龙血竭高效液相色谱特征研究

nan glycosides fraction (AJ2B21) , which was further isolated from AJ2B, showed significant anti2inflammatory activity and exhibited dose2dependent relationship in the dose of 5 to 20 mg·kg- 1. Conclusion: The method of bioassay2guided fractionation and isolation combined with the LC2MS2MS determ ination may be of benefit to the logical studies on the bioactive fractions or constituents of tradi2 tional Chinese materia medica. [ Key s] 　A lbizia ju librissin; lignan glycosides; LC2MS2MS; anti2inflammation [责任编辑 　牛泽宇 ] [收稿日期 ]　2007204228 [通讯作者 ]　3 高秀丽 , Tel: (0851) 6908468 龙血竭高效液相色谱特征研究 高秀丽 3 , 蒋　蒨 , 王鹏娇 , 张　敏 (贵阳医学院 药学院 , 贵州 贵阳 550004) [摘要 ]　目的 :用 HPLC法对龙血竭指纹图谱进行研究。方法 :采用色谱条件 Eclip se XDB2ODS柱 (416 mm × 150 mm, 5μm) ;流动相乙腈 2水 ,梯度洗脱进行色谱分离 ;检测波长为 275 nm;流速为 110 mL·m in - 1 ;柱温为 40 ℃,以龙血素 B作为参照物。结果 :初步建立了龙血竭的 HPLC指纹图谱 ,并进行相似度评价。结论 :方法简单可 行 ,能够有效地控制龙血竭的内在质量。 [关键词 ]　龙血竭 ;指纹图谱 ; HPLC;相似度 [中图分类号 ] R 284. 1　[文献标识码 ] A　[文章编号 ] 100125302 (2007) 1922025203 　　龙血竭为百合科植物剑叶龙血树 D racaena co2 ch inch inensis (Lour. ) S. H. Chen含脂木质部经提取 加工制成的树脂 ,含多种黄酮类 (如龙血素 A、龙血 素 B、龙血素 C)、皂苷类、甾醇类等化合物 ,具有活 血散瘀、消炎止痛、收敛止血、生肌敛疮、补血益气等 功效。药理研究显示其具有抗细菌、真菌和其他微 生物、抗氧化作用 ,止血、活血、降血糖等作用 [ 1, 2 ]。 1990年广西药学工作者将国产血竭开发成我国的 中药一类新药 ,命名为“广西血竭 ”。1999年“广西 血竭 ”的新药试行转为正式标准 ,定名为“龙血 竭 ”。目前市场上 ,龙血竭作为一种中药原料药已 有多个厂家生产。龙血竭其质量控制手段主要有薄 层色谱法 [ 3 ]和采用高效液相色谱法对已知化合物 (如龙血素 B、龙血素 A和 B等 )进行含量测定 [ 427 ]。 由于受到天气、气候、产地等各种因素的影响 ,有效 生物活性成分的含量会有较显著的差异 ,从而影响 龙血竭的质量。为了更好地控制龙血竭的质量 ,本 文首次采用 HPLC法建立了龙血竭的指纹图谱。 1　仪器与试药 美国安捷伦 1100 高效液相色谱仪 , Eclip se XDB2C18色谱柱 ( 416 mm ×150 mm, 5 μm )、Phe2 nomenex2C18保护柱 (3 mm ×416 mm, 5μm)。龙血 素 A 对照品 (中国药品生物制品检定所 , 批号 1116602200301) ,龙血素 B对照品 (中国药品生物制 品检定所 ,批号 1115582200303 )。乙腈为色谱纯 , 其余试剂均为分析纯。龙血竭原料药样品来源于不 同的厂家和不同批号 (市售购得 ,表 1)。 表 1　龙血竭测试样品 样品 批号 厂家 产地 S1 040203 云南省西双版纳制药厂 云南 S2 050105 云南省西双版纳制药厂 云南 S3 050604 云南省西双版纳制药厂 云南 S4 20060603 中国科学院版纳名盛制药厂 云南 S5 20050926 昆明大观制药厂 云南 S6 030882 昆明大观制药厂 云南 S7 050301 云南省西双版纳制药厂 云南 S8 060201 云南省西双版纳制药厂 云南 S9 050904 云南省西双版纳制药厂 云南 S10 050908 云南省西双版纳制药厂 云南 2　方法与结果 2. 1　色谱条件 Eclip se XDB 2C18 色谱柱 ( 3 mm ×416 mm , 5 μm )、Phenomenex2C18 保护柱 ( 3 mm ×416 mm, 5 ·5202· 第 32卷第 19期 2007年 10月 　　　　　　　　　 　　　 中 国 中 药 杂 志 Ch ina Journa l of Ch inese M a ter ia M ed ica 　　　　　　　Vol. 32, Issue　19 October, 2007 μm) ;检测波长 275 nm;体积流量 110 mL·m in - 1 ; 进样体积 10μL;柱温 40 ℃;流动相乙腈 2水梯度洗 脱 (0～15 m in, 1∶3; 15～30 m in, 2∶3; 30～55 m in, 9∶ 11)。 2. 2　对照品溶液的制备 取龙血素 B对照品适量 ,精密称定 ,加甲醇溶 解 ,制成 12101μg·mL - 1的龙血素 B对照品溶液。 取龙血素 A和 B对照品适量 ,精密称定 ,加甲醇制 成含 26106μg·mL - 1龙血素 A和 18101μg·mL - 1 龙血素 B的对照品溶液 ,见图 1。 2. 3　供试品溶液的制备 取样品约 011 g,精密称定 ,至 25 mL量瓶中 ,加 甲醇 20 mL,溶解 ,定容至刻度 ,摇匀 ,滤过 ,即得。 见图 1。 图 1　龙血竭对照品及样品 HPLC图 9. 龙血素 A; 10S. 龙血素 B; a. 龙血素 A和龙血素 B对照品溶液 ; b. 供试品溶液 2. 4　重现性试验 取同一批号的龙血竭 ,粉碎成细粉 ,分别精密称 取 6份 ,制备供试品溶液 ,分别进样 ,测得结果表明 , 各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的 RSD均小于 3% ,表明样品重现性良好。 2. 5　精密度试验 取重现性试验中同一供试品溶液 ,连续进样 5 次 ,测得结果表明 ,各共有指纹峰的相对保留时间和 相对峰面积的 RSD均小于 3% ,表明精密度良好。 2. 6　稳定性试验 取同一批号的龙血竭 ,粉碎成细粉 ,精密称量 , 制备供试品溶液 ,分别在 0, 2, 4, 8, 16, 24 h进样 ,测 得结果表明 ,各共有指纹峰的相对保留时间和相对 峰面积的 RSD均小于 3% ,表明供试品溶液在 24 h 内稳定。 2. 7　指纹图谱的建立 2. 7. 1　指纹图谱的测定 　分别精密吸取对照品溶 液和供试品溶液各 10μL,注入高效液相色谱仪 ,记 录 55m in的色谱图。 2. 7. 2　共有峰的确定 　按照《中药注射剂指纹图 谱研究的技术要求 (暂定 ) 》[ 8 ] ,测定 10批不 　　 图 2　1～10龙血竭的 HPLC图 相同厂家不同批次龙血竭的指纹图谱 ,其中 11个峰 为龙血竭的共有指纹峰 ,样品中 9号峰为龙血素 A 的色谱峰 ,样品中 10号峰为龙血素 B的色谱峰 ,其 响应值较高 ,色谱峰较窄 ,峰形好。因此以 10号峰 (龙血素 B )作为色谱指纹图谱的参比峰 ,计算各共 有指纹峰相对于参比峰的相对保留时间和相对峰面 积的比值。第 1～11共有峰的相对保留时间的平均 值分别为 01163 8 ( RSD 1114% ) , 01186 8 ( RSD 0151% ) , 01385 5 ( RSD 0126% ) , 01427 5 ( RSD 0121% ) , 01534 4 ( RSD 0119% ) , 01558 5 ( RSD 0111% ) , 01587 8 ( RSD 0113% ) , 01880 3 ( RSD 0109% ) , 01958 1 ( RSD 0103% ) , 11000 0 ( RSD 0100% ) , 11223 4 (RSD 0107% )第 1～11共有峰的 相对 峰 面 积 的 平 均 值 分 别 为 01511 4 ( RSD 30139% ) , 11015 5 ( RSD 70104% ) , 11553 9 ( RSD 62197% ) , 01595 8 ( RSD 24167% ) , 01793 4 ( RSD 50120% ) , 01592 7 ( RSD 35115% ) , 01775 5 ( RSD 56179% ) , 01988 0 ( RSD 33131% ) , 21923 1 ( RSD 50121% ) , 11000 0 ( RSD 0100% ) , 11537 0 ( RSD 42177% )。 2. 7. 3　指纹图谱的相似度计算 　指纹图谱相似度 可以评定各批次或各生产厂家产品指纹图谱间整体 相似性 ,定量描述其各自化学组成的差异与波动。 实验采用药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似 度评价系统 (A版 ) ,对 10批龙血竭进行相似度评 价。将龙血竭指纹图谱导入相似度评价软件 ,设定 匹配摸版 ,进行谱峰自动匹配 ,生成对照指纹图谱 , 进行相似度评价 , 相似度分别为 01846, 01970, 01908, 01892, 01932, 01860, 01857, 01960, 01946, 01951。 3　讨论 由于龙血竭所含化学成分较多且结构相近 ,采 用等度洗脱方式很难将其分开 ,故本文采用梯度洗 脱以实现良好分离。实验中考察了甲醇 2水、乙腈 2 水、甲醇 2011%磷酸、乙腈 2011%磷酸等流动相系统 ·6202· 第 32卷第 19期 2007年 10月 　　　　　　　　　 　　　 中 国 中 药 杂 志 Ch ina Journa l of Ch inese M a ter ia M ed ica 　　　　　　　Vol. 32, Issue　19 October, 2007 和梯度洗脱程序。结果表明乙腈 2水系统最佳 ,实验 中所确定的梯度程序使各色谱峰分离较好 ,保留时 间适中。 考察并比较了三氯甲烷、醋酸乙酯、甲醇 3种不 同溶剂的样品提取方法 ,结果发现三氯甲烷作为溶 剂提取样品色谱峰出峰少 ,龙血素 A和龙血素 B的 峰面积减小 ;醋酸乙酯作为溶剂提取样品色谱峰出 峰与甲醇作为溶剂提取样品色谱峰出峰的多少差不 多 ,但个别峰的面积要较后者要小些。故选用甲醇 为提取溶剂。 采用高效液相色谱仪的二极管增列阵列检测器 对样品的吸收波长进行分析。结果表明 ,低波长处 基线漂移严重 ,高波长处各组分的响应很小 ,在 275 nm检测波长下 ,基线较稳定 ,色谱峰较多 ,信息丰 富 ,且龙血竭含多种黄酮类 (如龙血素 A、龙血素 B、 龙血素 C)化合物 ,故选择 275 nm为最终检测波长。 方法学的考察为考察分析方法的可靠性 ,以龙 血竭 S1 (样品 1)为代表 ,对方法的稳定性、精密度、 重复性进行了考察。结果显示 ,该 HPLC法具有较 好的稳定性、精密度、重复性。为龙血竭质量控制提 供了一定的科学依据 ,也为龙血竭质量标准的提升 进行了有益的探索。 从实验中不同生产厂家和不同批次的龙血竭原 料药指纹图谱中可以看出 , 10批龙血竭指纹图谱中 主要色谱峰的整体图貌基本一致。同时相似度评价 结果表明 ,不同生产厂家、同一生产厂的不同批次 间 ,个别批次仍然存在一定的差异 (如样品 1、样品 6 和样品 7)。因此 ,为保证龙血竭中药原料药的质量 的稳定和一致性 ,应固定药材原料的来源、保证龙血 竭原料药提取工艺的稳定。 [参考文献 ] [ 1 ]　陈定芳 ,宋启示. 血竭资源开发的研究进展 [ J ]. 广州中医药大 学学报 , 2004, 21 (6) : 489. [ 2 ]　蓝鸣生. 龙血竭研究进展 [ J ]. 医学文选 , 2005, 24 (6) : 1053. [ 3 ]　王玉华 ,穆生媛 ,王　伟 ,杭　盖. 薄层扫描法测定不同来源血 竭中血竭素含量 [ J ]. 时珍国医国药 , 2000, 11 (12) : 1073. [ 4 ]　李忠琼 ,向　东. HPLC测定龙血竭中龙血素 A和龙血素 B的 含量 [ J ]. 华西药学杂志 , 2005, 20 (4) : 348. [ 5 ]　胡迎庆 ,付　勇 ,张庆云. RP2HPLC测定龙血竭胶囊中龙血素 A和 B的含量 [ J ]. 中国新药杂志 , 2003, 12 (2) : 112. [ 6 ]　孙胜利 ,宓鹤鸣 ,娄子洋 ,等. 影响国产血竭中龙血素 B含量测 定的干扰成分的分离鉴定 [ J ]. 解放军药学学报 , 2002, 18 ( 2) : 74. [ 7 ]　胡迎庆 ,宗　宁 ,刘岱琳. 反相高效液相色谱法测定龙血竭中 紫檀芪的含量 [ J ]. 药物分析杂志 , 2002, 22 (6) , 428. RP2HPLC character istics of dragon’s blood GAO Xiu2li, J IANG Q ian, WANG Peng2jiao, ZHANG M in (School of Pharm acy, Guiyang M edica l College, Guiyang, China) [ Abstract] 　O bjective: To study the fingerp rint of dragon’s blood resina draconis by high performance liquid chromatography. M ethod: The samp les are extracted with methanol and separated on a Eclip se XDB2C18 column (416 mm ×150 mm, 5μm) with the mobile phase of acetonitrile2H2O in gradient mode, and the flow rate was 110 mL·m in - 1 , the detection wavelength was 275 nm and the temperature of column was 40 ℃. Loureirin B was used as the reference compound. Result: HPLC fingerp rint of dragon’s blood was established and the sim ilarity of the fingerp rint was compared. Conclusion: The method is simp le, accurate, and can be used to control the quality of dragon’s blood. [ Key words] 　dragon’s blood; HPLC; sim ilarity; fingerp rint [责任编辑 　牛泽宇 ] 欢 迎 投 稿　　欢 迎 刊 登 广 告 ·7202· 第 32卷第 19期 2007年 10月 　　　　　　　　　 　　　 中 国 中 药 杂 志 Ch ina Journa l of Ch inese M a ter ia M ed ica 　　　　　　　Vol. 32, Issue　19 October, 2007