纤维素酶活力测定（酸性）

1．纤维素酶的活力单位定义： 在50℃，pH为4.8条件下，每分钟从浓度为10mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个活力单位（IU）。 2．测定原理 在50℃，pH为4.8条件下纤维素酶水解纤维素，产生分子量较小的聚合物和还原糖，还原糖可将3，5-二硝基水杨酸中的硝基还原成橙色的氨基化合物。利用比色法测出还原糖的量，从而计算出酶活力。 3．试剂和溶液 3.1 10.0mg/mL 的葡萄糖溶液 称取的无水葡萄糖1.0000g加水溶解后定容至100mL。 3.2 0.05 mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液 a、0.5mol/L柠檬酸溶液 准确称取10.50g柠檬酸完全溶解于80mL的蒸馏水中，定容至100mL，标记为A溶液； b、0.5mol/L柠檬酸三钠溶液 准确称取14.70g柠檬酸三钠完全溶解于80mL的蒸馏水中，定容至100mL，标记为B溶液； c、0.5mol/L的柠檬酸钠缓冲液 取60mL的A液与100mL的B液充分混匀，标记为C液。 d、0.05mol/L的柠檬酸盐酸性缓冲液（pH=4.80） 取C液100mL加入到800mL 的蒸馏水中，必要时用3mol/L的盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH为4.80，再定容1000mL，混匀后标记为0.05mol/L的酸性缓冲液，同时标记pH=4.80、配制日期。在4℃冰箱内保存。 3.3 1.0％CMC底物 精密称取羧甲基纤维素钠1.0000g溶于80mL0.1mol/L的酸性缓冲液中，室温下磁力搅拌至完全溶解(3小时以上)。用3mol/L盐酸溶液或3mol/L的氢氧化钠溶液调pH值为4.80，再用0.05mol/L的酸性缓冲液定容在100mL的容量瓶中。标记为1.0%酸性羧甲基纤维素钠溶液，同时标记pH=4.80、配制日期。保存在4℃的冰箱内。使用前恢复到室温并摇均。 3.4 DNS试剂 溶解10.0g 3，5-二硝基水杨酸、16g氢氧化钠和300g酒石酸钾钠于约700mL蒸馏水中，加热搅拌使完全溶解至澄清，放至常温并定容至1000mL，置棕色试剂瓶中，暗处保存一个星期后使用.(溶解所用的蒸馏水要煮沸取出溶解氧，或者加入适量的亚硫酸钠) 4．仪器和设备 4.1分析天平：感量0.0001g 4.2 精密pH计：精确至0.01 4.3 磁力加热搅拌器 4.4 分光光度计：符合GB9721有关规定，5mm比色皿 4.5 电热恒温水浴锅：30-100℃，±0.1℃ 4．6 计时器：每小时误差不超过五秒 4．7 移液器：100-1000μl 4．8 微样进量器：0-50μl 5．曲线的绘制 取8支试管按下加入试剂，稀释葡萄糖标准液；再加入5mL DNS试剂。充分混匀置沸水中煮10min，水浴冷却后，用0号试管做对照在540nm下测其它试液的吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖含量为横坐标绘制标准曲线。 管号 缓冲液量（ml） 葡萄糖标液量（ml） 葡萄糖含量（mg） 0 0.500 0 0 1 0.490 0.010 0.10 2 0.480 0.020 0.20 3 0.475 0.025 0.25 4 0.470 0.030 0.30 5 0.465 0.035 0.35 6 0.460 0.040 0.40 6．待测酶液的制 精密称取固体原酶粉1.0000g溶于80mL蒸馏水中（稀释倍数≤100倍直接用缓冲液溶解）；室温下磁力搅拌15min以上，用100mL容量瓶定容，离心后取上清液用缓冲液稀释，使其吸光度在0.2-0.25之间。 7．测定步骤 7.1 取三支试管各加入0.5mL底物，与待测酶液一起在50℃（±1℃）水浴中预热5min。 7.2在第一、二试管中各加入0.5mL的待测酶液，50℃水浴中反应10min。 7.3 在三支试管中各加入3mL 的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5mL的待测酶液。 7.4摇匀三支试管后，在沸水浴中煮10min。 7.5水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540nm条件下测第一、二支试管的吸光值。吸光值以0.2-0.25之间为宜，若不在此范围内可改变稀释倍数重做。 8．结果计算 酶活力（IU/g或IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/10/0.5）×n 式中：180指葡萄糖从微克换算成微克分子数 10指待测液与低物的反应时间 0.5指低物反应的待测酶液量 n指原酶液的稀释倍数 9．允许分析结果可以接受标准： 9.1允许总分析误差范围，两次取样并且结果相对误差小于10%。 9.2水平控制检测酶活力与标准酶活力误差小于10% 10.注意事项 10.1 分析纯葡萄糖要恒重称取 10.2 配置DNS溶液时，溶解所用的蒸馏水要煮沸取出溶解氧，或者加入适量的亚硫酸钠和苯酚