琼脂糖凝胶电泳法

nullnull琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料: 琼脂糖电泳 凝胶 电泳 聚丙烯酰胺电泳 null一、实验目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。二、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 null琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以通过把分子量参照物和样品一起进行电泳而得到检测。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。 注意事项： EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静、镇定，注意样品不能混样，null三、实验材料、器具及药品 以前实验中提取的小麦总DNA和质粒样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓冲液 四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。）null⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μl于封口膜上，再加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。null⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微漂洗。 null植物总（核）DNA样品应呈现一条迁移率很小的整齐条带。质粒DNA应呈现一到三条不同构型的条带，这时明所提样品较纯。溴酚蓝前的荧光区是样品中存有的RNA杂质。若质粒DNA样品在迁移率小的地方还有荧光条带，表明质粒DNA样品中有细菌的染色体DNA污染。null（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。琼脂糖电泳的优点null配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的DNA分子大小来确定。 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围 null常用的电泳缓冲液4℃ 保存备用.null Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液常用的6X载样缓冲液nullnullnull