琼脂糖凝胶电泳原理及应用①碱性琼脂糖凝胶电泳原理及应用原 理 碱性琼脂糖凝胶电泳是在高pH条件下进行的，它能引起胸腺嘧啶和鸟嘌呤残基丢失一个质子，从而阻止与其各自的配对碱基：腺嘌呤和胞嘧啶间氢键的形成。 变性的DNA保持单链状态，根据其分子大小在碱性琼脂糖凝胶中泳动。其他的变性剂如甲酰胺和尿素由于能引起琼脂糖橡胶化，因此结果往往较差。null应 用 自从碱性琼脂糖凝胶电泳问世以来，主要被用于： 1）检测反转录酶合成的cDNA的第一和第二链的大小。 2）分析S1核酸酶消化的DNA—RNA杂交体中DNA的大 小。 3）标定用于DNA切口平移的试剂。 该技术在检测DNA—RNA杂交体中的DNA长度以及 反转录酶合成的cDNA的第一和第二链的大小方面所 显示出的快速性、准确性，使其仍受到重视。 （具体操作请参考《分子克隆第三版》）②甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量②甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量参见《分子克隆》第三版P540页 （三）聚丙烯酰氨凝胶电泳（三）聚丙烯酰氨凝胶电泳 1959年Raymond和Weintraub创建了聚丙烯酰胺 凝胶电泳技术。这一技术的出现极大地提高了电泳技 术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。40多年来， 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术得到不断地发展和普及，现 在仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核 酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定 技术。 也是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”的标准 鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析 鉴定的最后、最准确的手段——"Last Check"。null由于聚丙烯酰胺凝胶电泳无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高,可检出10 ～10 mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用. -9-12null DNA在聚丙烯酰氨凝胶中的有效分离范围（1）设 备（1）设 备 垂直型电泳槽 电泳仪 凝胶成像系统 迷你垂直型电泳槽 迷你垂直型电泳槽DNA序列分析电泳槽DNA序列分析电泳槽中型双垂直电泳槽中型双垂直电泳槽（2）试 剂（2）试 剂1）30％丙烯酰胺（母液，交联度29:1）： 丙烯酰胺 29g N，N’-亚甲双丙烯酰胺 1g 加去离子水至100ml， 室温避光保存。 2）6％非变性胶（应用液,交联度29:1 ）： 30％丙烯酰胺（母液） 6ml 5×TBE 3ml 10％过硫酸胺 300ul 去离子水加至 30ml 3）10％过硫酰铵(APS)： 过硫酰铵 1g 加去离子水至10ml，4C避光保存。 4）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺) 4C避光保存。null 5） 5×TBE： Tris碱 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 加去离子水至1000ml，高压蒸气灭菌，室温保存。 6） 6×非变性载样缓冲液： 二甲苯青FF 0.025g 溴酚蓝 0.025g 0.5M EDTA(pH8.0) 300ul 蔗糖 4g 加去离子水至10ml 4C保存。 7） 固定液： 无水乙醇 50ml 冰醋酸 2．5ml 加一蒸水至500ml 8） 染色液： AgN03 1g 加一蒸水至500ml 9） 显色液： NaOH 3．75g 甲醛(30％) 2．7ml 加一蒸水至500ml（3）操作步骤 （3）操作步骤 1）选择合适的垂直电泳槽与大小相配的两块玻璃板 (其中一块为U形)，及两玻璃板间的间隔片和点样 梳。 2）用洗涤剂清洗干净两块玻璃板，烘干或晾干，然 后用无水酒精擦洗一遍。 3）装配灌胶板：在两块玻璃板间放好间隔片，在玻 璃板两边夹好夹子，插上点样梳，根据梳子的松 紧调整间隔片及夹子的位置，在两块玻璃板的底 边封好一层胶带。 null4）各浓度聚丙烯酰氨凝胶的配制 null5）封底胶： 胶液配好后，充分混匀，取出5ml胶液加入TEMED l0ul，快速混匀后迅速倒进两块玻璃板之间封底胶。 6）灌胶： 待底胶凝固后，剩余胶液内加TEMED 20ul，混匀， 将玻璃板倾斜,缓慢灌入胶液(注意灌胶时应连续,避 免产生气泡，有气泡要及时去除)。 7）胶液灌好后，在玻璃板上方插入相应的点样梳(插 梳子注意去 除梳齿下残留的气泡，且不要将梳子全 部插入胶内，留约2mm在胶外， 以免拔梳子时将胶 孔桥拔断)。 8）室温下让凝胶聚合约1-2小时。 null9）配制800ml 0.5 ×TBE电泳缓冲液（ 80ml 5×TBE 加去离子水至800ml) ，混匀后，加入上下电泳槽中。 10)小心拔下梳子，用电泳槽内的TBE冲洗胶孔(避免残留 的丙烯 酰胺再聚合，导致点样孔不整齐，影响电泳的 带形)，去掉封口的胶带以及玻璃板两边的夹子，将胶 板用固定夹固定在电泳槽上（有凹面的玻 璃朝向电泳 槽），接通电源，300 V 预电泳10分钟。 11）上样 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，在待上样的DNA样本 中加入 1／5体积的6 X非变性载样缓冲液，混匀后上 样(上样时注意不要有气泡冲散了样品，且上样速度尽 量快些，以免样品扩散)。null12）电泳 上样结束后，300V 恒压电泳，待二甲苯青FF 指示剂电泳至合适的位置后停止电泳。 13）银染 电泳结束后取下胶板，小心掀开玻板，移去间隔片，用银染法显色：将疑胶小心移入一托盘内，固定液固定10分钟→染色液染色10 分钟→一蒸水漂洗两次，每次半分钟 → 显色液显色，至出现清晰DNA产 物带型，凝胶用一蒸水漂洗一次后，转移到保鲜膜上，用保鲜膜包好。电泳结果拍照或用图像处理系统进行扫描。 （4）常见问题及对策（4）常见问题及对策null各种PAGE胶在DNA分析中的应用（四）等电聚焦电泳技术 （四）等电聚焦电泳技术 等电聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期问世的一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 现在它经常与SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳构成二维电泳中的第一向，主要用于分离蛋白质。IEF的基本原理  IEF的基本原理  在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。 可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带。 null（五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳（五）SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白分子量,是根据大多数蛋白都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所带的负电荷远远超过天然蛋白分子的负电荷，消除了不同蛋白分子的电荷效应,使蛋白分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。（六）IEF/SDS-PAGE双向电泳法  （六）IEF/SDS-PAGE双向电泳法  1）IEF/SDS-PAGE双向电泳法是在1975年Farrall 等人根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异 建立的IEF/SDS-PAGE双向电泳。其中IEF电泳为 第一向，SDS-PAGE为第二向。 2）IEF电泳结束后，将圆柱形凝胶在SDS-PAGE 所应用的样品处理液（内含SDS、β-巯基乙醇）中 振荡平衡，然后包埋在SDS-PAGE的凝胶板上端， 即可进行第二向电泳。 3）IEF/ SDS-PAGE双向电泳对蛋白质（包括核糖 体蛋白、组蛋白等）的分离是极为精细的，因此特 别适合于分离细菌或细胞中复杂的蛋白质组分。 蛋白质组分析的首要要求蛋白质组分析的首要要求将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。null生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得null蛋白质组研究的基本技术路线蛋白质样品的制备双向电泳图像分析转印至膜上的蛋白凝胶中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白质质量N端测序肽序列质谱数据肽指纹图数据搜索新的或已知蛋白蛋白转录后修饰的鉴定null二维电泳图谱