龙血竭散中龙血竭的高效液相色谱特征研究

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 26卷第 3期 Vol126　NO. 3 　　　　　　　　 重庆工商大学学报 (自然科学版 )J Chongqing Technol Business Univ1 (Nat Sci Ed) 　 　　　　　　　2009年 8月Aug12009 　　文章编号 : 1672 - 058X (2009) 03 - 0394 - 05 龙血竭散中龙血竭的高效液相色谱特征研究 蒋　蒨 1 , 张　敏 1 , 王鹏娇 1 , 高秀丽 23 , 史俊鹏 3 (1. 贵阳医学院 药学院 ,贵阳 550004; 2. 重庆科瑞制药有限责任公司 研发中心 ,重庆 400060; 3.重庆医学工业研究院有限责任公司 ,重庆 400063) 　　收稿日期 : 2009 - 03 - 01;修回日期 : 2009 - 06 - 18。 　　作者简介 :蒋 　蒨 (1982 - ) ,女 ,重庆南岸人 ,硕士研究生 ,从事药物分析研究。 　 3 通讯作者 :高秀丽 (1965 - ) ,女 ,副教授 ,硕士 ,从事药物质量及新药开发研究。 　　摘 　要 :用 HPLC法对中药制剂龙血竭散中主要成分龙血竭的指纹图谱进行了研究 ,初步建立了龙血竭 的 HPLC指纹图谱 ,并进行相似度评价 ,明该方法简单可行 ,能够有效地控制龙血竭散中龙血竭的质量。 关键词 :龙血竭 ;指纹图谱 ; HPLC;相似度 　　中国分类号 : O656 文献标志码 : A 龙血竭是名贵的中药材 ,具有活血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等功效 ,其药理作用 为抗细菌、真菌和其他微生物 ,抗氧化 ,止血、活血、降血糖等 [ 1, 2 ]。目前 ,市场上已有多个厂家以龙血竭作为 原料生产出各种剂型的成药 ,比如 :龙血竭散、龙血竭胶囊、龙血竭滴丸等 ,龙血竭是其中主要的药用活性成 分 ,因此 ,对其质量的控制 ,各个厂家基本上采用的是控制龙血竭的质量 ,而对龙血竭质量的控制手段主要 是采用薄层色谱法 [ 3 ]和高效液相色谱法对已知化合物 (如龙血素 B、龙血素 A和 B等 )进行含量测定 [ 427 ]。 但是由于受天气、气候、产地等各种因素的影响 ,龙血竭中有效生物活性成分的含量会有较显著的差异 ,从 而影响其质量。采用 HPLC法建立了龙血竭的指纹图谱 ,通过对十批龙血竭散样品的测定 ,为龙血竭散中龙 血竭的质量控制提供了依据。 1　仪器与试药 美国安捷伦 1100高效液相色谱仪 , Eclip se XDB 2C18色谱柱 ( 150mm ×4. 6 mm, 5μm )、Phenomenex2C18 保护柱 (3mm ×4. 6 mm, 5μm)。龙血素 A对照品 (中国药品生物制品检定所 ,批号 1116602200301) ,龙血素 B对照品 (中国药品生物制品检定所 ,批号 1115582200303)。乙腈为色谱纯 ,其余试剂均为分析纯。龙血竭 散样品来源于海南博大制药厂 (批号 : 20050901、20050109、06080401、06080402、06101302、20060110、 06110303、070519、20051204)。 2　方法与结果 2. 1　色谱条件 色谱柱 : Eclip se XDB 2C18色谱柱 (150 mm ×4. 6 mm )、Phenomenex2C18保护柱 (3 mm ×4. 6 mm, 5μm ) ; © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 检测波长 : 275 nm;体积流量 1. 0 mL /m in;进样体积 : 10μL;柱温 : 40 ℃;流动相 :乙腈 2水 ,梯度洗脱见表 1 。 表 1　梯度洗脱程序 t /m in 乙腈 H2O 0 25 75 30 40 60 55 45 55 2. 2　对照品溶液的制备 取龙血素 B对照品适量 ,精密称定 ,加甲醇溶解 ,制成每 1 mL含 12. 01μg的龙血素 B对照品溶液。取 龙血素 A和 B对照品适量 ,精密称定 ,加甲醇制成每 1 mL含 26. 06μg龙血素 A和 18. 01μg龙血素 B的对 照品溶液。色谱图见图 1。 12龙血素 A; 22龙血素 B a2龙血素 B对照品溶液 ; b2龙血素 A和龙血素 B对照品溶液 ; c2供试品溶液 图 1　龙血竭对照品及样品高效液相色谱图 2. 3　供试品溶液的制备 取供试品约 0. 1 g,精密称定 ,至 25 mL量瓶中 ,加甲醇 20 mL,溶解 ,定容至刻度 ,摇匀、滤过即得。色谱 图见图 1。 2. 4　重现性试验 取同一批号的龙血竭散 ,分别精密称取 6份 ,制备供试品溶液 ,分别进样 ,测得结果表明 ,各共有指纹峰 的相对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于 3% ,表明样品重现性良好。 2. 5　精密度试验 取重现性试验中同一供试品溶液 ,连续进样 6次 ,测得结果表明 :各共有指纹峰的相对保留时间和相对 峰面积的 RSD均小于 3% ,表明精密度良好。 2. 6　稳定性试验 取同一批号的龙血竭散 ,精密称量 ,制备供试品溶液 ,分别在 0、2、4、8、16、24 h进样 ,测得结果表明 ,各 共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于 3% ,表明供试品溶液在 24 h内稳定。 2. 7　指纹图谱的建立 2. 7. 1　指纹图谱的测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各 10μL,注入高效液相色谱仪 ,记录 55 m in的色谱图。色谱图 见图 2、图 3。 2. 7. 2　共有峰的确定 测定 10批龙血竭散中龙血竭的指纹图谱 ,其中 14个峰为龙血竭的共有指纹峰 , 样品中 11号峰为龙血 素 A的色谱峰 , 样品中 12号峰为龙血素 B的色谱峰 ,其响应值较高 , 色谱峰较窄 ,峰形好。因此以 12号峰 593第 3期 蒋蒨 1 ,等 :龙血竭散中龙血竭的高效液相色谱特征研究 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net (龙血素 B )作为色谱指纹图谱的参比峰 ,计算各共有指纹峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面积的 比值。结果见表 2、表 3。 表 2　10批龙血竭散的龙血竭指纹图谱中共有峰的相对保留时间 共有峰 共有峰的相对保留时间 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 平均值 RSD% 1 0. 174 8 0. 175 0 0. 174 9 0. 174 8 0. 174 8 0. 174 5 0. 174 8 0. 174 9 0. 174 8 0. 175 0 0. 174 8 0. 081 1 2 0. 187 8 0. 187 8 0. 187 6 0. 188 1 0. 188 2 0. 187 5 0. 188 7 0. 187 9 0. 187 6 0. 187 9 0. 187 9 0. 188 5 3 0. 242 1 0. 242 0 0. 241 9 0. 241 9 0. 241 8 0. 241 4 0. 241 8 0. 242 0 0. 241 9 0. 242 4 0. 241 9 0. 104 6 4 0. 323 5 0. 323 2 0. 322 9 0. 323 1 0. 323 0 0. 322 5 0. 322 8 0. 322 9 0. 322 9 0. 323 5 0. 323 0 0. 095 7 5 0. 388 5 0. 388 1 0. 387 8 0. 388 0 0. 388 0 0. 387 4 0. 388 0 0. 388 2 0. 388 3 0. 388 6 0. 388 1 0. 088 8 6 0. 430 4 0. 430 0 0. 429 7 0. 429 9 0. 429 8 0. 429 2 0. 429 9 0. 430 0 0. 430 2 0. 430 4 0. 430 0 0. 082 2 7 0. 543 7 0. 543 0 0. 542 7 0. 543 0 0. 543 2 0. 542 4 0. 543 2 0. 543 0 0. 543 1 0. 543 7 0. 577 0 0. 073 1 8 0. 558 1 0. 557 7 0. 557 4 0. 557 5 0. 557 5 0. 556 8 0. 557 5 0. 557 8 0. 558 0 0. 558 5 0. 557 7 0. 082 7 9 0. 585 8 0. 585 3 0. 585 1 0. 584 9 0. 584 9 0. 584 2 0. 584 9 0. 585 9 0. 585 5 0. 586 2 0. 585 3 0. 101 6 10 0. 877 4 0. 877 8 0. 877 3 0. 877 4 0. 877 4 0. 877 4 0. 878 1 0. 877 9 0. 878 9 0. 877 7 0. 877 7 0. 055 8 11 0. 958 8 0. 959 1 0. 958 8 0. 958 7 0. 958 8 0. 958 5 0. 958 7 0. 959 0 0. 959 2 0. 958 8 0. 958 8 0. 021 5 12 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 1 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 1. 000 0 0. 003 2 13 1. 165 3 1. 165 7 1. 166 0 1. 165 5 1. 165 7 1. 169 3 1. 167 5 1. 166 6 1. 166 0 1. 166 0 1. 166 4 0. 103 5 14 1. 219 0 1. 219 3 1. 219 5 1. 219 2 1. 220 0 1. 221 9 1. 220 8 1. 219 3 1. 219 1 1. 219 3 1. 219 7 0. 076 0 693 重庆工商大学学报 (自然科学版 ) 第 26卷 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 表 3　10批龙血竭散的龙血竭指纹图谱中共有峰的相对峰面积 共 有 峰 共有峰的相对峰面积 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 平均值 RSD% 1 313. 157 346. 155 401. 909 276. 26 292. 283 337. 86 288. 643 397. 145 449. 632 363. 948 346. 699 16. 367 9 2 610. 834 524. 921 714. 811 642. 065 559. 03 612. 856 528. 314 596. 026 693. 124 612. 578 609. 456 10. 325 4 3 583. 865 315. 39 590. 789 607. 345 612. 303 585. 838 674. 964 358. 566 451. 07 525. 134 530. 526 22. 230 3 4 459. 626 273. 312 591. 311 408. 589 355. 285 400. 833 371. 75 412. 067 436. 763 529. 715 423. 925 21. 051 2 5 1 301. 8 1 070. 38 1 241. 36 1 685. 45 1 628. 33 1 604. 23 1 887. 07 1 211. 51 1 289. 76 1 147. 19 1 406. 71 19. 355 0 6 743. 725 663. 876 899. 877 658. 139 733. 65 947. 876 1036. 45 899. 211 960. 909 871. 022 841. 474 15. 723 6 7 439. 294 464. 785 575. 835 550. 294 375. 911 544. 214 475. 082 507. 806 608. 317 576. 133 511. 767 14. 178 3 8 425. 685 347. 584 497. 292 629. 228 522. 683 596. 098 656. 888 496. 537 543. 379 450. 57 516. 594 18. 410 3 9 946. 188 751. 879 952. 193 1 380. 23 1 225. 21 1 275. 00 1 634. 73 806. 433 1 029. 79 934. 606 1 093. 63 25. 419 4 10 1 543. 80 1 008. 07 2 006. 68 1 577. 08 1 403. 32 2 045. 05 1 788. 23 1 333. 73 1 426. 57 1 577. 74 1 571. 03 19. 957 1 11 3 912. 38 2 667. 60 4 120. 09 4 730. 98 4 258. 82 4 077. 23 4 974. 64 2 171. 06 3 082. 84 4 012. 85 3 800. 85 23. 441 2 12 1 014. 48 1 091. 94 1 382. 02 1 385. 53 1 010. 65 1 416. 30 1 563. 60 1 527. 59 1 673. 56 1 455. 74 1 352. 14 17. 326 9 13 1 717. 51 1 542. 10 2 457. 01 2 788. 92 1 896. 93 2 857. 87 2 860. 83 2 525. 27 2 834. 56 2 808. 20 2 428. 92 21. 234 6 14 778. 433 1 286. 77 1 353. 80 1 423. 57 691. 326 1 608. 86 1 487. 38 2 223. 50 2 306. 28 1 538. 6 1 469. 85 35. 316 9 2. 7. 3　指纹图谱的相似度计算 指纹图谱相似度可以评定各批次或各生产厂家产品指纹图谱间的整体相似性 ,定量描述其各自化学组 成的差异与波动。实验采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统 (A版 ) ,对 10批龙血竭 散中龙血竭的相似度进行了评价。将龙血竭指纹图谱导入相似度评价软件 ,设定匹配摸版 ,进行谱峰自动 匹配 ,生成对照指纹图谱 ,进行相似度评价 ,结果见图 4和表 4。 图 4　龙血竭对照指纹图谱 表 4　10批龙血竭中龙血竭指纹图谱相似度结果 样品 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 相似度 0. 951 0. 934 0. 954 0. 955 0. 938 0. 947 0. 970 0. 879 0. 924 0. 908 793第 3期 蒋蒨 1 ,等 :龙血竭散中龙血竭的高效液相色谱特征研究 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 3　讨论 (1) 在龙血竭散的质量标准中 ,龙血竭含量测定方法的样品前处理的方法较复杂 ,操作步骤多 ,不易准 确掌握 ,对三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇 3种不同提取溶剂进行了比较选择 ,三氯甲烷和乙酸乙酯提取的样品 , 色谱峰和峰面积均少于甲醇提取的样品 ,因此 ,最终采用甲醇直接溶解的方法提取样品 ,该方法更简便易行。 (2) 为考察分析方法的可靠性 ,以龙血竭散 S1 (样品 1)为代表 ,对方法的稳定性、精密度、重现性进行了 考察。结果显示 ,该 HPLC法具有较好的稳定性、精密度、重现性。为龙血竭质量控制提供了一定的科学依 据 ,也为龙血竭质量标准的提升进行了有益的探索。 (3) 从实验中相同生产厂家的不同批次龙血竭散指纹图谱中可以看出 , 10批龙血竭散指纹图谱中主要 色谱峰的整体图貌基本一致。同时相似度评价结果表明 : 10批样品基本相似 ,个别批次仍然存在一定的差 异 (如样品 8)。因此 ,为保证龙血竭中药原料药质量的稳定性和一致性 ,应固定药材原料的来源 ,以保证龙 血竭提取工艺的稳定。 参考文献 : [ 1 ] 陈定芳 ,宋启示. 血竭资源开发的研究进展 [ J ]. 广州中医药大学学报 , 2004, 21 (6) : 4892492 [ 2 ] 蓝鸣生. 龙血竭研究进展 [ J ]. 医学文选 , 2005, 24 (6) : 105321055 [ 3 ] 王玉华 ,穆生媛 ,王伟 ,等. 薄层扫描法测定不同来源血竭中血竭素含量 [ J ]. 时珍国医国药 , 2000, 11 (12) : 107321074 [ 4 ] 李忠琼 ,向东. 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Chongqing Medical and Pharmaceutical Research Academy, Chongqing 400063, China) Abstract: To study the fingerp rint of dragon’s blood by high performance liquid chromatography, HPLC finger2 p rint of dragon’s blood was established and the sim ilarity of the fingerp rint was compared, which demonstrates that the method is simp le, accurate, and can be used to control the quality of dragon’s blood in dragon’s blood power. Key words: dragon’s blood; fingerp rint; HPLC; sim ilarity 责任编辑 :田 　静 893 重庆工商大学学报 (自然科学版 ) 第 26卷