探讨RhD阴性确认试验预测胎母输血综合征的临床应用

·150·JClinTransfusLabMd，Apr．2015，Vol17，No．2探讨RhD阴性确认试验预测胎母输血综合征的临床应用王玲骆宏姬艳丽【摘要】目的探讨RhD阴性确认试验预测胎母输血综合征(FMH)的临床应用，为Rh阴性孕妇预测胎母输血寻找简便、快速、可靠的诊断方法方法运用微柱凝胶免疫技术对56例Rh阴性待产妇进行RhD阴性确认试验，对确认试验阳性标本为验证其实验结果的准确性，通过运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)进行RHD基因分型结果56例Rh阴性待产妇中3例RhD阴性确认试验阳性，阳性率为5．36％，3例阳性标本基因型分析结果证实其中l例整个RHD基因缺失、1例包含2种不同的RHD等位基因(一条为RHD(1—2)CE(36)一D(710)，另一条为RHDl227A)、1例标本DNA提取失败结论RhD阴性孕妇(除弱D表现型)近期若无输血史，由于胎儿Rh(D)阳性红细胞进入母体即发生了胎儿一母体间的输血，导致RhD阴性确认试验的阳性结果，此试验可作为围产期预测胎母输血综合征的监测指标，据此推测产妇孕前常规进行E、C、c、Rh抗原鉴定【关键词】胎母输血综合征RhD阴性孕妇多重连接依赖的探针扩增(MI．PA)技术【中图分类号】R457．1R392．1【文献标识码】A【文章编号11671—2587(2015)02—0150—03胎母输血综合征(FMH)是指一定量的胎儿血经胎盘进入母体，导致胎儿或新生儿出现不同程度的贫血症状[1]目前实验室常用酸洗脱实验(Kli—haur—Btktst，KBT)作为临床早期诊断FMH的检测方法，本研究以RhD阴性产妇产前RhD阴性确认试验阳性为研究对象，通过分析阳性结果的产生原因，旨在寻找一种产前预测胎母输血更简便、快捷、经济的检测方法DOI：10．3969／j．issn．16712587．2015．02．019作者单位：225001江苏省扬州苏北人民医院输血科(王玲)；广东省广州血液中心(骆宏，姬艳丽)作者简介：王玲(1960一)，女，江苏扬州人，主管技师，学士，主要从事输血科工作，(Tl)15651055811(E—mail)15651055811@163．corn材料与方法1材料1．1标本来源：以2012年3月2013年12月本院RhD阴性待产妇为研究对象，年龄2032岁，孕周3339周，共计56例1．2试剂及仪器：WADianaAB0一CDE微柱凝胶血型卡、微柱凝胶抗人球蛋白卡(DGGl—Coombs多价卡)均由北京佰利申科贸有限公司提供；单克隆RhD(IgG)(上海血液生物医药有限公司，批号20101022、20120823；北京金豪制药股份有限公司，批号2012033012、2013073017)、IgM抗一c、IgM抗一(上海血液生物医药有限公司)，抗体筛选细胞I、Ⅱ、Ⅲ(上海血液生物医药有限公司)，ABO红冷沉淀凝血因子方法还是可行的[7]由于MB—P病毒灭活新鲜血浆制备的冷沉淀凝血因子没有标准，暂不能提供临床在今后的工作中，应不断努力探索和改良冷沉淀灭活的方法，保证冷沉淀凝血因子的质量和临床输注安全参考文献1陈会友，陈小伍，于新发，主编．简明输血治疗EM]．北京：科学出版社，2012：991．2黄宇闻，程庆文，莫琴，等．荧光与亚甲蓝联用对血浆中病毒灭活的研究[J]．中国消毒学杂志，2007，17(1)：1．3中国国家标准化管理委员会．全血及成分血质量要求Es3．中华人民共和国国家标准．GB一18469—2012，5．18(表18)4王飞王颖李一鸣等．成分分离机制备冷沉淀凝血因子[J]．中国输血杂志，2014，27(1)：44．5房景霞，刘鑫，孙绍秋等．亚甲蓝光化学法血浆病毒灭活对凝血因子Ⅷ的影响[J]．河北医药，2010，8(15)：2109．6王照军，曹红荣，窦莉清等．白细胞过滤器对新鲜冰冻血浆(FFP)主要成分及凝血因子活性变化的影响[J]．淮海医药2009，27(2)：126．7冯国基，刘鹏，杜学丽等．滤出白细胞与MB—P法病毒灭活对血浆凝血因子的影响[J]．临床输血与检验，2010，12(1)：40．(收稿日期：2014—1025)(本文编辑：廖艳秋)万方数据临床输血与检验2015年4月第17卷第2期细胞(北京金豪制药股份有限公司)；DNA提取试剂盒(批号D3494—04，德国QIAGEN公司)；MLPA相关试剂由荷兰MRC—Holland惠赠；LIZ500DNAladdr(AMI公司)；PCRPrmix(Takara公司)；BigDy末端终止3．1循环测序试剂盒(AMI公司)；PCR扩增仪(德国，Biomtra)；核酸测定仪(美国，Amrsham)；基因序列分析仪(ABI)；wA—Diana全自动配血及血型分析仪、专用孵育器、专用离心机均由北京佰利申科贸有限公司提供2方法2．1血型血清学试验：采用微柱凝胶血型卡初筛RhD阴性标本，初筛为RhD阴性的待产妇标本，采用微柱凝胶抗人球蛋白卡进行间接抗人球蛋白试验(IAT)作RhD阴性确认，1％受检红细胞50pl与不同厂家的IgG抗一D试剂50弘l加入凝胶孔中混合，用O型标准红细胞配制成1％作为阳性对照，以不含不规则抗体的AB型血清加1％O型标准红细胞作为阴性对照，置专用孵育器中孵育15min，离心观察结果，阴、阳性对照结果符合，若受检孔出现·151·凝集则判断为RhD阴性确认试验阳性血型卡RhD初筛为阴性、RhD阴性确认试验为阳性且自身对照阴性的标本确定为弱D表现型，试验方法参考文献[2]，不规则抗体筛选试验、直接抗人球蛋白试验(DAT)采用微柱凝胶抗人球蛋白卡，按照厂家提供的操作说明进行Rhc、表型采用盐水介质法进行鉴定2．2RhD以及其他血型抗原的基因型分析(ML—PA方法)：以已知基因型(CcDDE)与表型(CcDE)的标本作为对照，与2份弱D表现型待产妇标本作平行MLPA试验，并对RHD基因的拷贝数作定量分析，反应的基本实验步骤及结果分析参照已发表的相关文献进行凹J结果156例RhD阴性待产妇中，3例RhD阴性确认试验阳性，阳性率5．36％，年龄2029岁，均为第一胎、剖宫产、无输血史，3例产妇及新生儿相关的血型血清学检测结果见表1表13例产妇及其新生儿血型血清学检测结果注：新生儿溶血3项：游离、放散、直接抗人球蛋白试验(DAT)2采用MLPA方法对2例RhD阴性确认试验阳性产妇RhD以及其他血型抗原的基因型分析产妇1的基因分型Cc，但缺失整个RHD基因；产妇2包含2种不同的RHD等位基因[一条为RHD(1—2)一CE(3—6)一D(710)，另一条为RHDl227A]，基因分型CC；产妇3的标本DNA提取失败，Rh血型血清学分型结果Cc3追踪检测结果分别对产妇2、产妇3在产后45月重新采集血标本，再次进行RhD阴性确认试验，结果均为阳性讨论胎儿一母体间输血是指在已知或在无明显诱因的情况下，胎儿血液由胎盘绒毛间隙进入母体血液循环，导致胎儿失血以及母亲和胎儿发生溶血性的输血反应有学者发现胎儿向母体出血最早发生在停经56周，8周时母体出血量平均为0．33mlc“，但由于起病比较隐匿，缺乏特异性的先驱症状和诊断标准，所以产前诊断较困难，易漏诊目前用于诊断FMH的相关检查方法有KBT、母血中胎儿血红蛋白含量测定，应用流式细胞仪鉴定母血中胎儿红细胞、母血甲胎蛋白水平和多谱勒超声检查，KBT则是目前实验室检测FMH普遍应用的检查方法，而对于母胎Rh血型不合的FMH，可通过荧光标记抗D抗体与胎儿红细胞表面D抗原结合的荧光显微技术来鉴别胎儿细胞但以上方法常由于操作的复杂性、结果的准确性以及检测费用等诸多因素影响，使得临床应用难以普及文中例举的产妇1，20岁，单胎GIPl孕39周+2，因“头盆不称、妊娠合并巨大儿”剖宫产，母婴ABO和Rh(D)血型均不合，其子出生3d后全身皮肤出现轻度黄染，未发现其他异常情况，临床诊断为“ABO溶血万方数据·152·病”根据该产妇RHD基因缺失的基因分型结果，且无输血史，分析其产前血标本RhD阴性确认试验阳性，是由于胎)LRh(D)阳性红细胞进入母体即发生了胎儿一母体间的输血，提示通过RhD阴性确认试验可检测出RhD阴性孕妇血液中RhD阳性的胎儿红细胞有学者研究认为，中国汉族Rh(D)阴性妇女当其配偶为Rh(D)阳性时，子女Rh(D)阴性率约3．7％4．5％[5]，即汉族Rh(D)阴性妇女的配偶为Rh(D)阳性时，其所生子女Rh(D)阳性率约在95％以上，由此可见约95％的Rh(D)阴性孕妇(除弱D表现型)，当其所怀胎儿为Rh(D)阳性时，即可运用RhD阴性确认试验检测母体中胎儿Rh(D)阳性红细胞的存在，在一定程度上有助于FMH的预测和诊断曾有学者报道93％的FMH患者其失血量<0．5ml，约0．3％的患者失血量>30mlE6I，只有1％胎儿一母体间输血的输血量>40ml，出现贫血症状n]，而且胎儿的失血可以发生在妊娠期的任何阶段，多发生在妊娠末期或临产时[7]，目前尽管无法估计能引起RhD阴性确认试验阳性结果时患儿的最低失血量，但发生在妊娠期阶段的少量胎儿失血对胎儿不会造成太人的影响，所以胎儿少量失血导致孕妇RhD阴性确认试验阴性，检测不出孕妇血液中少量RhD阳性胎儿红细胞的存在也无大碍，而恰恰可以导致胎死宫内或严重后遗症的大量频繁胎儿血液的流失，RhD阴性确认试验则能在短时间内，简便、快速、直观、敏感地反映出，能使在第一时间作出临床诊断和处理，具有一定的实用价值，加之微柱凝胶RhD阴性确认技术克服了试管法需要充分洗涤红细胞36次繁琐的操作过程，属于基层医院均能开展的常规项目因此，RhD阴性确认试验应作为RhD阴性孕妇孕前常规检测项目，孕前若RhD阴性确认试验阴性，近期无输血史，在妊娠期的任何阶段一旦RhD阴性确认试验阳性(除弱D表现型)，即可以提示胎母之间发生输血，此试验结果可作为围生期预测、诊治FMH的监测指标有研究结果发现足月新生儿红细胞的存活期只有4j70d郅]对产妇z以及产妇3分别在产后45月重新采集血标本，再次进行RhD阴性确认试验，观察产妇产后血液中是否存在新生儿红细胞，若RhD阴性确认试验结果为阴性，说明两产妇当初临产前的血标本RhD阴性确认试验阳性结果，是由于RhD阳性胎儿红细胞进入母体即发生JClinTransfusLabMd，Apr．2015，Vol17，No．2了胎母间的输血导致的，结果产妇2以及产妇3RhD阴性确认试验再次检测仍为阳性，其中产妇2通过MLPA技术检测证实其携带DEL等位基因(1227G>A突变)和1条为RhD基因第36外显子被RHCE基因相应外显子取代导致的融合基因，表明产妇2、产妇3产前RhD阴性确认试验阳性结果并不是因RhD阳性胎儿红细胞进入母体所为，而应为弱D表现型实验室检出母血中胎儿红细胞是对FMH确诊的直接证据，对于RhD阴性产妇(弱D表现型除外)可通过RhD阴性确认试验检出母血中胎儿红细胞的存在有研究者认为，在妊娠4个月时，胎儿红细胞已可表达Rh抗原[9]，据此推测产妇孕前常规进行E、C、C、Rh抗原鉴定，在妊娠期间一旦确认产生了针对其红细胞缺失的Rh抗原(除E、C、c、抗原变异体外)，是否也能提示FMH的存在，使得预测FMH指标不仅仅局限于RhD阴性，而是通过RhE、C、C、抗原阴性确认试验，可使反映FMH客观指标的范围进一步拓宽，诊断FMH监测指标的结果更为可靠，以上种种推测和设想还有待今后进一步实践和研究参考文献1黄绍良，周敦华．小儿血液病临床手册[M]．第3版．北京：人民卫生出版社，2010：140—144．2兰炯采，陈静娴．输血免疫血液学实验技术[M]．北京：人民卫生出版社，2011：50—56．3姬艳丽，赵阳，王贞，等．高通量MLPA基因分型技术在一个Dl表型家系基因鉴定中的应用[J]．中国输血杂志，2012，25(6)：542—546．4林其德．现代生殖免疫学[M]．北京：人民卫生出版社，2006：219—220．5邵超鹏，秦建江孙国栋，等．Rh阳性个体RHD杂合性分析[J]．中华医学遗传学杂志，2011，28(1)：29—32．6赵友萍，黄醒华．胎母输血综合征对围产儿影响的研究进展EJ]．中国妇产科杂志，2008，43(8)：632—634．7林其德．现代生殖免疫学[M]．北京：人民卫生出版社，2006：219220．8刘景汉，汪德清．临床输血学[M]．北京：人民卫生出版社2011：322—323．9李勇，马学严．实用血液免疫学血型理论和实验技术[M]．北京：科学出版社，2006：412413．(收稿日期：2014—08—27)(本文编辑：廖艳秋)万方数据