骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中miR130a的表达

2010年 　5月 第 30卷 　第 5期 基础医学与临床 Basic & ClinicalMedicine May 2010 Vol. 30　No. 5 收稿日期 : 2009 - 12 - 24　　修回日期 : 2010 - 03 - 123 通信作者 ( correspond ing author) : 010 - 88068796; qiangqu@ hotmail. com; tangfl@ csc. pumch. ac. cn 文章编号 : 1 00 1 263 25 ( 2 0 1 0 ) 0 5 20 5 2 0 20 4 研究论文　 骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过程中 m iR130a的表达 苏金梅 1 , 金 　晔 2 , 曲 　强 33 , 张奉春 1 , 唐福林 13 (中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 11风湿免疫科 ; 21中心实验室 ; 31基本外科 , 北京 100032) 摘要 :目的 诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化 ,初步探索 m iR130a在骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化过 程中的调控作用。方法 体外 TGF2β1诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化 ,免疫荧光法和免疫组化染色鉴定 Ⅱ 型胶原 ,阿辛兰染色鉴定氨基葡聚糖。用 Real2time PCR法检测细胞 m iR130a的表达。结果 骨髓间充质干细胞在 TGF2β1诱导下可分化为软骨细胞。培养 7 d后 ,诱导培养组细胞 m iR130a表达的水平显著低于培养前的水平 ( P < 0105)。结论 骨髓间充质干细胞体外诱导可以分化为软骨细胞 ,在向软骨细胞分化的早期 , m iR130a表达降低 伴随着软骨细胞的分化 ,提示与软骨形成的过程有关。 关键词 : 骨髓间充质干细胞 ; 软骨细胞 ; 分化 ; m icroRNA 中图分类号 : R 68413　　文献标志码 : A The exp ression of m icroRNA130a on rat bone mesenchymal stem cells during chondrogenic differentiation SU J in2mei1 , J IN Ye2 , QU Q iang33 , ZHANG Feng2chun1 , TANG Fu2lin13 (11Dep t. of Rheumatology and Immunology; 21Research Center Laboratory; 31Dep t. of General Surgery, PUMC Hosp ital, CAMS & PUMC, Beijing 100032, China) Abstract: O bjective　To evaluate the role of m icroRNA130a on rat bone mesenchymal stromal cells (BMSCs) dur2 ing chondrogenic differentiation. M ethods　BMSCs were induced to differentiate into chondrocytes by transform ing growth factor2β1 ( TGF2β1 ) in vitro, immunofluorescence and immunohistochem istry were performed to evaluate MSCs differentiation. RT2PCR was performed to analyze m icroRNA130a exp ression at different time points. Results 　m icroRNA130a was down2modulated during chondrogenesis after BMSCs been cultured with TGF2β1 for 7 days ( P < 0105). Conclusion　During the early stage of BMSC chondrogenic differentiation, m ciroRNA130a exp ression was specifically rep ressed, suggesting its role in differentiation of rat bone mesenchymal stromal cells. Key words: bone mesenchymal stem cell; chondrocyte; differentiation; m icroRNA 　　骨髓间充质干细胞 ( bone mesenchymal stem cell, BMSC)在转化生长因子β1 ( transform ing growth factorβ1, TGFβ1)的诱导培养下可分化为表达软骨 细胞特异性标志 Ⅱ型胶原和氨基葡聚糖的软骨样细 胞 ,但是诱导分化的机制尚不清楚。文献报道 m icroRNA可能参与软骨细胞分化过程中关键转录 因子的调控 [ 1 ] ,但具体机制尚不清楚。本研究以 m iR130a为对象 ,测定其在诱导分化前后的变化 ,探 索 m icroRNA在软骨细胞分化过程中的调控作用 , 为优化软骨细胞的分化条件提供理论基础。 2010130 (5) 基础医学与临床 　　Basic & ClinicalMedicine 1　材料与方法 111　材料 TGFβ1、地塞米松 ( Sigma公司 ) ,胰岛素 2转铁蛋 白 2硒 ( ITS)、青霉素、链霉素、胰蛋白酶 ( Gibco公 司 ) , DMEM /F212 和胎牛血清 ( Hyclone 公司 ) , Triton X2100 (Rohm2Mass公司 ) ,兔抗鼠 Ⅱ型胶原抗 体 ( Santa Cruz公司 ) , PBS、F ITC ( fluorescein isothio2 cyanate,异硫氰酸荧光素 )标记山羊抗兔 IgG、生物 素标记山羊抗兔 IgG、辣根酶标记链霉卵白素和 DAB显色试剂盒 (北京中杉金桥公司 ) , Trizol ( Invitrogen公司 ) , 引物合成 (英骏生物技术 有限公司 )。 112　实验细胞准备和分组 取 6周龄 SD雌性大鼠股骨骨髓 ,贴壁法分离 间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSCs) ,细胞 分在 3个培养瓶中培养。未诱导分化培养基培养 5 d后 , 1瓶细胞分为诱导分化前组 (0 d) ,其余 2瓶 细胞分别用 0125%胰蛋白酶消化 ,分别于诱导分化 培养基和未诱导分化培养基培养 7 d,细胞分为诱导 分化组 ( induced)和未诱导分化组 ( non2induced)。 未诱导分化培养基含 DMEM /F212、10%胎牛血清、 100 U /mL青霉素和 100μg/mL链霉素。诱导分化培 养基另加入 10 ng /mL TGF2β1、10 - 8 mol/L地塞米松、 ITS ( 10 ng /mL 胰 岛 素 ; 515 ng/mL 转 铁 蛋 白 ; 010067 ng/mL 亚硒酸钠 )。 113　免疫荧光法鉴定 Ⅱ型胶原 4%多聚甲醛固定细胞 , 011% Triton X2100穿 透 10 m in,细胞与第一抗体 Ⅱ型胶原抗体 (1∶200)孵 育 , 4 ℃过夜 , PBS冲洗后 ,与 F ITC标记的山羊抗兔 IgG二抗 (1∶200)孵育 , 37 ℃、60 m in。 114　免疫组织化学染色鉴定 Ⅱ型胶原 固定及穿透细胞方法同免疫荧光法 ,细胞与第 一抗体 Ⅱ型胶原抗体 ( 1∶200)孵育 , 4 ℃过夜 , PBS 冲洗后与生物素标记的山羊抗兔 IgG二抗 ( 1∶200) 室温作用 30 m in, PBS冲洗后辣根酶标记链霉卵白 素室温作用 15 m in, PBS冲洗后 DAB显色。 115　阿辛兰染色鉴定氨基葡聚糖 固定细胞 ,室温下 , 015%过碘酸盐溶液作用 5 m in, Schiff试剂作用 15 m in,亚硫酸盐溶液作用 2 m in、3次 ,冲洗 ,苏木素复染。 116　Rea l2tim e PCR检测 m iRNA130a Trizol法提取各组细胞总 RNA ,使用 1μg总 RNA、反转录酶 ( Ep icentre公司 )、RNA 酶抑制剂 ( Ep icentre公司 )及反转录特异引物制备反应液 , Gene Amp PCR System 9700 (App lied B iosystem s公 司 ) PCR扩增仪进行反转录反应。以 U6作内参照。 Real2time PCR引物 : U6上游引物 5′2GCTTCGGCAG CACATATACTAAAA T23′,下游引物 5′2CGCTTCAC GAATTTGCGTGTCAT23′,产物长度 89 bp; m iRNA130a 特异引物 5′2GG GGCAGTGCAATGTTAAAA23′,下游 引物 5′2GTGC GTGTCGTGGAGTCG23′, 产物长度 64 bp。Real2time PCR反应体系为 10μL,含有 2 × MasterM ix ( eENZYME公司 ) 5μL、上下游引物各 01625μL和 cDNA 2μL。反应条件为 95 ℃, 10 m in, 40个 PCR循环 (95 ℃, 15 s; 60 ℃, 60 s)。采用 AB I 7900 Real2time PCR仪 (AB I公司 )自带程序分析 Ct (Cycle threshold)值 ,使用比较阈值法定量分析。 117　统计学分析 数据以均值 ±差 ( x— ±s)表示。统计学分 析采用 O rigin715 软件。应用 ANOVA 方法进行 m iR130a表达量组间均数的比较。 2　结果 211　免疫荧光结果 培养 14和 21 d后 ,诱导分化组细胞内充满了 大量绿色特异性染色 ,未诱导培养组细胞内未发现 特异性荧光染色 (图 1)。 212　免疫组化结果 培养第 7天 ,诱导分化组细胞内充满了大量的 棕色特异性染色颗粒 ,未诱导分化组未见特异性染 色颗粒 (图 2)。 213　阿辛兰染色结果 培养第 7天 ,诱导培养组细胞内可见阿辛兰染 色阳性物质 (图 3)。 214　m iR130a在 BM SC s向软骨细胞分化过程中 的表达 分别将诱导分化前组 ( 0 d)、诱导分化组 ( in2 duced)、未诱导分化组 ( non2induced)细胞的总 RNA 进行 Real2time PCR扩增。结果显示 , BMSCs在初始 状态下表达 m iR130a,培养 7 d后 ,诱导分化组和未 诱导分化组细胞的表达水平都有不同程度下调 ,诱 125 基础医学与临床 　　Basic & ClinicalMedicine 2010130 (5) 导分化组细胞表达 m iR130a水平显著低于诱导培 养前组 ( P < 0105) , 诱导分化组细胞表达水平低 于未诱导分化组 ( P < 011 ) , 但统计学上无差异 (图 4)。 3　讨论 BMSCs是骨髓中除造血干细胞以外的成体干 细胞 ,在适宜的条件下可诱导分化为软骨细胞。细 胞因子是 BMSCs向软骨细胞分化的关键 , TGF2β1 225 2010130 (5) 基础医学与临床 　　Basic & ClinicalMedicine 图 4　m iR130a在诱导分化前、诱导分化培养 7 d、 　　 未诱导分化培养 7 d的相对表达量 F ig 4　The rela tive quan tity of m iR130a before induced 　　　 culture, after induced culture and non2induced 　　　 culture 7 days3 P < 0105, 3 3 P < 011 compared with 7 days induced 是最常用的生长因子。Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是软骨 形成特异的标志物 ,我们通过鉴定软骨特异成分 Ⅱ 型胶原和蛋白聚糖来鉴定关节软骨。在诱导分化后 的第 7、14及 21天 ,免疫荧光和免疫组化法均确定 含有 Ⅱ型胶原 ,阿辛兰染色确定含有蛋白聚糖 ,表明 BMSCs在 TGF2β1的诱导下向软骨细胞分化。 microRNA是长度为 21～23个核苷酸序列的非蛋 白编码 RNA,主要在翻译水平调控基因的表达 ,在胚胎 的发生发展等方面起重要作用。其前体在胞质内经 Dicer酶作用 ,产生成熟的 m icroRNA,后者与 mRNA的 非编码区结合 ,抑制 mRNA翻译成蛋白 ,从而发挥调控 作用。研究表明 ,m icroRNA是正常软骨发育的必要分 子 ,例如 D icer酶敲除的小鼠出生后较对照组发育明显 迟缓 ,软骨形成明显较对照组减少 [1 ]。 本研究显示 , m iR130a在 BMSCs向软骨细胞分 化过程中显著下调 ,这与 Sorrentino等 [ 2 ]的结果一 致 ,他们应用基因芯片研究了人 BMSCs向软骨细胞 分化过程中 m icroRNA的表达 ,分析了 BMSCs向软 骨细胞分化过程前后的 226个 m icroRNA表达水平 , 发现其中 36个 m icroRNA 在分化前后有明显的变 化 ,其中 m iR130a明显下调 ,并用生物医学软件预 测其靶基因含有 R unx3。文献报道 Runx2 - / - 3 + / - 和 Runx2 - / - 3 - / - 鼠完全不表达软骨 , Runx2 - / - 3 - / - 鼠肢体明显缩短 ,表明 Runx2和 Runx3是软骨分化 过程中的必要因子 [ 3 ]。 本研究结果显示 , BMSCs向软骨细胞诱导分化 的第 7 天 ,诱导培养组和未诱导培养组细胞的 m iR130a表达水平均较 7 d前显著下调 ,诱导培养 组细胞的 m iR130a比未诱导培养组的 m iR130a表 达水平下降更明显。提示 BMSCs在向软骨细胞分 化的早期 ,从第 1天到第 7天 , m iR130a参与了软骨 分化的过程。生物医学软件预测 m iR130a的靶基 因为 R unx3 ,根据 m icroRNA为负向调节的理论 ,推 测 m iR130a可能的靶基因 R unx3在软骨细胞分化 过程中上调 ,而 Runx3是软骨细胞分化过程中的必 要因子 ,因此推测 m iRNA130a可能通过 Runx3调控 软骨细胞分化。 综上所述 , BMSCs在向软骨细胞分化的早期 , 从第 1天到第 7天 , m iR130a表达水平显著下调 ,提 示 m iR130a与软骨形成的过程有关。推测 m iR130a 可能通过 Runx3调控软骨细胞分化。 参考文献 : [ 1 ] Kobayashi T, Lu J, Cobb BS, et al. D icer2dependent path2 ways regulate chondrocyte p roliferation and differentiation [ J ]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105 ( 6 ) : 1949 - 1954. [ 2 ] Sorrentino A, Ferracin M , Castelli G, et al. Isolation and characterization of CD146 + multipotent mesenchymal stro2 mal cells[ J ]. Exp Hematol, 2008, 36 (8) : 1035 - 1046.[ 3 ] Yoshida CA, Yamamoto H, Fujita T, et a l. Runx2 andRunx3 are essential for chondrocyte maturation, and Runx2regulates limb growth through induction of Indian hedgehog[ J ]. Genes Dev, 2004, 18 (8) : 952 - 963. 325