骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化

中国组织工程研究与临床康复 第 14 卷 第 2 期 2010–01–08 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research January 8, 2010 Vol.14, No.2 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 218 Department of Orthopaedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China Cai Gui-quan★, Studying for master’s degree, Department of Orthopaedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China caiguiquan99@sina. com Correspondence to: Chen Xiao-dong, Doctor, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopaedics, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200092, China chenxdmd@163.com Supported by: Scientific Research Innovation Project of Shanghai Education Committee, No.08YZ37* Received: 2009-07-11 Accepted: 2009-08-14 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化*★ 蔡贵泉，崔一民，陈晓东 Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into fibrochondrocyte phenotype Cai Gui-quan, Cui Yi-min, Chen Xiao-dong Abstract BACKGROUND: The meniscus has limited ability in repairing itself after being injured. However, tissue engineering provides a new way to meniscus repair after injury. Bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), which possess the potential of multi-directional differentiations, can be ideal seed cells in meniscus tissue engineering. OBJECTIVE: To investigate the feasibility of differentiation of in vitro cultured porcine BMSCs into fibrochondrocyte phenotypes in inductive medium. METHODS: BMSCs were isolated with whole bone marrow culture method. Then, BMSCs of the third passage were digested and incubated in a medium containing transforming growth factor-β1, insulin-like growth factor-Ⅰ, dexamethasone and ascorbic acid in a 24-well plate at a density of 2.0×104/cm2 in the experimental group. While in the control group, the DMEM-LG complete culture medium containing no inductive factor were used instead. At day 7, 14 and 21 after induction respectively, Toluidine blue staining and immunocytochemical staining were performed to detect differentiation. MAIN OUTCOME MEASURES: ①Population double time (PDT) of BMSCs; ②Morphological changes of BMSCs under light microscope; ③Proteoglycan expression; ④Collagen type Ⅰand type Ⅱ expression. RESULTS AND CONCLUSION: ①The PDT of the second passage BMSCs was 2 days, which was the shortest. The PDT prolonged relatively after the fourth passage, which were 5 to 9 days. ②The BMSCs changed from a spindle-like appearance into a polygonal shape after induction. ③In the experimental group, toluidine blue staining resulted in hyacinthine-stained cytoplasm and the blue was even deeper in the area where cells were dense; The degree of staining increased with the increasing induction time. While in the control group, only nucleus of BMSCs were stained blue. ④Collagen type Ⅰ immunocytochemical staining was positive in both the experimental and the control group and there was no difference of significance between various induction time. No collagen type Ⅱwas seen expressed in the control group, while in the experimental group it was seen to be expressed steadily after 14 days of induction. It is indicated tlat BMSCs can be induced to synthesize fibrochondrocyte-characterized extracellular matrixes in vitro, which suggests that BMSCs are available as seed cells in meniscus tissue engineering. Cai GQ, Cui YM, Chen XD. Differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into fibrochondrocyte phenotype.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(2): 218-222. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com] 摘要 背景：半月板损伤后自行修复能力有限，组织工程技术为半月板损伤后修复开辟了一条新的途径。骨髓间充质干细胞具有多 向分化潜能，有可能成为半月板组织工程理想的种子细胞。 目的：观察体外培养的猪骨髓间充质干细胞在诱导培养液作用下向纤维软骨细胞表型分化的可行性。 方法：采用全骨髓培养法分离培养猪骨髓间充质干细胞。取第 3 代的骨髓间充质干细胞，实验组以 2.0×104/cm2细胞密度接 种于 24 孔板，在含有转化生长因子 β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松及抗坏血酸的 DMEM-LG 完全培养液中诱导分化， 对照组以 2.0×104/cm2细胞密度接种于 24 孔板，加入不含诱导因子的 DMEM-LG 完全培养液。在诱导第 7，14，21 天分别 行甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色检测其分化结果。 结果与结论：①第 2 代骨髓间充质干细胞的群体倍增时间最短约为 2 d，第 4 代以后相对延长，为 5~9 d。②诱导后的骨髓 间充质干细胞由梭形向多角形、多边形转变。③实验组可见胞浆呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深，染色 强度随诱导时间延长而增强。对照组的骨髓间充质干细胞只有核蓝染。④实验组和对照组Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均阳性， 各期染色无明显差异。对照组未见Ⅱ型胶原表达，实验组诱导 14 d 后可见Ⅱ型胶原能稳定的表达。提示骨髓间充质干细胞 在体外诱导培养下可分泌纤维软骨细胞特征性细胞外基质，作为半月板组织工程种子细胞来源可行。 关键词：骨髓间充质干细胞；纤维软骨细胞；诱导；分化；软骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.02.007 蔡贵泉，崔一民，陈晓东. 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化[J].中国组织工程研究与临床康复，2010， 14(2):218-222. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com] 219 上海交通大学医 学院附属新华医 院骨科，上海市 200092 蔡贵泉★，男， 1981 年生，广东 省汕头市人，汉 族，上海交通大学 医学院附属新华 医院骨科在读硕 士，主要从事半月 板组织工程的研 究。 caiguiquan99@ sina.com 通讯作者：陈晓 东，博士，教授， 主任医师，博士生 导师，上海交通大 学医学院附属新 华医院骨科，上海 市 200092 chenxdmd@ 163.com 中图分类号:R318 文献标识码:A 文章编号:1673-8225 (2010)02 -00218-05 收稿日期：2009-07-11 修回日期：2009-08-14 (20090611015/M·J) 0 引言 人膝关节半月板损伤是骨科的常见病，随 着对半月板功能及半月板切除后并发症认识的 不断深入，人们意识到修复和保留半月板功能 的重要性[1-2]。组织工程技术使修复甚至再造半 月板成为可能。组织工程化半月板的重要条件 之一是必须获得大量的有功能和活力的纤维软 骨细胞，而骨髓间充质干细胞是存在于骨髓内 的一种具有多向分化潜能的成体干细胞，可在 体外大量培养扩增，有可能成为组织工程较为 理想的种子细胞来源。实验旨在建立一种骨髓 间充质干细胞向纤维软骨细胞表型分化的体外 培养体系，对体外诱导培养不同时期的骨髓间 充质干细胞进行连续鉴定，从而为骨髓间充质 干细胞作为半月板组织工程的种子细胞来源提 供理论和实验依据。 1 材料和方法 ：成组设计，细胞形态学，免疫细胞 化学实验。 时间与地点：实验于2008-05/2009-03在上 海交通大学医学院附属新华医院科研中心完成。 材料： 实验动物：45 d龄长枫杂交猪5只，体质量 6~8 kg，雌雄不限，由上海市南汇县老港镇特 种养殖场提供。实验过程中对动物的处置符合 动物伦理学[3]。 主要试剂： 实验方法： 取材：实验动物以氯胺酮(2 mg/kg)、0.25% 戊巴比妥钠(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，以骨髓 穿刺针垂直穿刺入髂骨骨髓腔，抽取骨髓6~ 8 mL，立即注入含 30 mL肝素化无血清 DMEM-LG培养液至50 mL无菌离心管中，混匀 制成细胞悬液。 骨髓间充质干细胞的分离培养及扩增：参照全 骨髓培养法[4-5]，将细胞悬液以1 500 r/min离心 8 min，弃上清液，以PBS清洗3次，去除上层 脂肪及组织液，下层即为含骨髓间充质干细胞 的有核细胞层。加入DMEM-LG完全培养液(含 体积分数10%胎牛血清、L-谷氨酰胺300 mg/L、 抗坏血酸50 mg/L、青霉素100 U/mL、链霉素 100 mg/L)，计数有核细胞，以1×109 L-1有核 细胞接种入直径100 mm培养皿，置于37 ℃、 体积分数为5%CO2、100%饱和湿度培养箱中 培养。培养的第5天进行首次换液，吸除悬浮 有大量红细胞的培养液，PBS洗涤3次后加入 新鲜培养液，继续培养，每周换液2次， OLMPUS倒置相差显微镜逐日观察细胞形态 及生长情况。待细胞生长融合达80%~90%时， 用0.25%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化，传代， 按1.5×104/cm2细胞密度接种传代扩增。 群体倍增时间(population double time, PDT)测 定：将各代细胞按1×105/孔接种到6孔板上，待 细胞融合达80%~90%时，用0.25%胰蛋白酶+ 0.02%EDTA消化、计数，按公式(T-T0)× ln2/ (lnN-lnN0)可得到各代细胞的群体倍增时间。以 1/lnPDT代表细胞增殖速度，绘制趋势图。其 中T0为初始接种时间，T为中止消化时间，N0 为初始接种细胞数，N为中止消化时细胞数。 骨髓间充质干细胞的诱导分化：取第3代细胞 分为2组，实验组以2.0×104/cm2细胞密度接种于 24孔板，分别加入1 mL DMEM-HG完全诱导培 养液(含体积分数10%胎牛血清、转化生长因子 β1 10 μg/L、胰岛素样生长因子 50Ⅰ μg/L、地塞 米松40 μg/L、L-谷氨酰胺300 mg/L、抗坏血酸 50 mg/L、青霉素100 U/mL、链霉素100 mg/L)； 对照组以2.0×104/cm2细胞密度接种于24孔板， 分别加入1 mL DMEM-LG完全培养液，内置爬 片，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、100%饱 和湿度培养箱中培养，每周换液2次，分别在 诱导后第7，14，21天取出爬片，行蛋白多糖 甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学染色。 甲苯胺蓝染色：实验组和对照组分别在诱导 培养第7，14，21天取出爬片，丙酮固定5 min， PBS冲洗，1%甲苯胺蓝室温染色30 min，洗去 多余的染液，梯度脱水，透明，中性树胶封固。 免疫细胞化学染色：实验组和对照组分别在 诱导和培养第7，14，21天取出爬片，丙酮固 定5 min，PBS洗3次，0.25%TritonX-100通透 10 min，PBS洗3次，体积分数为3%H2O2封闭 试剂 来源 DMEM 培养液及 0.25% 胰蛋白酶+0.02%EDTA 转化生长因子 β1、胰岛素样 生长因子Ⅰ 地塞米松及抗坏血酸 胎牛血清 鼠抗人Ⅰ型胶原抗体 鼠抗人Ⅱ型胶原抗体 辣根过氧化物酶标记第二抗体 及 DAB 显示剂 美国 GIBCO 公司 美国 PERPOTECH 公司 美国 SIGMA 公司 澳大利亚 PAA 美国 Abcam 公司 美国 NeoMarkers 公司 美国 Dako 公司 www.CRTER.org 蔡贵泉，等. 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 220 内源性过氧化物酶15 min，PBS洗3次，体积分数10% 非免疫羊血清30 min，后弃去非免疫血清，加入0.5%牛 血清白蛋白稀释的1∶50鼠抗人Ⅰ型胶原抗体/鼠抗人 Ⅱ型胶原抗体，置湿盒4 ℃过夜，PBS洗3次，加辣根 过氧化物酶标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次， DAB显色5 min，苏木精复染，梯度脱水，透明，中性 树脂封固。以不加一抗样本作为空白对照，正常猪半月 板纤维软骨免疫组化作阳性对照。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的群体倍增时 间。②诱导分化后的光镜形态变化。③甲苯胺蓝染色检 测蛋白多糖表达。④免疫细胞化学染色检测Ⅰ型胶原和 Ⅱ型胶原表达。 设计、实施、评估者：实验设计、实施由第一作者 完成，结果评估为第二、三作者完成。 统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5统计软件 分析处理，检测数据以x _ ±s表示，实验组和对照组的阳 性率比较采用成组设计的两样本均数比较t 检验，实验 组内不同诱导时间阳性率比较采用单因素方差分析， P < 0.05则认为差异有显著性意义。 2 结果 2.1 倒置相差显微镜观察结果 原代细胞培养5 d后 首次换液，即可看到贴壁的细胞小克隆，细胞形态呈 较一致的长梭形、纺锤形，细胞较小，呈克隆性生长(图 1)。 随培养时间的延长，悬浮细胞逐渐坏死破碎，随换 液次数增多而被清除。细胞克隆不断扩大，呈放射状向 周围扩展，逐渐与邻近克隆汇合，10~14 d可达到 80%~90%的融合，细胞排列呈螺旋状或漩涡状。传代 细胞接种2~4 h后，开始附壁铺伸，24 h后已基本完成 贴壁，48~72 h开始快速增殖，4~7 d时可达80%~90% 的融合。传代细胞与原代相比，生长较快，细胞均一性 更好，呈长梭形。诱导因子加入后，细胞的增殖速度明 显低于对照组，细胞形态由梭形向多角形、多边形转变， 有明显的聚集生长现象，有些密集区可形成结节。 2.2 群体倍增时间 第1~10代细胞的增殖情况及换算 得到的PDT值见表1。 以1/lnPDT代表细胞的增殖速度，可得到各代细胞 增殖速度趋势图(图2)。 由表1及图2可见，第2代的PDT最短，第4代以后 PDT相对延长，但第4~10代细胞的PDT差异不显著。按 此推算，第1~3代共约17 d，细胞可扩增到71.2倍，足 以满足一般半月板缺损的组织工程修复的要求。 2.3 蛋白多糖甲苯胺蓝染色 实验组诱导后可见胞浆 呈明显的紫蓝色，尤其细胞密集生长的区域蓝染较深， 染色强度随诱导时间延长而增强(图3)。对照组的骨髓间 充质干细胞只有核蓝染。 表 1 第 1~10 代细胞的增殖情况和群体倍增时间 Table 1 The proliferative activity and population double time (PDT) of cells from Passage 1 (P1) to P10 Cell passage Inoculum size(×106) Culture time (h) Fusion size (×106) PDT (h) P1 1.00 119 3.18 71.40 P2 1.00 115 5.60 46.27 P3 1.00 167 4.00 83.50 P4 1.00 222 2.55 164.38 P5 1.00 145 2.10 135.46 P6 1.00 190 2.30 158.12 P7 1.00 219 2.40 173.39 P8 1.00 210 2.10 196.19 P9 1.00 220 2.15 199.21 P10 1.00 218 2.35 176.85 Figure 1 The spindle-like, adherently growing primary cells cultured for 5 days (inverted phase contrast micro- scope, ×100) 图 1 原代细胞培养 5 d，呈长梭形贴壁生长(倒置相差显微镜， ×100) Figure 2 Tendency graph of proliferative speed for bone marrow mesenchymal stem cells undergoing in vitro monolayer culture 图 2 体外单层培养骨髓间充质干细胞的增殖速度趋势图 0.27 0.26 0.25 0.24 0.23 0.22 0.21 0.20 0.19 0.18 P ro lif er at iv e sp ee d (1 /ln P D T) P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 Cell passage Figure 3 The dark blue cytoplasm of bone marrow mesenchymal stem cells induced for 21 days, toluidine blue stainging (×200) 图 3 实验组细胞诱导 21 d，甲苯胺蓝染色细胞胞浆呈深蓝色 (×200) www.CRTER.org 蔡贵泉，等. 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 221 2.4 Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色 2.5 不同诱导时间Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性率 的比较 见表2。 3 讨论 种子细胞来源是半月板组织工程的首要问。半月 板纤维软骨细胞来源有限，体外扩增时间长，且随年龄 增大糖氨聚糖和胶原合成能力明显下降[6]，限制了半月 板纤维软骨细胞在临床上的使用。间充质干细胞广泛存 在于骨髓、骨膜和软骨膜中，它繁殖能力强，体外培养 达30代以上，细胞数目扩增100万倍以上仍保持良好的 多分化潜能[7]。骨髓间充质干细胞以其来源充足、取材 方便、创伤小、增殖能力强、无排斥反应、不存在伦理 问题、易于多种载体基因转导等优点[8]，被公认为有可 能成为软骨组织工程理想的种子细胞来源。Yamasaki 等[9]使用同种异体鼠半月板支架，接种入鼠骨髓间充质 干细胞后体外培养4周，然后移植入体内缺损处，术后4 周和8周荧光显微镜可以检测到移植半月板内有骨髓间 充质干细胞存活，甲苯胺蓝和番红-O染色可以显示糖氨 聚糖合成，且随时间增多。但该实验未对胶原合成进行 检测。本实验的目的是在体外单层培养条件下，使骨髓 间充质干细胞向纤维软骨细胞表型诱导分化。 本实验应用高糖DMEM培养基对骨髓间充质干细胞 分化为软骨细胞具有明显的促进作用。因为软骨细胞和 骨髓间充质干细胞在体外单纯培养中会逐渐凋亡，高糖 培养基可改变细胞新陈代谢，从而降低对凋亡的敏感性， 有利于骨髓间充质干细胞存活[7]。本实验将转化生长因子 β1、胰岛素样生长因子Ⅰ、地塞米松、抗坏血酸联合使 用，力求获得较大的促增殖效应和软骨诱导效应。转化 Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色显示： 实验组诱导 7，14，21 d 的骨髓间充质干细胞胞浆均呈现明显 的棕褐色，各期染色无明显差异(图 4)。 对照组亦为阳性(图 5)。 Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色显示： 实验组诱导 7 d 的骨髓间充质干细胞在细胞密集处，个别细胞 胞浆中呈明显棕褐色，大部分细胞胞浆呈不明显黄棕色(图 6)； 诱导 14 d 的骨髓间充质干细胞呈现广泛的棕褐色染色，在细胞 密集处染色更深(图 7)；诱导 21 d 的骨髓间充质干细胞同诱导 14 d 的骨髓间充质干细胞。 对照组骨髓间充质干细胞未见棕褐色颗粒。 Figure 4 Cells in the experimental group showed positive result to collagen type Ⅰ immunocytochemical staining after being induced for 21 days (×200) 图 4 实验组细胞诱导 21 d，Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳 性(×200) Figure 5 Cells in the control group showed positive result to collagen typeⅠimmunocytochemical staining (×200) 图 5 对照组细胞Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色阳性(×200) Figure 6 Cells in the experimental group showed weakly positive result to collagen type Ⅱ immunocytochemical staining after being induced for 7 days (×200) 图 6 实验组细胞诱导 7 d，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色弱阳 性(×200) Figure 7 Cells in the experimental group showed positive result to collagen type Ⅱimmunocytochemical staining after being induced for 14 days (×200) 图 7 实验组细胞诱导 14 d，Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳 性(×200) 表 2 不同诱导时间Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色阳性率的比较 Table 2 Comparison of collagen type Ⅱpositive cells ratio in different times (x _ ±s, n =10, %) Group 7 d 14 d 21 d Experimental 32.91±6.22a 89.20±4.43ab 87.70±4.85ab Control 1.23±0.31 1.17±0.17 1.18±0.18 aP < 0.01, vs. control group; bP < 0.01, vs. day 7 www.CRTER.org 蔡贵泉，等. 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 222 生长因子β系列生长因子是一族具有多种功能的多肽，它 能够促进细胞增殖，调节细胞分化，促进细胞合成并分 泌细胞外基质[10]。转化生长因子β1的信号通过smad途径 传导入核，激活sox9。sox9是一类转录调控因子，它能 促进细胞中Ⅱ型胶原基因的表达，最终促进Ⅱ型胶原的 分泌[11-12]。胰岛素样生长因子Ⅰ是一种强有力的合成代 谢刺激因子，能显著促进有丝分裂，可促进软骨细胞增 殖和成熟，合成软骨基质蛋白多糖，且可促进骨髓间充 质干细胞向软骨细胞分化，有利于软骨的生长。其与转 化生长因子β1协同在早期促进骨髓间充质干细胞增殖和 分化更加明显[13]。培养基中加入地塞米松亦有协同促进 骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用[14]。抗坏血酸 是一种抗氧化剂，可抑制或减少凋亡的产生。 国内外许多研究亦使用转化生长因子β1等诱导骨髓 间充质干细胞向软骨细胞分化，但诱导成透明软骨细胞 还是纤维软骨细胞尚无定论。纤维软骨细胞以合成Ⅰ型 胶原、Ⅱ型胶原和蛋白多糖为特征，其中Ⅰ型胶原为纤 维软骨所独有[15]。本实验证实，在该实验培养体系下， 实验组骨髓间充质干细胞经诱导后仍能持续表达Ⅰ型 胶原；Ⅱ型胶原在诱导前不表达，诱导14 d后能稳定的 表达；蛋白多糖经诱导后表达增加，提示骨髓间充质干 细胞经诱导后能同时表达Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原及蛋白多 糖，即有向着纤维软骨细胞表型方向分化的可行性。本 实验仅从免疫组化方面定性鉴定细胞诱导分化情况，诱 导后Ⅰ型胶原虽然能持续表达，但其表达量是否有明显 改变仍不清楚，有必要通过蛋白电泳或聚合酶链反应等 进行定量检测。 半月板是一个异质体，Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原在半月 板内部和外部的含量不同[16]。同时体外单层培养环境不 如体内环境复杂，体内半月板纤维软骨细胞之间、细胞 与基质之间存在着复杂的调控机制，且半月板处于应力 环境中[17]，其各部位的纤维软骨细胞所承受的应力也不 同。人们已经观察到对软骨细胞施加应力刺激，不仅可 以维持细胞表型，还可以促进细胞的合成与增殖，甚至 改变细胞的组织结构[18-19]。因此，压应力对诱导后细胞 表型的维持，以及不同诱导因素的组合对细胞外基质合 成的影响有待进一步研究。且本实验仅从细胞学水平验 证骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型分化，有必要 从分子生物学水平进一步探索骨髓间充质干细胞诱导 成纤维软骨细胞的信号传导和分化机制，以及诱导后的 纤维软骨细胞表型如何长期维持，从而为半月板组织工 程提供更多的实验基础。 4 参考文献 [1] McKinley TO, English DK, Bay BK. Trabecular bone strain changes resulting from partial and complete meniscectomy. Clin Orthop Relat Res. 2003;(407):259-267. [2] Alford JW, Lewis P, Kang RW,et al. Rapid progression of chondral disease in the lateral compartment of the knee following meniscectomy. Arthroscopy. 2005;21(12):1505-1509. [3] The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30. 中华人民共和国科学技术部. 关于善待实验动物的指导性. 2006-09-30. [4] Friedenstein AJ, Chailakhyan RK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987;20(3):263-272. [5] Zhou G, Liu W, Cui L,et al. Repair of porcine articular osteochondral defects in non-weightbearing areas with autologous bone marrow stromal cells. Tissue Eng. 2006;12(11): 3209-3221. [6] Verbruggen G, Cornelissen M, Almqvist KF,et al. Influence of aging on the synthesis and morphology of the aggrecans synthesized by differentiated human articular chondrocytes. Osteoarthritis Cartilage. 2000;8(3):170-179. [7] Johnstone B, Hering TM, Caplan AI,et al. In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp Cell Res. 1998;238(1):265-272. [8] Izuta Y, Ochi M, Adachi N,et al. Meniscal repair using bone marrow-derived mesenchymal stem cells: experimental study using green fluorescent protein transgenic rats. Knee. 2005;12(3): 217-223. [9] Yamasaki T, Deie M, Shinomiya R,et al. Transplantation of meniscus regenerated by tissue engineering with a scaffold derived from a rat meniscus and mesenchymal stromal cells derived from rat bone marrow. Artif Organs. 2008;32(7):519-524. [10] Worster AA, Nixon AJ, Brower-Toland BD,et al. Effect of transforming growth factor beta1 on chondrogenic differentiation of cultured equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 2000; 61(9):1003-1010. [11] Attisano L, Wrana JL. Signal transduction by the TGF-beta superfamily. Science. 2002;296(5573):1646-1647. [12] Kawamura K, Chu CR, Sobajima S,et al. Adenoviral-mediated transfer of TGF-beta1 but not IGF-1 induces chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in pellet cultures. Exp Hematol. 2005;33(8):865-872. [13] Fukumoto T, Sperling JW, Sanyal A,et al. Combined effects of insulin-like growth factor-1 and transforming growth factor-beta1 on periosteal mesenchymal cells during chondrogenesis in vitro. Osteoarthritis Cartilage. 2003;11(1):55-64. [14] Stewart AA, Byron CR, Pondenis HC,et al. Effect of dexamethasone supplementation on chondrogenesis of equine mesenchymal stem cells. Am J Vet Res. 2008;69(8):1013-1021. [15] Detamore MS, Athanasiou KA. Motivation, characterization, and strategy for tissue engineering the temporomandibular joint disc. Tissue Eng. 2003;9(6):1065-1087. [16] Cheung HS. Distribution of type I, II, III and V in the pepsin solubilized collagens in bovine menisci. Connect Tissue Res. 1987;16(4):343-356. [17] Sweigart MA, Athanasiou KA. Tensile and compressive properties of the medial rabbit meniscus. Proc Inst Mech Eng H. 2005;219(5): 337-347. [18] Wang G,Liu Y,Shan YX,et al.Zhongguo Xiufu Chongjian Waike Zazhi. 2004;18(2):96-99. 王刚,刘一,单玉兴,等.不同应力环境对兔骨髓间充质干细胞修复关 节软骨缺损的影响[J].中国修复重建外科杂志,2004,18(2):96-99. [19] Angele P, Yoo JU, Smith C,et al. Cyclic hydrostatic pressure enhances the chondrogenic phenotype of human mesenchymal progenitor cells differentiated in vitro. J Orthop Res. 2003;21(3): 451-457. 来自本文课题的更多信息-- 基金资助：上海市教育委员会科研创新项目(08YZ37)。 课题价值：课题得到上海市教育委员会科研创新项目 (08YZ37)“压应力对构建半月板代谢及生物力学的影响”资 助，旨在将猪骨髓间充质干细胞进行体外诱导培养，复 种异体脱钙骨基质，研究不同条件的循环压应力对于组织工 程化半月板结构、力学特性及其代谢的影响，从而为组织工 程化半月板的临床应用打下基础。 同行评价：论文选题结合临床紧密，试图解决临床中 的实际问题，设计合理，文字通顺，结果较可信。 偏倚或不足：实验方法主要是细胞培养、免疫组化，相 对单一，若加上蛋白电泳等定量检测实验指标，则更有说服 力。 www.CRTER.org 蔡贵泉，等. 骨髓间充质干细胞向纤维软骨细胞表型的诱导分化 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com