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核酸分子杂交技术手册

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核酸分子杂交技术手册 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 1 核酸分子杂交技术 一、 概述 前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键(主要是氢 键)的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链 的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程 ...
核酸分子杂交技术手册
热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 1 核酸分子杂交技术 一、 概述 前面已经介绍了核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过碱基对之间非共价键(主要是氢 键)的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链 的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程 度的同源性)就可以形成杂交双链。分子杂交可在 DNA 与 DNA、RNA 与 RNA 或 RNA 与 DNA 的二条单链之间进行。由于 DNA 一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链 DNA 分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高 pH 值来实现。使单链聚合双 链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同 位素或非同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。 核酸杂交技术基本上是 Hall 等 1961 年的工作开始的,探针与靶序列在溶液中杂交,通过平 衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确,但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton 等 1962 年设计了第一种简单的固相杂交方法,称为 DNA-琼脂技术。变性 DNA 固定在琼脂中, DNA 不能复性,但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短 DAN 或 RNA 分子与胶中 DNA 杂交过夜,然后将胶置于柱中进行漂洗,去除游离探针,在高温、低盐条件下 将结合的探针洗脱,洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂 交实验。60 年代末,Britten 等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中 DNA 的 复性以比较不同来源核酸的复杂度,典型的方法是:从不同生物体(细菌、酵母、鱼和哺乳动物 等)内分离 DNA,用水压器剪切成长约 450 核苷酸(nt)的片段。剪切的 DNA 液(含 0.12mol/L 磷酸盐缓冲液或 0.18mol/l Na+),经煮沸使 dsDNA 热变性成 ssDNA。然后冷至约 60℃,在此温 度孵育过程中,测定溶液一定时间内的 UV260nm 的吸光度(减色效应)来监测互补链的复性程 度。通常该实验可比较不同来源生物 DNA 的复性速率,并可建立序列复杂度与动力学复杂度间 的关系。 60 年代中期 Nygaard 等的研究为应用标记 DNA 或 RNA 探针检测固定在硝酸纤维素(NC) 膜上的 DNA 序列奠定了基础。如 Brown 等应用这一技术评估了爪蟾 rRNA 基因的拷贝数。RNA 在代谢过程中被 3H尿嘧啶标记,并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA杂交,继而用RNase 处理,消化非特异性结合的 RNA。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量 DNA 杂 交的 RNA 量即可评估 rRNA 基因数。由于当时缺乏特异探针,这种方法不能用于研究其它特异 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 2 基因的表达,这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。 进入 70 年代早期,许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如,对特异基因转录产 物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的 Poly U –Sepharose 和寡(dT)-纤维素使人 们能从总 RNA 中分离 Poly A+ RNA。用 mRNA 的经纯化技术可从网织红细胞总 RNA 中制备α- 和β-珠蛋白 mRNA 混合物。这些珠蛋白 mRNA 首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的 表达。由于制备 cDNA 探针很繁琐,所获得 cDNA 的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来 源是使分子杂交技术进一步推广的基础。 70 年代末期到 80 年代早期,分子生物学技术有了突破性进展,限制性内切酶的发展和应用 使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生,尤其是质粒和噬菌体 DAN 载体的构建,使特异性 DNA探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA文库和 cDNA文库中获得特定基因克隆, 只需培养细菌,便可提取大量的探针 DNA。迄今为止,已克隆和定性了许多特异 DNA 探针。 由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生,现在可常规制备 18~100 个碱基的寡核苷酸探 针。应用限制酶和 Southern 印迹技术,用数微克 DNA 就可分析特异基因。特异 DNA 或 RNA 序 列的量和大小均可用 Southern 印迹和 Northern 印迹来测定,与以前的技术相比,大大提高了杂交 水平和可信度。 尽管取得了上述重大进展,但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题,必须提高检测单 拷贝基因的敏感性,用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时 间,这样,就需要在以下三方面着手研究:第一,完善非放射性标记探针;第二,靶序列和探针 的扩增以及信号的放大;第三,发展简单的杂交方式,只有这样,才能使 DNA 探针实验做到简 便、快速、低廉和安全。 二、探针-靶反应 从化学和生物学意义上理解,探针是一种分子,它带有供反应后检测的合适标 记物,并仅与特异靶分子反应。抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲和素-生物 素、受体-配基(ligand)以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应。蛋白质探 针(如抗体)与特异靶分子是通过混合力(疏水、离子和氢键)的作用在少数特异位 点上的结合,而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同,通过氢键在几 十、几百甚至上千个位点上的结合。因为有机溶液可降低杂交体的稳定性,所以,疏 水反应对互补核酸链的结合也有一定的作用,但对其特异性影响甚微。 核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍可能进行碱基配对,这取决于修饰的部位和 修饰的性质。这一特性有助于理解非放射性核酸探针标记物的设计和 125I 与 DNA 探针的化学结 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 3 合。能与核酸结合的单一原子有银、溴和碘等,这些元素可与嘧啶(胸腺嘧啶除外)环的 C-5 位 或嘌呤环的 C-8 位反应而不影响氢键的形成。溴亦可与胸腺嘧啶的 C-6 位结合。而胞嘧啶的 C-4 和腺嘌呤的 N-6 就不能被修饰,否则会影响碱基配对,尽管 C 的 N-4 位和 A 的 N-6 位参与了氢键 形成,但它们也是标记位点。这是因为标记的探针每 1kb 只掺入 10~30 个修饰碱基,即仅 4%~ 12%的单个碱基被修饰的类似物取代了。尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在,但对整个杂 交分子的稳定性影响很小。防止氢键破坏的一种方法就是修饰探针,即探针克隆入 M13 载体中, 只修饰载体区而不修饰插入片段。当用放射性同位素 32P 和 35S 标记核酸时,由于同位素是掺入 核酸骨架的磷酸二脂键中,因此碱基未发生任何修饰。在 5’端的磷酸基团上可进行化学修饰, 这是标记寡核苷酸探针的有效方法。因为这种方法是在一个探针分子上标记一个检测的基团,所 以,对长的克隆探针不适用。 此外,还可利用修饰的碱基来增加杂交的稳定性和特异性。2-氢基腺嘌呤可替代寡核苷酸探 针中的腺嘌呤通过形成 3 个氢键以增加杂交体的稳定性。另外,在 G-C 丰富的 RNA 探针中,可用 次黄嘌呤代替鸟嘌呤以获得特异的杂交。因为次黄嘌呤和鸟嘌呤间只形成 2 个氢键,有效地降低 了杂交体的 Tm 值,这样,Tm 值与杂交温度更接近,杂交的严格性就增加了,因此,也就增加了 特异性。 很显然,结合位点的不同和可检测基团与检测系统的不同,可派生出很多核酸探针标记方法。 这是由核酸的化学结构和性质所决定的。只有在对核酸分子的探针-靶反应的化学本质有了深入 了解之后,才能更好地理解后面的内容。 三、核酸探针的种类 基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类,根据探针的核酸性 质不同又可分为 DNA 探针,RNA 探针,cDNA 探针,cRNA 探针及寡核苷酸探针等几类,DNA 探针还 有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。 (一)DNA 探针 DNA 探针是最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链 DNA 或单链 DNA 探针。现已获得 DNA 探针数量很多,有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞 DNA 探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。这些 DNA 片段须是特异的,如细菌的毒力因子基因探针和人类 Alu 探针。这些 DNA 探针的获得 有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例,目前分子杂交技术用于细菌的分类 和菌种鉴定比之 G+C 百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向。加之分子 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 4 杂交技术的高敏感性,分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组 大小约 5×106bp,约含 3000 个基因。各种细菌之间绝大部分 DNA 是相同的,要获得 某细菌特异的核酸探针,通常要采取建立细菌基因组 DNA 文库的办法,即将细菌 DNA 切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的 DNA 作探针来筛选,产生杂交信号的克隆被剔除,最后剩下的不与任何其它细菌杂交 的克隆则可能含有该细菌特异性 DNA 片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定, 亦可经 DNA 序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性 DNA 探针,常常 是比较繁琐的。探针 DNA 克隆的筛选也可采用血清学方法,所不同的是所建 DNA 文库 为可表达性,克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原,然后用来源细菌的多克隆抗 血清筛选阳性克隆,所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选,最后只与本细 菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段,它所编码的蛋白是该菌种 所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。 对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该 方法的第一步是分离纯化蛋白质,然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列,然后根 据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在 DNA 文库中筛选,阳性克隆即是目标蛋白的编码 基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞 DNA 组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序 列,而原核则没有。因此,真核基因组 DNA 探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于 cDNA 探针。 DNA 探针(包括 cDNA 探针)的主要优点有下面三点:①这类探针多克隆在质粒载体中,可以 无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。②DNA 探针不易降解(相对 RNA 而言),一般能有效抑制 DNA 酶活性。③DNA 探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移,随机引物法, PCR 标记法等,能用于同位素和非同位素标记。 (二)cDNA 探针 cDNA(complementary DNA)是指互补于 mRNA 的 DNA 分子。cDNA 是由 RNA 经一种称为逆转录 酶(reverse transcriptase)的 DNA 聚合酶催化产生的,这种逆录酶是 Temin 等在 70 年代初研 究致癌 RNA 病毒时发现的。该酶以 RNA 为,根据碱基配对原则,按照 RNA 的核苷酸顺序合成 DNA(其中 U 与 A 配对)。这一途径与一般遗传信息流的方向相反,故称反向转录或逆转录。携 带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后,病毒 RNA 在逆转录酶的催化下转化成双链 cDNA,并进而整合 人宿主细胞染色体 DNA 分子,随宿主细胞 DNA 复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。 在静止状态下,可被复制多代,但不被表达,故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化,则该病 毒大量复制,如其带有癌基因,还可能诱发细胞癌变,后来发现逆转录酶不仅普遍存在于 RNA 病 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 5 毒中,而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以 dNTP 为底物,RNA 为模板,tRNA(主要是色氨酸 tRNA)为引物,在 Trna3’-OH 末端上,5’-3’ 方向,合成与 RNA 互补的 DNA 单链,称为互补 DNA(cDNA),单链 cDNA 与模板 RNA 形成 RNA-DNA 杂交体。随后在逆转录酶的 RNase H 活性作用下,将 RNA 链水解成小片段。cDNA 单链的 3’末端 回折形成一个小引物末端,逆转录酶又以第一条 cDNA 链为模板再合成第二第 cDNA 链,至此,完 成逆转录全过程,合成双链 cDNA。 逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术,广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒 中提取的逆转录酶已商品化,最常用的有 AMV 逆转录酶。利用真核 Mrna3’末端存在一段聚腺苷 酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸(oligo(dT))用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于 mRNA 的 cRNA 链,然后再用 RNase H 将 mRNA 消化掉,再加入大肠杆菌的 DNA 聚合酶 I催化合成另一条 DNA 链,即完成了从 mRNA 到双链 DNA 的逆转录过程。 所得到的双链 cDNA 分子经 S1 核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(linker),再 经特定的限制酶消化产生粘性末端,即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬 菌体 DNA,如λgt,EMBL 和 Charon 系列等。用这类载体可以得到包含 104 以上的转化子的文库, 再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的 DNA 探针不含有内含子序列。因 此尤其适用于基因表达的检测。 (三)RNA 探针 RNA 探针是一类很有前途的核酸探针,由于 RNA 是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应效 率极高。早期采用的 RNA 探针是细胞 mRNA 探针和病毒 RNA 探针,这些 RNA 是在细胞基因转录或 病毒复制过程中得到标记的,标记效率往往不高,且受到多种因素的制约。这类 RNA 探针主要用 于研究目的,而不是用于检测。例如,在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因组 DNA 克隆时,因无 DNA 探针可利用,就利用 HIV 的全套标记 mRNA 作为探针,成功地筛选到多株 HIV 基因组 DNA 克隆。又如进行中的转录分析(nuclear run on transcrip-tion assay)时,在体 外将细胞核分离出来,然后在α-32P-ATP 的存在下进行转录,所合成 mR-NA 均掺入同位素而得 到标记,此混合 mRNA 与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的 DNA 进行杂交,便可反映 出该基因的转录状态,这是一种反向探针实验技术。 近几年体外转录技术不断完善,已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一 类新型载体 pSP和 pGEM,这类载体在多克隆位点两侧分别带有 SP6启动子和 T7启动子,在 SP6RNA 聚合酶或 T7RNA聚合酶作用下可以进行RNA转录,如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA片段, 则可以此 DNA 两条链中的一条为模板转录生成 RNA。这种体外转录反应效率很高,在 1h 内可合成 近 10μg 的 RNA 产生,只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的 NTP,则所合成的 RNA 可 得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 6 值得一提的是,通过改变外源基因的插入方向或选用不同的 RNA 聚合酶,可以控制 RNA 的转 录方向,即以哪条 DNA 链以模板转录 RNA。这种可以得到同义 RNA 探针(与 mRNA 同序列)和反义 RNA 探针(与 mRNA 互补),反义 RNA 又称 cRNA,除可用于反义核酸研究外,还可用于检测 mRNA 的表达水平。在这种情况下,因为探针和靶序列均为单链,所以杂交的效率要比 DNA-DNA 杂交高 几个数量级。RNA 探针除可用于检测 DNA 和 mRNA 外,还有一个重要用途,在研究基因表达时,常 常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录,有时还存在反向 转录(即生成反义 RNA),这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外,在真核系统, 某些基因也存在反向转录,产生反义 RNA,参与自身表达的调控。在这些情况下,要准确测定正 向和反向转录水平就不能用双链 DNA 探针,而只能用 RNA 探针或单链 DNA 探针。 综上所述,RNA 探针和 cRNA 探针具有 DNA 探针所不能比拟的高杂交效率,但 RNA 探针也存在 易于降解和标记方法复杂等缺点。 (四)寡核酸探针 前述三种探针均是可克隆的,一般情况下,只要有克隆的探针,就不用寡核苷酸探针。在 DNA 序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时,也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸 探针特异性强,复杂度也高,从统计学角度而言,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列 少,克隆探针的另一优点是,可获得较强的杂交信号,因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检 测标记基因更多。但是,较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基 或少数碱基不同的两序列,克隆探针不能区分,往往杂交信号相当。这既是其优点,又是其缺点。 优点是当用于检测病原微生物时,不会因病毒或细菌 DNA 的少许变异而漏诊,缺点则是不能用于 点突变的检测。这种情况下,通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。 合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点:①由于链短,其序列复杂度低,分子量小,所以 和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短,如 20nt 的寡核苷酸探针在浓度为 100ng/ml,靶序 列为 1~100pg、1kb 片段或 3×10-18~3×10-16mol/L 时,达到最大程度的杂交只需 10min,而用 2kb 的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需 16h。②寡核苷酸探针可识别靶序列内 1 个碱基 的变化,因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的 Tm 值。③一次可大量合成寡核苷酸 探针(1~10mg),使得这种探针价格低廉,与克隆探针一样,寡核苷酸探针能够用酶学或化学 方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异,但通过细心筛选序列和/或选择 相对长的序列(>30nt)亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有 18~40 个碱基,目前的合成仪可有效地合成至少 50 个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。 ①长 18~50nt,较长探针杂交时间较长,合成量低;较短探针特异性会差些。 ②碱基成分:G+C 含量为 40%~60%,超出此范围则会增加非特异杂交。 ③探针分子内不应存在互补区,否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 7 ④避免单一碱基的重复出现(不能多于 4 个),如-CCCCC-。 ⑤一旦选定某一序更符合上述,最好将序列与核酸库中核酸序列比较,探针序列应与含 靶序列的核酸杂交,而与非靶区域的同源性不能超过 70%或有连续 8 个或更多的碱基的同源,否 则,该探针不能用。 按上述原则选出的探针会增加成功的机会,选定后进行合成与标记,并摸索合适的杂交条件。 方法是制备几张点有特异靶 DNA 和不相关 DNA 的膜,各膜分别在不同温度下与探针杂交,特异靶 DNA 杂交信号强而非特异 DNA 不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。在进行点突变检测杂交 的反应时,洗膜条件和温度物选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶 DNA 与探针产生 强的杂交信号而突变型靶 DNA 则不产生杂交信号,这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。 寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限 制(oligonucleotide restriction)的技术。该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别 位点时才有效。例如,镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第 6 个寡码子由 GAG 变成 GTG,从 而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的β-珠蛋白功能异常,称作 S 珠蛋白,而野生 型称为 A 珠蛋白,其基因型分别为βS 和βA。恰好突变点 A→T 位于 Del I 的识别序列 CT-NAG 之内,这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。方法是合成一个长 40 个碱基的寡核苷酸探针, 其 5’末端距突变碱基有 11 个碱基,该探针与βA 基因的非编码链互补。将此探针的 5’末端标 记上 32P。杂交方法采用液相杂交法,即在液相中将靶 DNA 变性解链,然后与探针退火,产生杂 交体。如靶 DNA 为βA 型,则两条链完全互补,并产生 Dde I 的酶切位点;如待检 DNA 为βS 型, 则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对,从而不能被 Del I 所识别。用 Del I 消化杂交 DNA,显然βA 会被切开而βS 不被切开。βADNA 杂交体被切开后,5’端探针序列因只有 8 个碱 基,与杂交链结合不紧而解离,从而产生游离的 5’端标记 8 核苷酸单链。不被切开的βS 杂交 体尚可被另一个限制酶 Hinf I 消化,该酶的识别位点紧靠 Del I 识别位点上游。βS 杂交 DNA 经 Hinf I 消化后,将释出探针 DNA 的 5’末端 3核苷酸小片段。βADNA 杂交体因已无 Hinf I 识 别序列,故而不能被 Hinf I 消化。这样βA 和βSDNA 经此寡核苷酸探针杂交和 Del I 及 Hinf I 消化后,分别产生游离的 8 核苷酸(8nt)和 3 核苷酸(3nt) 片段,它们可以经电泳分离后进 行放射自显影而获证实。藉此策略,可轻易将各种β珠蛋白突变型鉴别开,如纯合野生型 AA 结 果为仅有 8nt 片段,纯合突变型 SS 则仅可检出 3nt 片段,而杂合子 AS 型则两种片段均存在。 四、核酸探针的标记和检测 分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式,是核酸的重要理化特性。利用分子杂交 这一特性来对特定核酸序列进行检测,必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记, 这条链就称为核酸探针。因此,核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最 常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有 32P 和 35S 前者能量高, 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 8 信号强,最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高,但却存在辐射危害和半衰期限制(32P 半衰期为 14.3 天,35S 半衰期为 87.1 天,125I 的半衰期为 60 天),3H 的半衰期长达 12.3 年, 但它所释放β放射线能量太低(0.018Mev),只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在 使用过程中存在着上述缺点,近些年来,人们在寻找非航船性标记物方面取得了很大进展,国际 上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒,在国内也已具备生物素类标记物的生产 能力,并有相应试剂出售。目前,非放射性标记物有下述几类:金属如 Hg,荧光物质如 FITC; 半抗原如地高辛;生物素;酶类如辣根过氧化物酶(HRP)。半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)等。 不同的标记物,所标记探针的方法及检测方法也各异。下面仅就国际上较常用的,有实用价值或 发展前景的几种核酸标记方法及其显示方法分两方面简述如下。 (一)核酸探针的常用酶促标记技术 1.缺口平移 该技术由 Kelly 等于 1970 年创立。其原理是首先用 DNA 酶在双链 DNA 探针分 子的一条链上制造一些缺口(nick ),缺口处会形成 3’—羟基末端,这时再在大肠杆菌 DNA 聚 合酶 I 的催化下将核苷酸残基加在 3’-羟基上,同时,根据大肠杆菌酶 DNA 聚合酶 I的 5’→3’ 核酸外切酶活性,此酶将缺口 5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移(nick tr-anslation)。 根据这个原理,如果用高强度的放射性核苷酸(通常为α-32PdATP)置换先前存在的核苷酸,则 可制备比活性高达 108cpm(每分钟计数)/μg 的 32P 标记 DNA。用缺口平移法标记的 DNA 探针能 满足大多数杂交要求。 2.DNA 快速末端标记 大肠杆菌 DNA 聚合酶 i 经枯草杆菌蛋白酶切割可得到两条多肽链, 其中分子量为 76kd 的大片段称为 Klenow 片段。该酶具有完整聚合酶 I 的 5’→3’聚合酶活性和 3’→5’核酸外切酶活性,但缺乏 5’→3’核酸外切酶活性。利用 Klenow 片段可以填补由限制 酶消解 DNA 所产生的 3’凹陷末端。因此,用这种方法可以标记双链 DNA 的凹陷 3’末端。用 Klenow 片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP,加入反应的[α-32P]dNTP 取决于 DNA 末端延伸的 5’ 末端序列,例如,用 Ecor I 切割 DNA 所产生的末端用[α-32P]dNTP 标记。标记反应可在一种限 制酶消解 DNA 后立即进行,不需去除限制酶或使其失活,也不需更换缓冲液,具有 3’延伸的 DNA 末端不能被 Klenow 片段有效在标记,欲标记这类分子可用 T4DNA 聚合酶。 选用这种标记方法是为了产生可用于凝胶电泳时作大小参照物的 DNA 片段。因为标记的 DNA 片段与其摩尔浓度成比例,而不与片段大小成比例,在限制酶消化物中,小的和大的片段都以相 同程度被标记。因此,可使用放射自显影术确定不有被溴化乙锭染色所观察到的大小 DNA 带,尤 其适用于 Southern 吸印杂交时分子量标志物的标记。通过选择相应标记的 dNTP,该法还可以只 标记 DNA 分子的一端。例如,若 DNA 片段的两个末端分别是 Bam H I 和 Hind III 粘膜端,在反 应中只加入[α-32P]dNTP 或[α-32P]dGTP,使可选择性标记两末端之一。 3.用 T4 多核苷酸激酶标记 DNa 5’末端 寡核苷酸探针或短的 RNA 和 DNA 探针可选用此法 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 9 标记,寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4 多核苷酸激酶(polynucleotide kinase, PNK)是由 T4 噬菌体感染的大肠杆菌中提取的,此酶能催化 ATP 的γ-磷酸转移至 DNA 或 RNA 的 5’-OH 末 端。在过量 ADP 存在时,也可促进磷酸交换反应,使 PNK 将 DNA 末端 5’磷酸转移到 ADP 上生成 ATP,然后催化[α-32P]dNTP 上的标记磷酸转移至 DNA 的 5’末端,从而使 DNA 重新磷酸化,并 藉此得到标记。显然,PNK 标记 DNA 末端需要[γ-32P]dNTP,这与前述酶促标记方法不同。通常, 对于 5’磷酸化的 DNA 探针,要先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团,然后再用于 PNK 催化的 5’末端 标记,这样标记效率较高。 4.随机引物延伸 这是以单链 DNA 或 RNA 模板合成高比活性 32P 标记探针所选用的方法。 原理是使长 6~8nt 的寡核苷酸片段与变性的 DNA 或 RNA 模板退火,在 DNA 聚合酶 I 或反转录酶 的作用下,以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发 DNA 链的合成,在反应时将[α -32P]dNTP 掺入合成链,即得到标记。变性处理后,新合成链(探针片段)与模板解离,即得到 无数各种大小的探针 DNA。因为所用寡核苷酸片段很短,在低温条件下可与模板 DNA 随机发生退 火反应,因此被称为随机引物(random primer)。这种随机引物可用小牛胸腺 DNA 或鱼精 DNA 制备。 用随机引物法标记的 DNA 探针或 cDNA 探针比活性显著高于缺口平移法,且结果较为稳定。 这种方法尤其适用于真核 DNA 探针,因为随机引物来自真核 DNA,其与真核序列的退火率要高于 原核序列。因此,对于克隆的 DAN 探针,常先将插入探针 DNA 切下来回收后再标记,而缺口平移 法可直接用于全质粒的标记。 5.聚合酶链反应 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种分子生物学 新技术,由美国 Cetus 公司人类遗传学部的 Kary.B. Mullis 于 1985 年创立。该技术利用两个与 相反链杂交并随着于靶 DNA 两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的 DNA 片段,包括模板变性,引 物退火和引物延伸三个步骤的反复循环,最终两引物所夹靶 DNA 得到千万倍以上的扩增。因此 , PCR 技术已成为一项极为有价值的技术并已迅速推广应用。 PCR 技术有许多重要用途,其中之一便是可用来标记高比活性 DNA 探针。PCR 技术具有很高 的特异性,可在 1~2h 之内在量合成探针 DNA 片段,如果在底物中加入[α-32P]dNTP 或其它标记 的 dNTP,则探针 DNA 合成过程中可得到很好的标记,标记物的掺入率可高达 70%~80%。因此, PCR 标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性 PCR 引物。 使用从探针 DNA 上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。 (二)核酸探针的非放射性标记技术 1.光敏生物素标记核酸 目前使用的光标生物素试剂有两种:光生物素(乙酸盐)和补骨 脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基 团是-N3,它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 10 (320~400μm)下,可与单链或双链核酸发生反应,反应主要在 T 上,C上也有一定程度的反应。 光敏生物素的连接臂含 6~12 个碳原子,用以减少探针杂交时的空间位阻。光敏生物素标记核酸, 方法简单,灵敏度也可达到 pg 水平,可用于外源基因的检测。最近出现了一种新的光敏活性 DNA 生物素试剂,即生物素-聚乙二醇-当归素(BPA)。BPA 的 DNA 结合部分是一个活性糖香豆素衍生 物,在长波 UV 下它可与 DNA 碱基共价键结合。BPA 反应物与 DNA 结合比光敏生物素更特异,在可 见光下它不与核酸反应,这个特性可使 BPA 只标记粗制细胞裂解物中的核酸,而不标记蛋白、多 糖和其他细胞大分子。 2.酶促生物素标记核酸 以生物素化的脱氧核苷三磷酸(Bio-11-dUTP,Bio –7 – dATP、 Bio-11-dCTP)等代替相应 32P 标记的脱氧核苷三磷酸,经 DNA 聚合酶作用掺入 DNA。Bio-dUTP 代替 dTTP,Bio-dATP 代替 dATP,Bio- dCTP 代替 dCTP。Bio –11-dUTP 的 11 是指生物素基团与 脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物素标记 DNA 的方法有缺口平移法和随机引物 延伸法。 3.寡核苷酸的生物素末端标记 有 5’-磷酸的化学标记法和 3’-OH 的酶促标记法。前者将 寡核苷酸的 5’-磷酸接上一个乙二胺,然后用琥珀酰亚胺生物素,将生物素基团连接在磷酸酰胺 基上。后者是用末端转移将 Bio-11–dUTP 加于其 3’-OH 端(脱去一个焦磷酸)。 4.酶标 DNA 标记试剂是辣根过氧化酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)。通过对苯醌(PBQ)与聚乙烯亚胺 (PEI)连接而成(HRP-PBQ-PEI+),此试剂在戊二醛的作用下与变性的 DNA 结合,使 HRP 与 DNA 连接在一起,组成 HRP 标记的 DNA 探针。 5.酶标寡核苷酸 包括核苷酸 5’末端标记 HRP 法和内部标记 AP 法。前者是在 HRP 中产生一个 -HS 反应基团,在寡核苷酸合成终了加在 5’端,带一个 C6 的-HS 基,与活化的 HRP 反应生成 5’ -HRP 寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸过程中将一个 5’带连接臂及 CF3 基团的尿苷 3’亚磷酰 亚胺合成在寡核苷酸链中,合成后此活化的寡核苷酸与 AP 反应即得到 AP 标记的寡核苷酸。 6.DNA 半抗原标记 其原理与 Bio-11-dTUP 相同,只是用毛地黄甙代替生物素形成 Dig –11- dUTP,酶促掺入 DNA 分子。用抗毛地黄甙抗体检测标记在 DNA 上的半抗原分子 Digoxigenin(地 高辛) (三)非放射性探针的显示体系 1.AP 显色体系 BCI –OH+NBT→紫色 ASO:等位基因特异的寡核苷酸,BCIP:5 溴-4 氯-3 吲哚磷酸,NBT:四氮唑蓝,Pi:磷酸。 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 11 2.HRP 显色体系 HRP + H2O2[HRP·H2O2] ODA –NH2 +[HRP ·H2O2]棗→ODA-N = ODA/棕色+HRP +H2O ODA:邻-联茴香胺。 3.ABC 显色体系 DNA –B + SA – AP→DNa – B – SA 或 DNa – B +SA - BAP→DNa –B –SA –BAP 经上述两反应,把 AP 连接在 DNA 上以后,再进行 AP 酶显色。这里 SA 为 Streptavidin(链 酶亲合素),BAP 为生物素化的磷酸酶,B 为生物素(biotin),ABC 为 Avidin – Biotin - Enzyme com-plex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。 以上反应 AP 亦可用 HRP 代替。 表 18-3 曱核酸探针的标记分子 标记物性质 标记分子 标记方法 杂交体的检测法 放射性分子 [α-32P]dNTP NT、PCR、RPI 放射自显影或计数 [γ-32P]dNTP TL 放射自显影或计数 125I 碘化 放射自显影或计数 35S NT 放射自显影或计数 3H NT 放射自显影或计数 非放射性分子 生物素 Bio-11-dUTP NT、TL、PCR 酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色 光敏生物素 600W 可见光照 同上 生物素化补骨脂素 365nm 紫外线照 同上 生物素酰-e-氨基乙 酸 化学合成法 同上 N-羟基丁二酰亚胺脂 酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色 生物素肼 化学合成法 酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色 酶 微过氧化物酶 直接法或合成 直接底物显色或用酶标抗体+ 底物显 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 12 法 色 碱性磷酸酯酶 直接法或合成 法 同上 荧光素 罗丹明和 FITC 合成法 直接荧光显微镜观察或酶标抗体+ 底 物显色 化学发光标记物 化学发光测量或自显影 抗双链单抗 酶标或荧光标记单抗 化学法 直接底物显色 稀有金属 Eu3- 化学法 时间分辨荧光 重金属 Ag 化学法 Hg 化学法 半抗原 磺酸胞嘧啶 化学法 酶标单抗 + 底物显色 地高辛 RPL 酶标抗体 + 底物显色 * :NT:缺口平移; PCR:聚合酶链反应;RPL: 随机引物标记; TL:末端标记 4.非放射发光自显影 若将 AP 或 HRP 的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光 子的化合物,可用自显影技术暴光 X 线片显示。 (1)HRP 发光自显影:氨基苯-甲酰肼在 HRP 与 H2O2 的作用下氧化为氨基苯二甲酸,同时放出 N2 及发光(波长 428nm)。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图: (2)AP 的发光自显影:AP 的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐(AMPPD),它含有磷酸酯键在 AP 的作用下水解下一个磷酸,进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间- 氧苯甲酸阴离子,当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片(621 型)直接暴光显影。 显影信号强度比 BCIP/NBP 显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。 其发光反应的原理如下: HRP 的发光原理: AP 的发光原理: 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 13 五、核酸分子杂交的类型 随着基因工程研究技术的迅猛发展,新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸 分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。固相杂交是将参加反应的一条核 酸链先固定在固体支持物上,一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙 膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 由于固相杂交后,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测和能防 止靶 DNA 自我复性等优点,故该法最为常用。常用的固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂 交、狭缝杂交、Southern 印迹杂交、Northern 印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。 液相杂交是一种研究最早且操作复合的杂交类型,在过去的 30 年里虽有时被应用,但总不 如固相杂交那样普遍。其主要原因是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较 高。近几年由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应用,推动了液相杂交 技术的迅速发展。下面对固相杂交和液相杂交分别进行介绍。 (一)固相膜核酸分子杂交方法 固相核酸杂交多是在膜上进行,因此,以下主要介绍固相膜的核酸分子杂交方法: 1.DNA 的变性 DNA 变性解链是杂交成功的关键。Southern 印迹杂交时 DNA 在凝胶中变 性,变性方法是将凝胶浸在数倍体积的 1.5mol/l NaCl 和 0.5mol/l NaOH 中 1h 然后用数倍体积的 1mol/l Tris –HCl(Ph8.0)和 1.5mol/l NaCl 溶液中和 1h。DNA 受酸、碱、热等处理均能发生变性, 但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好,可避免 DNA 降解。热变性在要低 DNA 浓度(100 μg/ml)和低盐浓度(0.1mol/l SSC 含 15mmol/l NaCl - 1.5mmol/L 柠檬酸三钠,pH7.0)下进行。 用 SSC 稀释 DNA 溶液为 50μg/ml,加 10mol/l NaOH 使最终浓度为 0.1mol/L(pH 约 12.8),室温 变性 10min,很快置冰盐水中,用 10min/l HCl 或 5mol/l NaH2PO4 调 pH 到 7~8[亦可用碱变性后, 调至中性,再加热 100。c 10min],DNA 变怀可用 OD260 增加(约 30%~40%)来检测,变性 DNA 醇沉淀呈雪样,完全失去纤维状沉淀。变性后加入等量冷的 12×SSC,冰浴保存。 2.变性 DNA 在硝酸纤维素膜上的固定 硝酸纤维素滤膜(孔径 0.45μm)先在蒸馏水中充 分浸泡,再用 6×SSC 浸泡 30min~2h,凉干。DNA 样品转移或加至硝酸纤维素膜上后,先室温 干燥 4h,然后在 80。C 真空干燥 2h。 3.预杂交 湿润的滤膜放入可加热封口的塑料袋中,按每平方厘米滤膜加 0.2ml 预热至 60。 C 的预杂交液(6×SSC,0.5%,SDS,5×Denhardt 液,100μg/ml 鲑鱼精 DNA)。鲑鱼精 DNA 需经 过剪切和 DNA 酶消化处理,然后酒精沉淀纯化,调浓度至 10mg/ml,用前放 100。C 水浴中煮沸 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 14 变性 10min,冰水骤冷。尽可能将袋中气泡赶尽,可封口器将袋口封住。将杂交袋浸入 68。C 水 浴保温 3~12h。当预杂交液温度升至 68。C 时,在滤膜表面常会形成小气泡。轻轻晃动袋中液体 即可除去这些小气泡,这一点对于保证滤膜表面充分浸润预杂交液很重要。 4.杂交 从水浴中取出塑料袋,用剪刀剪开一角,尽可能挤净预杂交液。用吸管或大枪头 将杂交液加入袋中,用恰好是足量的液体保持滤膜湿润(50μl/cm2)。溶液的组成是 6×SSC, 0.01mol/l EDTA, 变性的标记核酸探针,5×Denhardt 液,0.5%SDS, 100μg/ml 变性的鲑鱼精 DNA。 尽可能赶尽气泡后,将塑料袋严密封口,杂交反应在 68℃水浴中进行,所需时间视探针和检测靶 DNA 的性质及探针的比活性等情况而定,一般 4~20h。 5.洗膜 取出塑料袋,用剪刀剪开,小心取出滤膜,立即浸入盛有 2×SSC 和 0.5%SDS 溶 液的盘中,室温下漂洗 5min。再将滤膜移入 2×SSC 和 0.1%SDS 溶液中,室温下洗涤 15min(轻 轻摇动)。然后将滤膜移入 0.1×SSC 和 0.5%SDS 溶液中;68℃轻轻摇动保温 2h,更换缓冲液后 继续保温 30min。 洗膜的温度一般应控制在低于 Tm 值 12℃以上。(Tm = 69.3 + 0.41x(G +C) %)。双链 DNA 的 Tm 值随错配碱基对数每增加 1%而递减 1℃。 6.结果显示 非放射性检测方法前已述及,此处主要介绍放射性测定方法。固相膜的放射 性杂交结果显示有两种方式,一是放射性自显影法,另一种是液闪计数法。前一种方法比较简单, 只需将杂交膜与 X 光片在暗盒中曝光数小时至数天,再显影、定影即可。对于杂交信号较弱的固 相膜,用一块增感屏可显著增强曝光强度。此外,为了减弱 32P 的散射,曝光通常在-20℃或-80 ℃下进行。液闪计数法主要用于打点和狭缝杂交及为了比较两个杂交信号的强弱等情形。方法是 将完成杂交的膜在漂洗结束后剪成小块(每份样品 1 块),80℃真空干燥后装闪烁瓶。加入 2~5ml 闪烁液,剪 2~3 块无样品膜块作为本底对照。在液体闪烁计数器上自动计数。液体计数测定放 射性强度也可在放射自显影之后进行。 (二)固相核酸分子杂交类型 1.菌落原位杂交(Colony in situ hybridization) 菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到 硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出 DNA。将 NDA 烘干固定于膜上与 32P 标记 的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。 实验步骤如下: ①将硝酸纤维素滤膜置于含抗生素的平皿琼脂培养基上,用无菌牙签挑取单菌落种于滤膜和 主琼脂平板上,排列成方格栅,膜和板上菌落位置相同。 ②培养细菌至产生 1~2mm 大小的菌落。 ③在一块平皿中置 4 张滤纸,用 10%SDS 浸透,倒掉多余液体。将带有菌落的滤膜取下,轻 轻置于滤纸上,菌落面上在,注意防止在滤膜底面存有气泡。 热线电话:021-6485 8053 8009881995 E-mail:master@shinegene.org.cn 网址:www.shinegene.org.cn 15 ④5min 后,将滤膜转至用变性溶液(0.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·NaCl)浸湿的滤纸上, 放置 10min。 ⑤将滤膜转至中和溶液(1.5mol/l NaCl , 0.5mol/L Tris·HCl ,pH8.0)浸湿的滤纸上,放置 10min。重复中和 1 次。 ⑥将滤膜移至用 2×SSPE 溶液浸过的滤纸上,放置 10min。SSPE 配成 20×贮备液:3.6mol/l NaCl, 0.2mol/L NaH2PO4(PH7.4), 20mmol/L EDTA(pH7.4)。 ⑦将滤膜用滤纸吸干,80℃真空烘干 2h。 以下操作参考前述。 2.斑点杂交(Dot blot) 斑点杂交法是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做 半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪 (manifolds),如 Minifold I 和 II、Bio-Dot (Bio –Rad )和 Hybri –Dot,它们有许多孔,样品加到 孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状,反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以 固定标本,这时的膜就可以进行杂交。 (1)DAN 斑点杂交
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