HPLC法测定银杏叶中6种黄酮成分的含量

HPLC法测定银杏叶中 6 种黄酮成分的含量 池静端　何秀峰　刘爱茹　徐礼　 (中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所 ,北京 100050) 摘要 　用反相高效液相色谱法测定了银杏叶中 6 种黄酮成分即槲皮素 (quercetin) 、异鼠李素 (isorhamnetin) 、山 萘 酚 ( kaempferol ) 、白 果 黄 素 ( bilobetin ) 、银 杏 黄 素 ( ginkgetin ) 、西 阿 多 黄 素 (sciadopitysin) 。单酚酸 B (salvianolic acid B)为内标。并对 18 个样品进行了测定。色谱柱为 Zorbax ODS 柱 ,流动相 :A. MeOH ,B. THF —H2O —HCOOH(34∶65∶1) ,梯度洗脱。流速 :110 ml·min - 1 ,检测波长 :350 nm。线性范围 0110～2157μg ,相关系数γ= 019994～019998 ,回收率 9810 %～10210 %。本法准确、快 速、重现性好 ,为生产及工艺研究提供质量控制依据。 关键词 　银杏 ;黄酮 ;反相高效液相色谱法 　　银杏 ( Gi nkgo biloba L . ) 又名公孙树 ,是最 古老的植物之一 ,有裸子植物活化石之称。据 《本草纲目》记载 ,银杏果具有敛肺平喘、止遗 尿、白带的作用[1 ] 。近 20 年来 ,药理研究表明 , 银杏叶中的黄酮成分具有扩张冠状动脉血管 , 增加脑血流量 ,改善脑营养及抗菌作用[2 ] ,有 较高的药用开发价值。国内外学者对银杏叶中 黄酮成分的定量分析方法较多 ,有比色法[3 ] 、 胶束毛细管电泳法[4 ]和 HPLC 法[5～7 ] 。在已 报道的 HPLC 法中 ,未见 6 种黄酮成分同时测 定的方法。本文首次采用反相高效液相色谱 法 ,测定了银杏叶中 6 种黄酮成分槲皮素 (quercetin , I) ,异鼠李素 (isorhamnetin , II) ,山 奈酚 ( kaempferol , III) , 白果黄素 ( bilobetin , IV) , 银杏黄素 ( ginkgetin , V ) , 西阿多黄素 (sciadopitisin , V I) 。考察了 6 种黄酮成分的提 取、分离及测定等条件。本法可用于银杏叶及 银杏叶提取物的分析。6 种黄酮结构如下 : 材 料 与 方 法 仪器、药品 　仪器 　HP 高效液相色谱系 统 : HP1090 型高效液相色谱仪 , 79994A 分析 工作站 ,1040 型二极管阵列检测器。 本文于 1996 年 9 月 23 日收到。 品 　内标物单酚酸 B (salvianolic acid B)由本所提供。6 种黄酮成分由作者从银杏叶 中提取、分离获得。经 HPLC 检查 ,纯度均在 99 %以上。 样品 　银杏提取物由徐州药厂提供。银杏 叶自采。试剂规格均为 AR 级。 ·526·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1997 ,32 (8)∶625～628 色谱条件 　色谱柱 : Zorbax ODS C18 柱 (150 mm ×4 mm ID , 5 μm ) , 流动相 : A. MeOH , B. 四氢呋喃 ( THF) —H2O —HCOOH (34∶65∶1) ,梯度洗脱 ,洗脱程序见表 1 ;流速 :1 ml·min - 1 ;检测波长 :350 nm ;色谱柱温 25 ℃。 Tab 1 　Gradients of mobile phase ( flow rate : 110 ml·min - 1) Time (min) Composition MeOH THF —H2O —HCOOH ( %) ( %) 0. 0 0. 0 100. 0 20. 0 0. 0 100. 0 26. 0 10. 0 90. 0 27. 0 10. 0 90. 0 35. 0 10. 0 90. 0 结 果 1 　流动相、内标物和检测波长的选择 比较了不同系统和比例的流动相 ,如甲醇 —水 ,甲醇 —015 mol·L - 1磷酸二氢钠 ,乙腈 — 水 ,四氢呋喃 —水 —甲酸 —甲醇等系统。结果 表明以 A. 甲醇 ,B. 四氢呋喃 —水 —甲酸 (34∶65 ∶1) 为流动相 ,梯度洗脱 ,分离效果好。图 1 为 6 种黄酮粗提物的 HPLC 色谱图。 Fig 1 　HPLC chromatogram of sample extracts and internal standard. I. Quercetin ; II. Isorhamnetin ; III. Kaempferol ; IV. Bilobetin ; V. Ginkgetin ; V I. Sciadopitisin ; IS. Salviano2 lic acid B. 试验了维生素 B12 、单酚酸 A、单酚酸 B、迷 迭香酸、大豆甙元、葛根素等为内标。结果表明 单酚酸 B 作为内标较合适 ,内标物与银杏叶中 的黄酮成分及其杂质峰不重叠。 将从银杏叶中得到的 6 种黄酮及内标物单 酚酸 B 在 UV23000 型 (岛津) 分光光度计上分 别进行光谱扫描 ,单酚酸 B 在 350 nm 波长处 吸收最强 ,而 6 种黄酮成分在 350 nm 处均有较 强吸收 ,故选择 350 nm 为检测波长。 2 　线性关系 精密称取 6 种黄酮标准品各约 10～ 20 mg ,加 THF —MeOH ( 1∶2) 溶解并定容至 10 ml。精密称取单酚酸 B 10 mg ,以甲醇溶解并 定容于 2 ml 量瓶中。分别吸取各标准溶液 10 ～60μl ,置 5 只 1 ml 量瓶中 ,各加入内标液 (5 mg·ml - 1) 60μl ,加甲醇至刻度 ,摇匀。按上述 色谱条件 ,进样 10μl 测定 ,得到 6 条直线。其 线性范围及相关系数为 I : 01107～11284 μg , γ= 019998 ; II : 01104～11041μg ,γ= 019996 ; III :01100～11920μg ,γ= 019996 ; IV :01101～ 11010μg ,γ = 019997 ; V : 01192～ 11920 μg , γ= 019994 ; V I :01115～21574μg ,γ= 019995。 3 　校正因子 精密吸取各标准溶液 50μl ,置 1 ml 量瓶 中 ,加内标液 60μl ,加甲醇至刻度、摇匀。在上 述色谱条件下进样 10μl ,测得校正因子 : I = 41941 , II = 31102 , III = 41403 , IV = 41401 ,V = 14197 ,V I = 10143。 4 　回收率及精密度试验 取等量的样品 5 份 ,其中 3 份加入一定量 混合标准液 ,依法提取、分离及测定。计算回收 率。结 果 为 I : 9810 % , II : 10210 % , III : 10011 % , IV :9817 % ,V :10412 % ,V I :9610 %。 取“校正因子项”标准混合溶液 10μl ,连续 进样 10 次 ,进行测定。计算相对标准偏差 (RSD) 为 I : 112 % , II : 118 % , III : 111 % , IV : 113 % ,V :310 % ,V I :411 %。 5 　提取条件的选择 提取方法 :首先选用不同溶剂 (甲醇、丙酮、 乙醚) 直接对银杏叶粉进行热回流提取。在 HPLC上可看出银杏叶中双黄酮含量很高 ,而 山奈酚、异鼠李素、槲皮素等单黄酮甙元的含量 很低 ,它们多以各种甙的形式存在于银杏叶中 , ·626· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1997 ,32 (8)∶625～628 无法在 HPLC 上直接检测到 ,故改用酸解后热 回流的方法。 提取溶剂 :选择甲醇、乙醇、丙酮作为溶剂 , 按“测定方法”项操作 ,测定黄酮含量。结果表 明丙酮提取效率最好。 提取时间 :曾试验了丙酮回流提取 015 , 110 ,115 ,210 h 及 210 h (提取 2 次)测定总黄酮 含量 ,结果表明回流提取 115 h 已使黄酮成分 提取完全。 6 　测定方法 准确称取银杏叶细粉 (60 目) 4 g ,加丙酮 80 ml ,25 %盐酸 20 ml ,回流 115 h ,滤过 ,滤渣 用 100 ml 丙酮冲洗 , 浓缩后加甲醇 —THF (2∶1) 于 50 ml 量瓶中 ,取适量于离心管中 ,离 心 10 min ,吸取上清液 015 ml ,加入内标液 60 μl ,加甲醇 —THF (2∶1) 溶液定容于 1 ml 量瓶 中 ,摇匀 ,进样 10μl。按上述色谱条件进行分 离测定 ,以内标法计算含量。 7 　样品分析 用本法对不同产地银杏叶及银杏提取物进 行测定 ,结果见表 2。 Tab 2 　Results of determination of crude drugs Habitat Date Contents of flavonoids ( %) I II III IV V VI Total ( %) Guangdong , Nanxiong 1994. 10 0. 015 - 0. 13 0. 10 0. 42 0. 65 1. 32 Hebei , Chengde 1994. 10 0. 41 - - 0. 02 0. 22 0. 31 0. 96 Zhejiang , Cangnan 1994. 10 0. 03 0. 011 0. 051 0. 016 0. 092 0. 13 0. 33 Shanxi , Xi’an 1994. 10 0. 062 0. 052 0. 064 0. 017 0. 13 0. 21 0. 54 Jiangsu , Xuzhou 1994 0. 01 - 0. 042 0. 016 0. 12 0. 18 0. 37 Beijing , Qianmen (1) 1995. 9 0. 047 - 0. 048 0. 04 0. 18 0. 31 0. 63 Beijing , Qianmen (2) 1995. 9 0. 054 0. 02 0. 14 0. 11 0. 33 0. 37 1. 02 Beijing , Qianmen (1) 1995. 10 0. 04 0. 019 0. 06 0. 021 0. 092 0. 013 0. 36 Beijing , Qianmen (2) 1995. 10 0. 037 - 0. 16 0. 05 0. 21 0. 25 0. 74 Beijing , Jian dingsuo (1) 1995. 9 0. 049 - 0. 088 - 0. 22 0. 31 0. 66 Beijing , Jian dingsuo (2) 1995. 9 0. 01 0. 056 0. 10 0. 035 0. 16 0. 32 0. 68 Beijing , Jian dingsuo (1) 1995. 10 0. 08 0. 035 0. 12 - 0. 08 0. 01 0. 33 Beijing , Jian dingsuo (2) 1995. 10 0. 06 0. 05 0. 067 0. 019 0. 13 0. 25 0. 53 Beijing ,Xuanwumen (1) 1995. 9 - - 0. 05 - 0. 14 0. 18 0. 37 Beijing ,Xuanwumen (2) 1995. 9 - - 0. 22 0. 031 0. 27 0. 33 0. 85 Beijing ,Xuanwumen (1) 1995. 10 0. 009 - 0. 011 0. 026 0. 11 0. 16 0. 32 Beijing ,Xuanwumen (2) 1995. 10 0. 024 - 0. 037 0. 038 0. 04 0. 21 0. 45 Jiangsu , Xuzhou (3) 5. 79 0. 81 7. 89 - 0. 91 1. 50 16. 9 (1) Male tree ; (2) Female tree ; (3) Extracts provided by factory. 　　对银杏叶样品的测定结果表明 ,雌树中的 6 种黄酮成分总量高于雄树。与文献报道[3 ]一 致。 在所测定的不同产地的样品中 ,广东南雄 产银杏叶中 6 种黄酮总含量最高 ,可能与广东 亚热带地理环境有关。 从北京不同地区、不同采集时间的银杏叶 中 6 种黄酮成分含量分析可以看出 ,9 月下旬 采集的银杏叶中 6 种黄酮含量比 10 月下旬银 杏叶中黄酮含量高。与文献[8 ]报道结果一致。 讨 论 流动相中加入一定量的酸对黄酮成分的色 谱行为影响很大。加入适量的酸可改善黄酮色 谱峰的拖尾现象 ,使峰形对称。 甲醇和四氢呋喃对山奈酚与槲皮素分离作 用不同 ,前者使山奈酚先于异鼠李素流出色谱 ·726·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1997 ,32 (8)∶625～628 柱 ,而后者则相反。但甲醇 —水系统不能使上 述两种成分完全分离 ,而甲醇 —THF —水系统 因甲醇和 THF 对两种成分的分离作用相反也 不能很好分离。THF —水系统对上述两种成 分能够获得满意的分离效果。 双黄酮成分在多数溶剂中的溶解度较小 , 而在 THF 中却能很好溶解 ,因此在配制双黄酮 标准溶液时可以选 THF 作为溶剂。 参 考 文 献 1 　中国医学科学院药物研究所编. 中药志. 第三册. 第 二版. 北京 :人民卫生出版社 ,1982∶295 2 　《全国中草药汇编》编写组编. 全国中草药汇编. 上 册. 北京 :人民卫生出版社 ,1982∶295 3 　陈秀珍. 银杏叶不同生长期总黄酮的含量测定. 广 西植物 ,1988 ,8∶363 4 　Pietta P , Mauri P , Rava A , et al . Application of micellar electrokinetic capillary chromatography to the determination of flavonoid drugs. J Chrom atogr , 1991 ,549∶367 5 　Hasler A , Sticher O , Meier B. High2perfor2 mance liquid chromatographic determination of five widespread aglycones. J Chrom atogr , 1990 ,508∶236 6 　Pietta P , Mauri P , Bruno A , et al . Identification of flavonoids f rom Gi nkgo biloba L . by HPLC with diode2array UV detection. J Chrom atogr , 1991 ,553∶223 7 　Hasler A , Sticher O , Meier B. Identification and determination of the flavonoids f rom Gi nkgo biloba by HPLC. J Chrom atogr , 1992 ,605∶41 8 　Lobstein A , Rietsch2jako L , Hang2 Berrurier M , et al . Seasonal variations of the flavonoids content f rom Gi nkgo biloba leaves. Planta Med , 1991 ,57∶430 HPLC DETERMINATION OF SIX FLAVONOID CONSTITUENTS IN GIN KGO B IL OBA L EAVES JD Chi , XF He , AR Liu and L X Xu ( Instit ute of M ateria Medica , Chi nese A cademy of Medical Sciences and Peki ng U nion Medical College , Beiji ng 100050) ABSTRACT 　Six flavonoid constituents ( quercetin , isorhamnetin , kaempferol , bilobetin , ginkgetin and sciadopitysin) were isolated from Ginkgo biloba leaves and determined by reversed phase HPLC using salvianolic acid B as internal standard. The column employed was Zorbax ODS (150 mm ×4 mm ID , 5 μm ) . The mobile phase consisted of solvent A ( methanol ) and solvent B [ tet rahydrofuran — water — formic acid ( 34∶65∶1) ] for gradient elution. The flow rate was 1 ml·min - 1 and detection was effected at 350 nm. This method is accurate , rapid and reproducible. Analytical data for various samples were given. KEY WORDS 　Ginkgo biloba L . ; Flavonoids ; RP2HPLC ·826· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1997 ,32 (8)∶625～628