第九章 溶血性贫血

nullnull第九章 溶血性贫血编辑制作 杨晓斌 李克勤 第九章 溶血性贫血第九章 溶血性贫血编辑制作杨晓斌第一节　概述第一节　概述一、溶血性贫血的类型一、溶血性贫血的类型二、溶血性贫血的发病机制二、溶血性贫血的发病机制红细胞过早地被破坏可以发生在血管外或血管内。 血管外溶血即红细胞被脾、肝的单核-巨噬细胞系统吞噬后破坏。 血管内溶血是红细胞直接在血循环中破裂，红细胞的内容物血红蛋白直接被释放入血浆。二、溶血性贫血的发病机制二、溶血性贫血的发病机制三、溶血性贫血的诊断三、溶血性贫血的诊断方法血管内溶血和血管外溶血的鉴别血管内溶血和血管外溶血的鉴别null不同类型溶血性贫血试验选择四、溶血性贫血的过筛试验四、溶血性贫血的过筛试验（一）血浆游离血红蛋白测定（一）血浆游离血红蛋白测定（一）血浆游离血红蛋白测定（一）血浆游离血红蛋白测定（二）血清结合珠蛋白测定（二）血清结合珠蛋白测定（二）血清结合珠蛋白测定（二）血清结合珠蛋白测定（三）尿含铁血黄素试验（三）尿含铁血黄素试验（三）尿含铁血黄素试验（三）尿含铁血黄素试验（四）高铁血红素白蛋白试验【参考区间】正常人呈阴性（四）高铁血红素白蛋白试验（四）高铁血红素白蛋白试验（四）高铁血红素白蛋白试验第二节 红细胞膜缺陷检查及其应用第二节 红细胞膜缺陷检查及其应用红细胞直径为6～9μm，呈双层凹面的圆盘状一、概述一、概述低渗溶液中，血红蛋白逸出，红细胞残留的完整的红细胞膜，称为影细胞红细胞膜蛋白质占49.3％、脂质42％、糖类8％蛋白质与脂质的比例约为1:1；比值变化与膜的功能相关，两者在很大程度上着膜的理化特征任何原因引起的溶血都必然有红细胞膜的缺陷或损伤一、概述一、概述红细胞膜结构红细胞膜结构红细胞膜结构膜的内外两层的组分和功能有明显的差异，称为膜的不对称性红细胞膜结构红细胞膜的功能红细胞膜的功能血型抗原 老化抗原影响变形性因素： ①膜骨架蛋白组分和功能状态 ②膜脂质流动性大有利于变形 ③细胞面积与体积比值 ④血红蛋白的质和量 ⑤膜的离子通透性二、实验室检查二、实验室检查（一）红细胞渗透脆性试验（一）红细胞渗透脆性试验红细胞在不同浓度的低渗盐溶液中，水分通过红细胞膜进入细胞内，当水渗透达一定程度时，红细胞发生膨胀破裂。根据不同浓度的低渗盐溶液中红细胞溶血的情况，反映红细胞对低渗盐溶液的抵抗能力。低渗盐低渗盐红细胞对低渗的抵抗能力与其表面积与容积的比值有关，比值小，说明红细胞容积已胀大，对低渗抵抗力小，渗透脆性增加；反之抵抗力增大，渗透脆性降低。（一）红细胞渗透脆性试验（一）红细胞渗透脆性试验（二）红细胞孵育渗透脆性试验（二）红细胞孵育渗透脆性试验正常人的红细胞经孵育处理后，其渗透脆性变化不明显，而有细胞膜缺陷或某些酶缺陷的红细胞，由于其内的葡萄糖和ATP很快被消耗，孵育后脆性明显增加。（二）红细胞孵育渗透脆性试验（二）红细胞孵育渗透脆性试验（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验在孵育时，加入葡萄糖和ATP作为纠正物，观察溶血可否有一定的纠正，称为纠正试验。【参考区间】 正常人红细胞孵育48小时，不加纠正物的溶血率<4.0%，加葡萄糖的溶血率<1.0%，加ATP纠正物的溶血率<0.8%。（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验（三）红细胞自身溶血试验 及其纠正试验（四）酸化甘油溶血试验（四）酸化甘油溶血试验遗传性球形红细胞增多症的红细胞膜脂质减少，表面积/体积的比值降低、细胞球形化，膜蛋白及膜脂质有缺陷当甘油存在于低渗溶液时，可阻止低渗溶液中的水快速进入红细胞内，减慢溶血过程。但甘油与膜脂质又有亲和性，可使膜脂质逐步溶解而减少。它们在pH6.85的甘油缓冲液中比正常红细胞溶解速度快，导致红细胞悬液的吸光度降至50%的时间（AGLT50）明显缩短。【参考区间】正常人AGLT50>290s 【应用评价】遗传性球形红细胞增多症AGLT50明显缩短（15~25s）。自身免疫性溶血性贫血、肾功能衰竭、妊娠等AGLT50也可缩短。（五）酸化血清溶血试验（五）酸化血清溶血试验正常人的血清，在pH6.4～pH6.6条件下酸化，补体被激活PNH患者体内存在对补体敏感的红细胞，在此条件下发生溶血。 而正常人的红细胞不被溶解。 将血清加热56℃30min灭活补体后，血清失去溶血作用。本实验是PNH的确证实验；其假阳性和假阴性较少见，但如患者多次输血而使其补体敏感红细胞相对减少时，可呈弱阳性或阴性。某些自身免疫性溶血性贫血患者溶血发作严重时也偶呈阳性，此时，如果血清加热破坏补体后，试验结果由阳性转变为阴性，那么更支持PNH的诊断。（六）蔗糖溶血试验（六）蔗糖溶血试验PNH患者因红细胞膜有缺陷而对补体敏感在离低子强度的蔗糖溶液中，补体与细胞膜的结合加强使对补体敏感的红细胞膜造成缺损，红细胞溶解破损【参考区间】正常人为阴性 【应用评价】本试验比酸溶血试验敏感，但特异性较差，是PNH简易过筛试验。再生障碍性贫血、巨幼红细胞性贫血和自身免疫性溶血性贫血患者也可出现阳性，故必要时需做酸化血清溶血试验加以鉴别。（七）血细胞表型（七）血细胞表型分析（八）红细胞膜蛋白电泳分析（八）红细胞膜蛋白电泳分析三、红细胞膜缺陷检查的应用三、红细胞膜缺陷检查的应用（一）遗传性球形红细胞增多症（一）遗传性球形红细胞增多症是一种红细胞膜蛋白结构异常所致的遗传性溶血病，其特点是外周血中出现较多小球形红细胞。 多呈常染色体显性遗传，少数呈常染色体隐性遗传的HS常合并新的基因突变而发病，研究显示HS有第8号染色体短臂缺失。 贫血、黄疸和脾肿大，是最常见的临床表现实验室检查实验室检查1．血象 血红蛋白和红细胞量多为正常或轻度降低，血片中出现小球形红细胞为本病的血液形态学特征；网织红细胞增加，一般为5%～10%，急性溶血发作时可高60%～70%。嗜多色性红细胞增多，外周血中可出现少数幼稚红细胞。 2．骨髓象 红细胞增生旺盛，粒红比值降低，红细胞系以中、晚幼红细胞为主，可占有核细胞的25%～60%；当发生再障危象时，骨髓中红细胞系再生低下，有核红细胞减少。 3．渗透脆性试验 HS红细胞渗透脆性增高 4．红细胞膜电泳分析 SDS-PAGE电泳可得到红细胞膜蛋白各组分的百分率，80%的患者可发现异常。 5．红细胞膜蛋白定量测定 绝大多数HS有一种或多种膜蛋白缺乏 6．分子生物学技术应用球形红细胞较正常红细胞小、厚，且深染，大小比较均一，直径变小（6.2～7.0µm），厚度增加（2.2～3.4µm），染色后细胞中央淡染区消失，小球形红细胞所占的比例在不同的患者中差别较大，多数患者在10%以上（正常人多<5%）。诊断和鉴别诊断诊断和鉴别诊断（二）遗传性椭圆形红细胞增多症（二）遗传性椭圆形红细胞增多症是一组由于红细胞膜蛋白异常引起的异质性家族遗传性溶血病，其共同特点是外周血中存在大量的椭圆形成熟红细胞。HE大多为常染色体显性遗传，极少数为常染色体隐性遗传。定义本病的原发病变是膜骨架蛋白异常，其膜收缩蛋白结构有缺陷，膜骨架稳定性降低。HE的红细胞在骨髓释放入血液循环后由于膜骨架蛋白的缺陷，在通过微循环时由于切变力的作用变成椭圆形后不能恢复正常，同时，红细胞由于膜骨架稳定性的降低容易破坏，大多数椭圆形红细胞在脾脏被破坏。诊断和鉴别诊断诊断和鉴别诊断1．血象 有轻重不等的贫血，隐匿型可表现正常。血片中椭圆形红细胞的比例大于25%。其形状呈椭圆形、卵圆形、棒状或腊肠形，椭圆形红细胞横径与纵径之比小于0.78，硬度增加，中心淡染区消失。 2．骨髓象 骨髓红细胞系统增生活跃为增生性贫血骨髓象。 3．红细胞渗透脆性试验 红细胞渗透脆性试验和自身溶血试验多增高。 4．红细胞膜蛋白电泳分析及低离子强度非变性凝胶电泳膜收缩蛋白分析 其异常结果有助于膜分子病变的确定。 5．分子生物学方法 检测某些膜蛋白基因突变。依据临床表现、家族调查和相关实验室检查多数病例可确诊，无阳性家族史时若椭圆形红细胞大于50%也可明确诊断。本病应与缺铁性贫血、巨幼细胞贫血、骨髓纤维化、骨髓病性贫血、骨髓增生异常综合征、珠蛋白生成障碍性贫血等鉴别。（三）遗传性口形红细胞增多症（三）遗传性口形红细胞增多症诊断和鉴别诊断诊断和鉴别诊断血片中口形红细胞增多，可达10%~50%。口形红细胞中心苍白区呈狭窄的裂缝，裂缝的中央较两端更为狭窄，缝的边缘清楚，类似微张的鱼口；而在湿血片中，红细胞双凹面消失而呈单面凹，形似碗状。正常人外周血中也可见到少量口形细胞，一般为小于4%。 贫血一般轻微，血红蛋白很少低于80g/L，多数患者网织红细胞增多，约10％~20％；红细胞渗透脆性试验增高，也可正常或降低；自身溶血可呈阳性，可被葡萄糖或ATP部分纠正。依据临床表现、外周血口形红细胞增多和家族史一般可作出诊断。但需要与继发性口形红细胞增多症相鉴别，继发性口形红细胞增多症除口形红细胞增多外，一般无溶血，缺乏家族史，并具有相应疾病的特征。（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症（四）阵发性睡眠性血红蛋白尿症实验室检查实验室检查1．血象 贫血，呈正色素性或低色素性贫血，网织红细胞常增高，可见有核红细胞及红细胞碎片。白细胞和血小板多减少，半数患者呈全血细胞减少。 2．骨髓象 半数以上的患者三系增生活跃，尤以红系造血旺盛。随病情变化表现不一，不同穿刺部位增生程度可明显差异。 3．特殊溶血试验 （1）溶血存在的依据：尿隐血试验或尿含铁血黄素试验阳性。 （2）补体敏感的红细胞存在的依据：蔗糖溶血试验、热溶血试验、酸化血清溶血试验。 4．流式细胞术检测发现GPI锚连接蛋白（CD55或CD59）低表达的异常细胞群，支持PNH诊断。本试验是目前诊断PNH特异性和敏感性最高且可定量的检测方法。诊断和鉴别诊断诊断和鉴别诊断1．诊断标准 ①临床表现符合PNH或上述必须考虑为PNH的表现情况； ②有肯定的血红蛋白尿发作或血管内溶血的直接、间接证据； ③实验室检查证明有补体敏感的红细胞群存在和检测CD55及CD59这两种常见的血细胞表面锚蛋白相关抗原的表达情况是确诊试验。 2．鉴别诊断 排除其他溶血病，全血细胞减少还应与再障鉴别。 3．再障-PNH综合症的诊断 凡再障转化为PNH，或PNH转化为再障，或兼有两病特征者，均属再障－PNH综合征。再障-PNH综合症再分为四种情况： （1）再障-PNH：指原有肯定的再障（而非未能诊断的PNH早期表现），转为可确定的PNH，再障的表现已不明显。 （2）PNH-再障：指原有肯定的PNH（而非下述的第4类），转为明确的再障，PNH的表现已不明显。 （3）PNH伴有再障特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以PNH为主，但伴有一个或一个以上部位骨髓增生低下、巨核细胞减少、网织红细胞不增高等再障表现者。 （4）再障伴有PNH特征：指临床及实验室检查所见均说明病情仍以再障为主，但伴有PNH的实验诊断结果阳性者。PNH与再障的鉴别PNH与再障的鉴别第三节 红细胞酶缺陷检查最常见的为葡萄糖6-磷酸脱氢酶缺陷症、丙酮酸激酶缺陷症。第三节 红细胞酶缺陷检查一、红细胞的糖代谢一、红细胞的糖代谢二、实验室检查二、实验室检查1.加入亚硝酸盐使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白，正常红细胞的G-6-PD催化戊糖旁路使NADP成NADPH，其脱下的氢通过亚甲蓝试剂的递氢作用而使高铁血红蛋白（Fe3+）还原成亚铁血红蛋白（Fe2+），比色测定。 2.当G-6-PD缺乏症时，由于NADPH生成减少或缺乏，高铁血红蛋白不被还原或还原速度减慢，高铁血红蛋白还原率下降。 3.正常人高铁血红蛋白还原率≥75%（脐带血≥77%）。 4.G-6-PD缺乏时，高铁血红蛋白还原率下降。中间缺乏（杂合子）为31%～74%，严重缺乏（半合子或纯合子）<30%。二、实验室检查G-6-PD缺乏的病人血样加入乙酰苯肼于37℃孵育2～4小时，使血红蛋白变性，用煌焦油蓝等碱性染料染色观察红细胞珠蛋白小体的生成情况，计算含5个及以上珠蛋白小体的红细胞的百分率。 正常人含5个及以上珠蛋白小体的红细胞一般<30%。二、实验室检查应用评价应用评价1．G-6-PD缺乏症常高于45%，可作G-6-PD缺乏的筛检试验。但还原型谷胱甘肽缺乏症也增高；不稳定血红蛋白病含小体的细胞百分率为75%～84%，HbH病和化学物质中毒时也增高。 2．变性珠蛋白小体，主要是α、β珠蛋白链的病变而引起的溶解度和稳定性降低所致；是一种变性血红蛋白颗粒，一般附着在细胞膜上，故又称血红蛋白包涵体，变性珠蛋白小体可被碱性染料着色。该实验与异丙醇试验和热不稳定实验一样可作为不稳定血红蛋白存在的一种证据。 3．G-6-PD活性正常时，红细胞通过磷酸戊糖旁路形成NADPH使MHb还原成亚铁血红蛋白，因而含变性珠蛋白小体的红细胞减少，而G-6-PD活性减低时，NADPH减少，MHb增多，导致含变性珠蛋白小体的红细胞增多，不稳定血红蛋白由于血红蛋白分子结构发生改变，稳定性减低易被氧化，含变性珠蛋白小体的红细胞可增多，伯氨喹啉型溶血性贫血，含变性珠蛋白小体的红细胞也可增多。二、实验室检查在G-6-PD和NADP+存在下，G-6-PD能使NADP+还原成NADPH，后者在紫外线照射下会发出荧光。NADPH的吸收峰在波长340nm处，可通过单位时间生成的NADPH的量来测定G-6-PD活性。G-6-PD缺陷见于蚕豆病、伯氨喹啉型药物性溶血性贫血。利用此实验可对高发区域人群或疑诊的新生儿进行筛查。正常人有很强荧光。正常人酶活性为： （8.34±1.59）U/gHb（37℃）（ICSH推荐的Glock与McLean法） （12.1±2.09）U/gHb（37℃）（WHO推荐的Zinkham法） G-6-PD缺陷者的荧光很弱或无荧光；杂合子或某些G-6-PD变异者则可能有轻到中度荧光。二、实验室检查二、实验室检查在ADP存在的条件下催化PEP转化成丙酮酸，在NADH的作用下，丙酮酸被LDH转化为乳酸，荧光标记NADH上，此时有荧光的NADH变为无荧光的NAD，检测以上过程荧光消失的时间反应PK的活性。荧光斑点不消失或时间延长说明丙酮酸激酶活性缺乏，中间缺乏（杂合子）时，荧光25～60分钟消失，严重缺乏（纯合子）时，荧光60分钟不消失。正常人丙酮酸激酶活性斑点在25分钟内消失。 酶活性（15.0±1.99）U/gHb。二、实验室检查三、红细胞酶缺陷检查的应用三、红细胞酶缺陷检查的应用实验室检查实验室检查1．溶血的检查 非遗传性有诱因，急性溶血，血管内溶血；而遗传性非球形细胞溶血性贫血具有慢性血管外溶血的实验室特征 2．G-6-PD缺乏的筛检试验 高铁血红蛋白还原试验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝纸片法。荧光斑点试验的特异性最高，高铁血红蛋白还原试验的敏感性最强 3．G-6-PD确诊试验 G-6-PD活性定量检测能准确反映酶的活性。诊断和鉴别诊断诊断依据是红细胞G-6-PD活性的实验室检查，临床表现及阳性家族史 如筛选试验中两项中度异常；或一项筛选试验中度异常加上Heinz小体生成试验阳性（有40%红细胞含Heinz小体，每个红细胞有5个以上Heinz小体）并排除其他溶血病因；或一项筛选试验中度异常，伴有明确的家族史；或一项筛检试验严重异常；或定量测定G-6-PD活性较正常平均值降低40%以上，均可确诊。诊断和鉴别诊断三、红细胞酶缺陷检查的应用1.PK基因缺陷，常染色体隐性遗传，仅次于G-6-PD缺陷症 2.PK缺陷时，ATP产生减少，引起血管外溶血，表现为慢性溶血性贫血。检验 1．筛检试验 红细胞自溶血试验、 PK荧光斑点试验 2．酶活性定量试验 PK活性检测 3．ATP测定 4．中间代谢产物测定 ①2，3-二磷酸甘油酸（2，3-DPG） ②磷酸烯醇式丙酮酸（PEP） ③2-磷酸甘油酸（2-PG）诊断和鉴别诊断 1．红细胞PK缺乏的实验室诊断标准 2．遗传性红细胞丙酮酸激酶缺乏症主要通过红细胞PK活性的测定进行诊断。三、红细胞酶缺陷检查的应用第四节 血红蛋白病检查第四节 血红蛋白病检查成熟红细胞内的主要蛋白质是血红蛋白（Hb），占细胞干重的96%，占细胞容积的35%。正常血红蛋白由两对珠蛋白肽链和4个亚铁血红素构成的4个亚基组成的四聚体，形状近似球形的结合蛋白。血红蛋白的合成受铁的供应、原卟啉和珠蛋白合成的影响。（一）血红蛋白的结构 （一）血红蛋白的结构 （一）血红蛋白的结构 血红素是铁原子和原卟啉Ⅸ的复合物，是含铁卟啉衍生物，铁原子位于原卟啉Ⅸ的卟啉环中心。血红素是血红蛋白的组成成分，是Hb、Mb、多种酶和多种细胞色素的辅基，其合成于有核红细胞和肝细胞的线粒体内。血红素合成后，离开线粒体，在胞质内与珠蛋白肽链结合为血红蛋白；血红素由脾脏、骨髓、肝脏中的巨噬细胞吞噬降解。在血红素合成过程中酶的缺陷引起卟啉或其前体在体内蓄积可导致卟啉病。珠蛋白按四级结构与血红素形成血红蛋白，血红蛋白的每个亚基由一条珠蛋白肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下成球形，把血红素分子包在里面，这条肽链盘绕成的球形结构又被称为珠蛋白。（一）血红蛋白的结构 （二）影响血红蛋白结构和功能的因素（二）影响血红蛋白结构和功能的因素二、实验室检查二、实验室检查二、实验室检查根据不同的血红蛋白带有不同的电荷，等电点不同，在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb的等电点时其带负电荷，电泳时在电场中向阳极泳动；反之，Hb带正电荷向阴极泳动，不同的血红蛋白所带电荷和相对分子量不同，可分离出各自的区带。1．通过与正常人的血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带。如HbH、HbE、Hb Barts、HbS、HbD和HbC等异常血红蛋白。 2．HbA2增多，见于β珠蛋白生成障碍性贫血，为杂合子的重要实验室诊断指标。HbE病时也在HbA2区带位置处增加，但含量很大。HbA2轻度增加亦可见于肝病、肿瘤和某些血液病。1．pH8.6TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 ，适合于检出HbA、HbA2、HbS、HbC，但HbF不易与HbA分开，HbH与Hb Barts不能分开和显示。 2．pH6.5TEB缓冲液醋酸纤维膜电泳 主要用于HbH和Hb Barts的检出。二、实验室检查二、实验室检查胎儿血红蛋白（HbF）具有比HbA更强的抗碱作用，将待检的溶血液与一定量的NaOH溶液混合，作用1分钟后加入半饱和硫酸铵中止碱变性反应。HbF抗碱变性作用强，没有变性存在于上清中，而HbA变性沉淀，取上清液于540nm处测定吸光度，检测出HbF的浓度。【应用评价】 1．HbF绝对增多 珠蛋白生成性贫血时HbF增加，重型者达30%～90%，中间型常为5%～30%，轻型小于5%。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征患者，HbF可高达100% 2．HbF相对增多 某些血液疾病 3．HbF生理性增多 多见于孕妇及新生儿。【参考区间】成人<2%，新生儿<40%二、实验室检查二、实验室检查HbF具有抗碱和抗酸作用，其抗酸能力比HbA强。将血涂片于酸性缓冲液中孵育，含HbF的红细胞不被酸洗脱，可被伊红染成红色，而含HbA的红细胞均被酸洗脱，不能被伊红着色 【应用评价】 珠蛋白生成障碍性贫血着色细胞增加，重型患者大多数红细胞染成红色，轻型患者可见少数染成红色的细胞。遗传性胎儿血红蛋白持续综合征全部红细胞均染为红色。【参考区间】正常血片含HbF的着色红细胞<0.02（<2%）；孕妇可有轻度增加。二、实验室检查二、实验室检查在异丙醇这种能降低血红蛋白分子内部氢键的非极性溶剂中，不稳定血红蛋白更快地裂解沉淀。通过观察血红蛋白液在异丙醇中的沉淀现象对不稳定血红蛋白进行筛检。 【应用评价】 不稳定血红蛋白存在时，常于5分钟时出现沉淀，20分钟开始出现绒毛状沉淀。血液中含有较多HbF、HbH、HbE时也可出现阳性结果。【参考区间】正常人血红蛋白液为阴性（30分钟内不沉淀）二、实验室检查二、实验室检查是根据不稳定血红蛋白比正常血红蛋白更容易遇热变性，观察血红蛋白液在50℃时是否出现沉淀，对不稳定血红蛋白进行筛检。 【应用评价】 血红蛋白沉淀率增加，说明不稳定血红蛋白的存在。【参考区间】正常人热沉淀的血红蛋白<1%二、实验室检查二、实验室检查将煌焦油蓝液与新鲜血液一起孵育，不稳定血红蛋白易变性沉淀形成包涵体。观察温育2h含包涵体的红细胞是否比温浴10min的阳性细胞多，可了解是否有HbH等不稳定血红蛋白的存在。【参考区间】正常人<0.01（<1%）温育10min 10min～2h 3h或更长网织红细胞显现出来HbH病红细胞内包涵体形成其它不稳定血红蛋白形成珠蛋白变性沉淀【应用评价】 1．不稳定血红蛋白病 孵育1～3小时多数红细胞内可出现变性珠蛋白肽链沉淀形成的包涵体。G-6-PD缺乏或细胞还原酶缺乏及化学物质中毒等，红细胞中也可出现包涵体。 2．HbH病 孵育1小时就可出现包涵体，也叫HbH包涵体。二、实验室检查三、血红蛋白病检查的应用 三、血红蛋白病检查的应用 血红蛋白病: 由遗传性或基因突变所致的珠蛋白肽链结构异常或合成肽链速率的改变，而引起血红蛋白功能异常所致的疾病（一）珠蛋白生成障碍性贫血（一）珠蛋白生成障碍性贫血1．β珠蛋白生成障碍性贫血 1．β珠蛋白生成障碍性贫血 是珠蛋白生成障碍性贫血中发病率最高的一种类型。第11号染色体上控制β珠蛋白链合成的基因突变，β珠蛋白链合成受到抑制，杂合子的α链的合成速度比β链快2.0~2.5倍，纯合子的α链合成的速度超过β链更多，甚至可完全没有β链合成。多余的α链将导致： （1）α链聚合成不稳定的四聚体（α4）增加，HbA2和HbF含量增加。 （2）很不稳定，容易发生沉淀，形成靶形红细胞； （3）α链包含体附着于红细胞膜，使红细胞僵硬，导致无效造血。 （4）红细胞对钾离子的通透性增加，能量代谢能力降低，生存期缩短。（一）珠蛋白生成障碍性贫血（一）珠蛋白生成障碍性贫血（一）珠蛋白生成障碍性贫血2．α珠蛋白生成障碍性贫血2．α珠蛋白生成障碍性贫血由于α珠蛋白基因的缺乏或缺陷使α珠蛋白链合成速度明显降低或几乎不能合成引起的。 由第16对染色体上两对联锁的α珠蛋白基因（父母双方各继承两个）所控制。（一）珠蛋白生成障碍性贫血（一）珠蛋白生成障碍性贫血（一）珠蛋白生成障碍性贫血各型珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白电泳结果各型珠蛋白生成障碍性贫血的血红蛋白电泳结果（一）珠蛋白生成障碍性贫血（二）异常血红蛋白病（二）异常血红蛋白病出现异常血红蛋白S的常染色体显性遗传疾病。因HbA的β链形成HbS（Hbα2β26谷→缬），当血氧过低时HbS互相聚集，形成纤维状多聚体。，当有足够的多聚体形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形，此过程称“镰变”。【实验室检查】血红蛋白降低，红细胞大小不均，出现异形细胞、多染性红细胞、有核红细胞、靶形红细胞等，镰状红细胞不多见。网织红细胞常大于10%。红细胞镰变试验阳性，红细胞渗透脆性明显降低。血红蛋白电泳，可见HbS带位于HbA和HbA2间，采用基因分析，可作出基因诊断。HbS病有三种表现形式： ①纯合子形式，即镰状细胞贫血； ②杂合子形式，即红细胞镰状细胞性状； ③HbS和其他异常血红蛋白的双杂合子状态（二）异常血红蛋白病是β链第26位谷氨酸被赖氨酸替代的异常血红蛋白(α2β226谷-赖)。HbE病是出现血红蛋白E的常染色体不完全显性遗传性血红蛋白病，为我国最常见的血红蛋白病。【实验室检查】多为小细胞低色素性轻度贫血，红细胞渗透脆性降低，血红蛋白电泳显示HbE占75%~92%，因HbE不稳定，异丙醇沉淀试验阳性和热变性试验弱阳性；变性珠蛋白小体检测阳性。三种类型：HbE纯合子、HbE特征和HbE/β珠蛋白生成障碍性贫血 临床表现一般为轻度溶血性贫血，脾不肿大或轻度肿大，呈小细胞低色素性贫血，易感染并使贫血加重。（二）异常血红蛋白病（二）异常血红蛋白病是由于控制血红蛋白的肽链的基因突变，某些维持稳定性的氨基酸被取代或缺失，致使血红蛋白结构不稳定，称为不稳定血红蛋白本病诊断有重要意义的是变性珠蛋白小体检查、热变性试验和异丙醇沉淀试验为阳性，一般用异丙醇试验筛选，热变性试验和变性珠蛋白小体检查诊断。 多为正细胞性贫血，红细胞大小不均，有异形和碎片，有时可见靶形红细胞，网织红细胞增高。 血红蛋白电泳仅有部分病例可分离出异常血红蛋白区带。易变性和沉淀，形成变性珠蛋白小体 相应临床表现差异大（二）异常血红蛋白病第五节 免疫性溶血性贫血的检查第五节 免疫性溶血性贫血的检查检查抗体性质明确诊断方向判断效价水平评估疾病程度查找疾病原因检查目的编辑制作李克勤一、概述一、概述 免疫性溶血性贫血-是由于免疫功能紊乱产生某种抗体能与自己正常红细胞表面的抗原结合或激活补体，引起红细胞过早破坏而导致的一组获得性溶血性贫血，统称免疫性溶血性贫血。 定义：一、概述免疫性溶血性贫血的分类一、概述二、实验室检查二、实验室检查（一）直接抗人球蛋白试验（DATG） 【原理】自身免疫性溶血性贫血的自身抗体（IgG），是不完全抗体，结合在红细胞表面，使其致敏。直接抗人球蛋白试验（DAGT），是应用抗人球蛋白试剂（抗IgG和／或抗C3d）与红细胞表面的IgG分子结合，并出现凝集反应。红细胞表面如果不存在自身抗体，则凝集反应呈阴性。 抗人球蛋白试验原理抗人球蛋白试验原理＋已知红细胞抗原IgG抗体被IgG抗体致敏红细胞抗人球蛋白抗体抗人球蛋白原理示意图凝集为阳性直接反应间接反应【 DAGT测定】【 DAGT测定】【试剂】 （1）抗人球蛋白血清,主要为抗IgG血清（适当稀释，按出厂说明）。 （2）正常O型人（2人以上）混合比容红细胞。 （3）抗D（Rh）血清。 （4）AB型血清。【方法】 1.红细胞悬液制备 将被检比容红细胞洗涤3次后，配成5%红细胞生理盐水悬液。 2.阴、阳性对照的红细胞悬液制备如下表，分别得到各5%的红细胞生理盐水悬液。null阴、阳性对照的红细胞悬液制备DAGT 对照红细胞悬液制备DAGT 对照红细胞悬液制备阳性对照管 阴性对照管 O型混合比容红细胞2滴 O型混合比容红细胞2滴 抗D（Rh）血清4滴 AB型血清4滴 370C水浴1h→离心弃去上清液→洗涤3次→分别配成5%红细胞悬液。 【 DAGT 操作步骤】 【 DAGT 操作步骤】 被检RBC悬液2滴 阳性对照RBC悬液2滴 阴性对照RBC悬液2滴 被检RBC悬液2滴 抗IgG血清2滴 抗IgG血清2滴 抗IgG血清2滴 生理盐水2滴 ↓ ↓ ↓ ↓ 测定管 阳性对照管 阴性对照管 盐水对照管 将以上各管混匀→5分钟（或低速离心1分钟）→观察结果。 　　 直接抗人球蛋白（DAGT） 操作步骤示意图【 DAGT 结果观察】【 DAGT 结果观察】 测定管凝集 阳性对照管凝集 阴性对照管不凝集 盐水对照管不凝集阳性结果测定管不凝集 阳性对照管凝集 阴性对照管不凝集 盐水对照管不凝集 　　　　直接抗人球蛋白（DAGT） 结果观察示意图阴性结果 【 DAGT 】【 DAGT 注意事项】1.所有试验用红细胞及血清都应新鲜。 2.试验器材应防止污染血浆蛋白，以免带 有球蛋白而出现假阴性。 3.所用红细胞必须洗涤，未洗涤红细胞不能用于本试验。（二）间接抗人球蛋白试验（IAGT）（二）间接抗人球蛋白试验（IAGT）【原理】 间接试验是检查血清中游离的不完全抗体的试验。本试验是应用已知红细胞与抗人球蛋白血清，检测被检者血清中是否含有相应的不完全抗体，如果存在，则已知红细胞被致敏，再加入抗人球蛋白血清，可出现凝集。【 IAGT 方法】【 IAGT 方法】 被检者标本制备：按直接法制备被检者5%红细胞悬液；血清。 操作步骤：取小试管4支，做好标记按下表加反应物。【 IAGT 操作步骤】【 IAGT 操作步骤】RBC悬液（已知）1滴 D阳性RBC1滴 D阳性RBC1滴 被检RBC悬液1滴 血清（被检）2滴 不完全抗D血清2滴 A B型血清2滴 生理盐水2滴 测定管 阳性对照 阴性对照 盐水对照 　间接抗人球蛋白（IAGT） 操作步骤示意图→混匀→37℃水浴1小时→各管分别洗涤3次后→留1滴红细胞悬液→分别加入抗人球蛋白血清1滴混匀→5分钟后（或低速离心1分钟）看结果。【 IAGT 结果观察】【 IAGT 结果观察】 测定管凝集 阴性对照管不凝集 测定管不凝集 阳性对照管凝集 阳性对照管凝集 盐水对照管不凝集 阴性对照管不凝集 盐水对照管不凝集　　　　间接接抗人球蛋白（IAGT）结果观察示意图阳性结果 阴性结果 【 DAGT 与IAGT临床意义】【 DAGT 与IAGT临床意义】 自身免疫性溶血性贫血 药物诱发性免疫性溶血性贫血 新生儿溶血病 ；结缔组织病Rh和ABO血型不合的妊娠（IAGT） 阳性见于： （DAGT） 阳性见于： （三）冷凝集素试验（CAggT）（三）冷凝集素试验（CAggT）【原理】冷凝集素为IgM类完全抗体，在低温时可使自身红细胞、0型红细胞或与受检者血型相同的红细胞发生凝集，凝集反应的高峰在0℃～4℃，当温度回升到37℃时凝集消失。 【试剂】 1.正常O型或与受检者相同血型2%红细胞悬液（悬液制备方法同DAGT法）。 2.生理盐水【 CAggT 方法】【 CAggT 方法】1.取患者静脉血3 ml～4ml→凝固后→离心分离血清→吸出血清备用。 2.操作步骤 取17只试管按下表加反应物。O型2%红细 胞悬液ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2试管号 1 2 3 4 5 6 … 16 17 生理盐水ml 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 … 0.2 0.2被检血清ml 0.2 0.2倍比稀释（混 匀并吸出）ml 0.2 → 0.2 → 0.2 → 0.2 → 0.2 … 弃去注：表中“→”表示混匀后并吸出液体ml数；表中“…”表示省略试管号【 冷凝集素试验操作步骤】【 冷凝集素试验操作步骤】3．冷藏与水浴 将以上试管混匀→冷藏（2～5℃）2h→取出观察结果→记录凝集管最高稀释度→再将所有试管放入37℃水浴2h→取出观察凝集是否消失。【 CAggT 临床意义】 【 CAggT 临床意义】 正常人血清抗红细胞抗原的lgM冷凝集素效价≤1︰32（4℃）。 阳性见于： 冷凝集素综合征（>1：1 000）。支原体肺炎、传染性单核细胞增多症、肝硬化、淋巴瘤及多发性骨髓瘤者亦可增高，但不超过l︰1 000。 （四）冷热溶血试验（D-LT）（四）冷热溶血试验（D-LT）【原理】 冷热溶血试验，是模拟病人发病的体外试验。将病人的血液置于O～4℃冰箱中，此环境能使D—L型冷反应性抗体与红细胞牢固结合，并同时结合补体，但无溶血，之后再将温度升至37℃使补体激活，并发生溶血，以此与PNH鉴别。【 D-LT方法】【 D-LT方法】1．血清制备 用物理的方法制备血清备用。 2．红细胞悬液制备 被检者和正常人的红细胞→洗涤3次→配成50%的红细胞悬液备用。 3．操作步骤 取试管9支，做好标记按下表加反应物。 null冷热溶血试验操作步骤4.将上述试管放置冰箱冷藏30分钟后，再放置37℃水浴30分，低速离心，观察各管上层有无溶血。null三、免疫性溶血性贫血检查的应用三、免疫性溶血性贫血检查的应用（一）温抗体型自身免疫性溶血性贫血（温抗体型AIHA） 温抗体型自身免疫性溶血性贫血，根据病因可分为原发性和继发性两种，20%～30%病例原因未明称原发性，其余为继发性。IgG是引起该贫血的主抗体，与红细胞的最适反应温度为35～40℃的自身抗体称为温抗体。【温抗体型AIHA实验室检查分析】【温抗体型AIHA实验室检查分析】正常色素性贫血，血片上可见红细胞大小不一。可见嗜多色性红细胞；点彩红细胞；数量不等的球形红细胞及幼红细胞。网织红细胞增高，极个别可达50% 。其溶血主要发生在血管外。  骨髓有核细胞增生，以幼红细胞增生为主，粒/红比例倒置，幼红细胞可呈巨幼样变，但血清叶酸及维生素B12测定都在正常范围。再生障碍时呈再障危象，为全血细胞减少骨髓象变化。null3.温抗体型AIHA直接Coombs试验： 直接抗人球蛋白试验(DAT)阳性，是诊断温抗体型自身免疫性溶血性贫血重要指标。 【温抗体型AIHA实验室检查分析】【温抗体型AIHA鉴别诊断】 【温抗体型AIHA鉴别诊断】 温抗体型AIHA，是由于抗体附着在红细胞表面，导致红细胞呈球形，故应注意与遗传性球形红细胞增多症(HS)相鉴别，HS可有阳性家族史，但无抗自身红细胞的温抗体。 （二）冷抗体型自身免疫性溶血性贫血 第九章 第五节 免疫性溶血性贫血检查（二）冷抗体型自身免疫性溶血性贫血 冷凝集素综合征。 冷抗体型自身免疫性溶血性贫血： 又分为两种类型（三）冷凝集素综合征 CAS （三）冷凝集素综合征 CAS 冷凝集素综合征是冷诱导因素导致的冷凝集素IgM抗体引起的自身免疫性慢性溶血性贫血和微循环阻塞为特征的一组疾病，又叫“冷血凝集素病”。抗体与抗原发生作用的最适宜温度是0 ℃～4℃，在37℃或31℃～32℃以上的温度，抗体与红细胞抗原发生完全可逆的分解，红细胞凝集迅速消失。【 CAS 实验室检查分析】【 CAS 实验室检查分析】1.血液检查 红细胞、血红蛋白低于正常值。血片中红细胞大小不等、异形、嗜多色、红细胞呈缗钱状及自身凝结现象，网织红细胞可见增高。 血片中可见到球形红细胞，但不如温抗体自身免疫溶血性贫血者明显，白细胞计数及血小板计数均正常。 2.血清间接胆红素轻度升高。 3.冷凝集素试验 阳性，抗体几乎均为IgM，抗体效价甚至高至1︰1 000～1︰16 000。 null2.血清间接胆红素轻度升高。 3.冷凝集素试验 阳性，抗体几乎均为IgM，抗体效价甚至高至1︰1 000～1︰16 000。 4.直接抗人球蛋白试验(Coombs) 阳性。发生阳性的原因是抗人球蛋白血清与红细胞表面的C3补体发生反应。因有冷凝集素的作用，故试验必须在37℃条件下进行，在试验前红细胞应先用温盐水洗涤过。 5.骨髓象 骨髓增生活跃，幼红细胞增生显著。 【 CAS 实验室检查分析】【 CAS的鉴别诊断】【 CAS的鉴别诊断】（四）阵发性冷性血红蛋白尿症 PCH （四）阵发性冷性血红蛋白尿症 PCH 阵发性冷性血红蛋白尿症是全身或局部受寒后突然发生的以血红蛋白尿为特征的一种罕见疾病。又称：阵发性寒冷性血红蛋白尿；阵发性冷性血红蛋白尿。 【 PCH 实验室检查分析】【 PCH 实验室检查分析】1.周围血 红细胞大小不一、畸形、并有球形红细胞、红细胞碎片、嗜碱性点彩红细胞、可见幼红细胞。 2.反复发作者 有含铁血黄素尿；发作时尿潜血阳性。 3.冷热溶血试验阳性。 4.抗人球蛋白试验阳性，大多为C3型。【 PCH的鉴别诊断】【 PCH的鉴别诊断】阵发性睡眠性血红蛋白尿症 多为慢性病程，反复出现的血红蛋白尿。实验室检查酸化血清溶血试验（Ham试验）为阳性。 2.温抗体型自身免疫性溶血性贫血 诱因不同，冷热溶血试验阴性。null新生儿同种免疫性溶血性贫血，绝大多数是由于母子血型不合引起，母亲的同种免疫抗体通过胎盘绒毛膜进入胎儿血循环与胎儿红细胞凝集，使之破坏而出现溶血，继而导致贫血等症状。（五）新生儿同种免疫性溶血性贫血 IHDN 【 IHDN 实验室检查分析】【 IHDN 实验室检查分析】 ①血型及血型抗体测定：先查孕妇和丈夫血型，再检测孕妇血型抗体。必要时再做特殊性抗体，如果连续检查发现效价明显上升，提示胎儿受累。②羊水检查：测定羊水胆红素水平。③B型超声检查：了解胎儿有无水肿。①新生儿溶血检查：外周红细胞、血红蛋白下降，网织细胞及有核红细胞增高，血清胆红素增高，其中以未结合胆红素为主。②新生儿血型及血型抗体检查：A、新生儿血型检查；B、新生儿血型抗体检查；C、新生儿致敏红细胞检查。③检查母亲血中有无抗体存在。【 IHDN的诊断和鉴别诊断】【 IHDN的诊断和鉴别诊断】遗传性红细胞G-6-PD缺乏症 在无诱因（常因食用蚕豆、服用或接触某些药物、感染等诱发血红蛋白尿、黄疸、贫血等急性溶血反应）不发病时与正常人一样，而新生儿同种免疫性溶血性贫血则不是。 应与重型遗传性球形红细胞增多症鉴别 重型遗传性球形红细胞增多症有家族遗传史，患者红细胞渗透脆性增加为其主要特征，但Coombs试验阴性。 （六）药物诱发的免疫性溶血性贫血 （六）药物诱发的免疫性溶血性贫血 概述： 药物引起的免疫性溶血性贫血系指某些药物通过免疫机制对红细胞产生免疫性损伤，诱发溶血的贫血。可分为半抗原细胞型、免疫复合型、自身免疫型3种类型。【免疫复合型实验室检查】【免疫复合型实验室检查】null【半抗原细胞型实验室检查】null【自身免疫型实验室检查】第六节 溶血性贫血的实验室诊断第六节 溶血性贫血的实验室诊断二、确定 溶血性贫 血的原因。一、确定 溶血的存 在。（一）临床证据（二）实验室证据 null  ［1］张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准［M］. 第二版.北京.科学出版社， 1998：141-148 ［2］许文荣 临床血液学与检验 .［M］. 第四版.北京.人民卫生出版社，2007.7 ［3］陈方平，血液学检验［M］. 第二版.北京.人民卫生出版社，2006.6【参考文献】