高效液相色谱法在甘油含量测定中应用的研究

高效液相色谱法在甘油含量测定中应用的研究 孙敦伟 , 　吴晓红 , 　张 　琳 (上海出入境检验检疫局 ,上海 200135) 摘 　要 :现有的甘油含量测定化方法 ,都是以假设“无杂质”为基础的。该法与气相色谱法[1 ] , 均以分离色谱为基础 ,解决了滴定法不具分离鉴别的缺点。完善了原气相色谱法在不同含量规格 适用范围上的局限性[1 ] ,使液相色谱法对不同含量规格甘油定量测试的方法标准化成为可能。该 法与气相色谱的“杂质倒扣”法的结合应用和互补 ,使定性鉴别和不同规格甘油含量测定得以完整 组合。其检测下限 :44. 46 ng/μL ,线性相关系数 r = 0. 99999 ,回收率 :98. 03 %～99. 88 % ,重复性 : …S r = 0. 4018 ,€r95 = 1. 125 ,再现性 : …S R = 0. 4463 , …R95 = 1. 250。 关键词 :甘油 (丙三醇) ; 高效液相色谱法 ; 示差折光检测器 ; 含量测定 中图分类号 :O 657. 7 ; TQ 223. 16 　　　文献标识码 :A 文章编号 :036726358 (2007) 112646204 Application of HPLC Method in Determining Content of Glycerol SUN Dun2wei , 　WU Xiao2hong , 　ZHANGLin ( Shanghai Entry2exit Inspection and Quarantine Bureau , Shanghai 200135 , China) Abstract : Current standard methods for determining the content of glycerol are all based on assuming the determined glycerol to have“no impurity”except water. The methods of HPLC and GC[1 ] in glycerol determination are all based on chromatographic fractionation. Therefore , they can overcome the defects of chemical titration method on qualitative identification and impurity separation. This HPLC method will further perfect the limitation that previously existed in GC standard method[1 ] on the applicable range of different content specifications , and make it possible to standardize the test method for the different content specifications of glycerol by HPLC method. It will be a complete combination for qualitative identification and quantitative analysis for the different content specifications of glycerol by the combined application and mutual complement of these HPLC and GC methods. For this method , its’required detection limit is 44. 46 ngΠμL , its’coefficient is 0. 99999 , its’recoveries are 98. 03 %～99. 88 % , its’repeatabilities ( r) are : …S r = 0. 4018 , €r95 = 1. 125 , and its’reproducibilities (R) are : …S R = 0. 4463 , …R95 = 1. 250. Key words : glycerol ( glycerine ; 1 , 2 , 32propanetriol ) ; HPLC ( high performance liquid chromatography) ; RID (differential refractive index detector) ; determination of content (assay) 收稿日期 :2006212209 ;修回日期 :2007208204 作者简介 :孙敦伟 (1957～) ,男 ,上海人 ,高级师 ,主要从事进出口商品的仪器。 1 　目的和意义 甘油是重要的工业、医药和家化产品原料。除 已有的气相色谱“杂质倒扣”法外[1 ,2 ] ,其余现有的国 内外甘油含量测定标准化方法 ,均以假设“无杂质” 为基础的定量测定方法 ,如各国药典和标准中广泛 采纳为仲裁法的滴定法[3 - 7 ] 、和密度法[3 ] 。 上述三种方法 ,各有利弊和局限性。本方法的 目的和特点在于 :利用高效液相色谱适于分析高沸 点不易挥发、受热易分解有机物的特点 ,采用几乎所 ·646· 　　化 　　学 　　世 　　界 2007 年 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 有物质均可检测、浓度敏感型、中等灵敏度的通用型 示差折光检测器 ( RID) ,利用已有的气相色谱对高 含量甘油含量的“杂质倒扣法”获取甘油的标准 品[1 ,2 ] ,研究建立适用于不同含量规格甘油检测的定 性分离和定量测试方法。以解决现有标准中滴定法 不具分离鉴别的缺点和气相色谱法[1 ]在不同含量规 格适用范围上的局限性。 2 　实验 2. 1 　仪器 :Agilent 1100 型或 Waters 2695 型高效液 相色谱仪 ,具有 RID 检测器 ;色谱柱 :NH2 柱 :250 × 4. 6 mm id. , 5 μm ; (如 : Inertsil、Luna、Nucleosil NH2 柱) 。 2. 2 　实验条件 : 2. 2. 1 　“Agilent 1100 + G1362A”系统的色谱条件 : 流动相 :乙腈 :H2O = 85∶15 ( vΠv) [预配 ,抽滤脱 气 3 遍后 ,超声 10 min ] ; 流速 : 1. 0 mL/ min (定性分离时 ,还可采用 0. 5 mL/ min) ; 环境温度 : 15～ 17 ℃; 柱温 : 30 ℃; RID 温度 : 35 ℃; 进样量 :10μL + 淋洗 (流动相) ; 总时间 : 15 min ( tR , Gly≈7 min) (定性分离时 ,总 时间 :25 min) 。 检测前平衡数小时。待 RID 基线稳定呈直线 后 ,连续进数针 ,至峰面积的 RSD ≤1 %。 积分模式 :斜率 ( Slope) = 3000 ,最小积分面积 (Area) = 100。 流动相流出口回收瓶须放置在高于 RID 位置。 注 :“Waters 269522414”系统的色谱条件 : 流动相 :配比不变 ,仅需预配 ,不必预脱气 ,其在线脱气至 2. 76 ～3. 45 kPa ; 环境温度 :不限 ;流出口高度 :无要求 ; 进样量 :放大至 30μL ; 积分模式 :阈值 (Slope) = 50 ,峰宽 = 30 , 0～5 min 禁止积分 ; 流 速、柱温、RID 温度、总时间 :不变。 检测前平衡 1 h。待 RID 基线稳定呈直线后 ,连续进 3 针 ,至峰 面积的 RSD ≤1 %。 2. 2. 2 　样品溶液配制 :甘油称样量 :0. 1 g/ 50 mL ,用 流动相作为稀释剂 ;超声 15 min 后 ,摇匀。 定性分离结果见图 1。 3 　定性方法建立的讨论 1) 定性方法侧重于组分分离 ,对仪器和环境的 要求 ,低于定量方法。 2) 对于替代/ 掺杂甘油中会引起肾衰竭的三种 组分 :乙二醇、二甘醇、三甘醇 ,尽管该三者在此合并 为 1 个峰 ,但与甘油主组分丙三醇峰完全分离 ;并 且 ,用于替代甘油中调节密度、高沸点、无害的食品 保湿剂山梨醇 ,也能在丙三醇后轻易出峰 ,解决了原 气相色谱法中高沸点山梨醇出峰困难滞后的难。 图 1 　0. 5 mL/ min 定性分离图 8. 551 min :水峰 ; 10. 957 min :乙二醇/ 二甘醇/ 三甘醇 ; 14. 918 min :甘 油 (丙三醇) 。 图 2 　1. 0 mL/ min 定性分离图 4. 318 min :水峰 ; 5. 598 min :乙二醇/ 二甘醇/ 三甘醇 ; 7. 707 min :甘油 (丙三醇) ; 21. 654 min :山梨醇。 　　3) 为了达到较佳的分离效果 ,采用氨基 (NH2 ) 柱远好于阳离子交换糖柱。 如此 ,对药用、食用级甘油起到了定性鉴别作 用。 4 　定量方法建立的讨论 4. 1 　影响定量方法因素的研究 1) 影响基线 (动态背景)的因素 a. 室温的波动 良好恒定的检测环境温度、或系统有良好的热 屏蔽效果 ,对检测精度是至关重要的。 b. 压力的变化 为避免流动池中气泡的形成 ,使检测池在一定 压力下工作 ,应将流出液回收瓶放置在高于 RID 出 口之上方 ,或在 RID 流出口安装增压盘管。 c. 流动相的脱气方式 在 5 种方式中 ,在线脱气法效果最好 ,加热回流 法操作过繁 ,超声法脱气效果最差。惰性气体法 ,需 另有专用装置。抽真空法 ,在本条件下对二元系流 动相组分影响不大 ;对于在线脱气装置功能较差的 系统 ,是一种实用、便捷、可操作的补充脱气方法 ,可 满足 RID 检测的一般性要求。 目前的抽真空脱气法是 :在每天使用前 ,将流动 ·746·第 11 期 化 　　学 　　世 　　界 　　　　　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 相预配液采用 ≤0. 45μm 孔径的滤膜 ,在负压 0. 08 MPa 下 ,抽滤 3 遍 ,然后超声 10 min。 2) 流速的确定 在 10μL 进样量下 ,不同流速对保留时间和峰 底宽的影响见 1。当 1. 5 mL/ min 时 ,溶剂中水峰 和丙三醇的保留时间相距太近 ,不利于分离完全 ,而 峰底宽与 1. 0 mL/ min 时相比 ,改善不大 ;当 0. 5 mL/ min 时 ,峰底宽过宽 ,峰面积积分重复精度易受示差 检测器基线波动的影响 ;因此 ,选择 1. 0 mL/ min 流 速 ,兼顾了峰间分离完全和减少峰底宽受基线波动 影响两因素。 3) 溶剂和进样淋洗液的选择 溶剂的选择 ,须兼顾样品的溶解性和水峰的掩 蔽两者。 表 1 　不同流速对药用甘油保留时间和峰底宽的影响1) 流速ΠmL·min - 1 t R ,GlyΠmin : 峰底宽Πmin : 总时间Πmin : RIDΠ% : 甘油含量Π% : 0. 5 14. 2 1. 0 20 0. 6～2. 85 99. 8 1. 0 7. 2 0. 6 15 0. 3～2. 67 99. 6 1. 5 4. 7 0. 45 10 0. 3～3. 2 99. 2 　　1) 溶剂 = 水 ,淋洗液 = 流动相。 　　对于甘油、二甘醇、三甘醇、山梨醇的溶解而言 , 水起助溶作用。由图 1 ,图 2 可见 ,当采用水作溶剂 时 , 由于水峰响应过大并拖尾 ,影响甘油峰的分离 和基线稳定性。故 ,采用流动相作溶剂和进样淋洗 液 ,以抵消或减小“溶剂峰”。 4) 进样量的选择 在综合考虑峰面积对精度的影响、流速和柱效 下降对峰底宽的影响、溶剂和样品中水峰的干扰、各 种可能杂质的分离等因素 ,在不影响检测灵敏度 (检 测下限)的前提下 ,最终选定 10～30μL 进样量。 5) 积分模式的确定 在采用示差检测器时 ,斜率Π阈值 (Slope) 应适当 放大 ,以获得较佳积分效果。具体积分模式 :Agilent 仪器选为 :斜率 (Slope) = 3000 ,最小积分面积 (Area) = 100 ; Waters 仪器选为 :阈值 ( Slope) = 50 ,峰宽 = 30 , 0～5 min 禁止积分。 4. 2 　定量方法的验证 　　1) 线性范围和检测下限 在上述条件下 ,应用线性范围为 :22. 23～20382 ng/μL (0. 001～1. 0 g/ 50 mL) ;相关系数 r = 0. 99999 (7 点 ,不过零点) 。详见表 2 和图 3。 表 2 　应用线性范围实测数据 水平 称量Πng·μL - 1 峰面积 1 20382. 2 1455580 2 16112. 8 1147940 3 12251. 0 871166 4 8593. 2 612393 5 4247. 6 298028 6 2223. 2 156205 7 22. 232 2220. 00903 图 3 　线性工作曲线 注 :未检测得上偏差拐点 (称量上限) 　　本法未测量所采用的浓度敏感型检测器的检测 限 (即 ,仪器的灵敏度) ,而是采用“直接测量法”确定 得本方法的“检测下限”为 :44. 46 ng/μL ,此时峰面 积至 8000。 本法研究中 ,也未测得线性范围的上偏差拐点 (即 ,称量上限) 。因为 ,过高的称样量无实际意义。 2) 方法的准确度 a. 回收率试验 以 81 %粗甘油为本底 ,采用 99. 33 %药用甘油 加入法 ,测 3 个水平 ,分别为 :0. 1 g 81. 02 %粗甘油/ 50 mL + 0. 060、0. 127、0. 197 g 99. 33 %药用甘油 , 以 流动相为溶剂 , 回收率在 :98. 03 %～99. 88 %。结果 见表 3。 表 3 　三个水平的回收率 以 81. 02 %粗甘油为本底Πg 回收率Π% 水平 1 :0. 13531 粗甘油 + 0. 06033 药用甘油 98. 21 % ,99. 19 , X平均 = 98. 70 (RSD = 0. 702) 水平 2 :0. 10857 粗甘油 + 0. 12712 药用甘油 97. 53 % ,98. 52 , X平均 = 98. 03 (RSD = 0. 721) 水平 3 :0. 11561 粗甘油 + 0. 19680 药用甘油 99. 98 % ,99. 78 , X平均 = 99. 88 (RSD = 0. 142) ·846· 　　化 　　学 　　世 　　界 2007 年 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　b. 不同方法准确性比对 用现行甘油含量测定标准方法与本方法 ,对同 一批号样品进行真实性比对试验。结果见表 4。 表 4 　测试甘油含量不同方法的对比结果 密度法 ( d20 ℃)Π% 滴定法Π% HPLC2RID 法Π% 水平 1 :药用甘油 99. 33 100. 10(RSD n = 2 = 0. 170) 99. 55(RSD n = 12 = 1. 376) 水平 2 :工业甘油 95. 49 95. 73(RSD n = 3 = 0. 079) 95. 35(RSD n = 10 = 1. 116) 水平 3 :粗甘油 99. 59(不适用) 81. 40 (RSD n = 3 = 0. 265) 81. 02(RSD n = 8 = 1. 696) 　　从表 4 中所列结果可见 :密度法 ,有局限性 ,仅 适用于高含量精制甘油产品和纯甘油的水溶液 ,当 含有非甘油有机物 (如 ,粗甘油) 时 ,会使结果偏高。 滴定法 ,精度虽高 ,但在杂质掩蔽分离、终点确定等 方面上存在缺陷 ,所以 ,美国药典 29 版 (USP29) 和英 国药典 2007 版 (BP2007) 中允许含量结果超过 100 %。色谱法 ,是以杂质分离为基础的 ,只要控制 好影响精度的因素 ,其结果将更接近于真实值。 3) 方法的精密度协同验证 选用 99 %药用甘油、95 %工业甘油和 81 %粗甘 油三个不同规格水平的皂化甘油 ,经十家实验室 ,对 本标准化方法进行协同验证 ;其中 ,Agilent 1100 + G1362A 系统做了九家 , Waters 2695 + 2414 系统做了 八家。 经方差分析 :1) 由样品均匀性检验 (单侧 F 检 验 ———单因子 F 检验) ,三个水平 (99 % ,95 % ,81 %) 的样本间 ,不论是 Agilent 法或 Waters 法 ,样本是均 匀的 ,均无显著性差异 ;2) 由两种方法间差异性检 验 (双侧 t 检验 ———双因子 t 检验) ———成对数据比 较法 ,该两种仪器方法的检测结果间 ,无显著性差 异。 精密度试验结果 ,见表 5。由表 5 结果可见 : (1) 由于示差检测器 ( RID) 受环境温度和在线 脱气等因素影响较大 ,一般非封闭式恒温实验室 ,无 法满足 RID 对环境温度的要求 ,故精度较差 (不论是 合并或 Agilent 仪器单独计 , r95 和 R95 均大于 1. 9) 。 但在上海食品药品检验所 (SIFDC) ,其新建成的封闭 式恒温实验室 ,则完全能满足 1 % RSD 精度。 (2) 而 Waters 2695 + 2414 系统 ,由于有较好的 热屏蔽性能和在线脱气功能 ,在实际操作中 ,不受环 境温度影响和流动相不必预先脱气 ,在一般实验室 条件下能轻易满足 1 % RSD 精度。 (3) 从品质检验中 GC 和 HPLC 的一般要求满 足精度为 1 % RSD 的角度考虑 ,大于 1 % RSD 已无 实际应用价值。 综上所述 ,在满足 RID 规定要求的正常条件下 , 本标准化方法应能达到 Waters 仪器的精密度验证 结果。 表 5 　精密度试验结果 浓度水平 ( % ,mm) 平均值 ( % ,mm) Agilent & Waters 两仪器合并计 ( n = 8 ×2) Agilent 仪器单独计 ( n = 9) Waters仪器单独计 ( n = 8) 99 95 81 99 95 81 99 95 81 98. 97 95. 68 81. 29 平均差 99. 11 95. 81 81. 42 平均差 98. 83 95. 50 81. 18 平均差 标准 重复性 S r 0. 68006 0. 78177 0. 92312 S r ,平均 = 0. 7950 0. 8757 1. 0071 1. 2100 S r ,平均 = 1. 0309 0. 3081 0. 3740 0. 5234 S r ,平均 = 0. 4018 偏差 再现性 SR 0. 68006 0. 78177 0. 92666 SR ,平均 = 0. 7962 0. 8757 1. 0071 1. 2100 SR ,平均 = 1. 0309 0. 3959 0. 4029 0. 5400 SR ,平均 = 0. 4463 界限值重复性 r95 1. 904 2. 189 2. 586 r平均 = 2. 226 2. 452 2. 820 3. 388 r平均 = 2. 887 0. 862 1. 047 1. 465 r平均 = 1. 125 再现性 R95 1. 904 2. 189 2. 595 R平均 = 2. 229 2. 452 2. 820 3. 388 R平均 = 2. 887 1. 109 1. 128 1. 512 R平均 = 1. 250 4. 3 　标准品来源 采用高含量皂化药用甘油作为标准样品来源 , 丙三醇含量定值方法可以是 :“毛细管气相色谱法 (SN/ T 111122002) + Karl Fischer 法测水分 (1SO 20972 1972)”相结合的“杂质倒扣法”或“密度法”( GB/ T 13216. 521991) 。 5 　结 　论 本液相色谱法的关键是 :在采用一般的液相色 谱仪和示差检测器时 ,对影响检测精度的环境温度 和仪器系统要求较严。从表 5 中可见 ,在实验室非 恒温条件下 ,条件控制至关重要。但从上述协同验 证试验精度结果可见 :对于“Waters 2695 + 2414”液 相色谱 - 示差检测系统 ,使用其 RID 时如同二极管 阵列检测器一样便捷 ,可获得一样的精度 ( RSD < 1 %) 。 本法的主要优点在于将原有的三种方法各自优 点得到了适当的体现 :其一 ,与气相色谱相似 ,以色 (下转第 645 页) ·946·第 11 期 化 　　学 　　世 　　界 　　　　　 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　图 5 表明了催化剂的催化性能情况 :添加 w (Nb (OH) 5 ) = 1 %的分子筛催化剂初始活性好 ,寿命也 较长 ,添加 w (Nb (OH) 5 ) = 2 %的分子筛催化剂比 w (Nb (OH) 5 ) = 1 %的分子筛催化剂的初始活性好 ,寿 命也提高了三分之一 ,烯烃转化率最大达到 56 % , 而添加经草酸处理的 w (Nb (OH) 5 ) = 5 %的催化剂 活性和寿命都大大降低了。对比酸性数据 ,可以看 出 ,加入 5 %的氢氧化铌 ,使催化剂的 B 酸量减少 了 ,含 w (Nb (OH) 5 ) = 1 %和 2 %催化剂较 w (Nb (OH) 5 ) = 5 %催化剂的总 B 酸量与总 L 酸量比例 大 ,有利于反应。这进一步说明了提高催化剂中总 B 酸量与总L 酸量的比例有利于烷基化反应。 经草酸处理的含 w (Nb (OH) 5 ) = 5 %的催化剂 与未经草酸处理的含 w (Nb (OH) 5 ) = 5 %的催化剂 活性相比较 ,可以看出 ,虽然后者的总 B 酸量与总 L 酸量的比例较前者大 ,但活性却降低了 ,这是因为用 草酸处理后催化剂表面出现了强 B 酸中心 ,对比活 性数据可知 ,强 B 酸量越大 ,活性越低。强 B 酸中 心对脱烯烃反应是不利的。 3 　结论 (1) 用磷酸或草酸处理氢氧化铌 ,能提高了催 化剂中总 B 酸量与总 L 酸量的比例。用磷酸处理 的 5 %氢氧化铌 ,总 B 酸量与总 L 酸量比值提高了 21. 29 % ;用草酸理 1 %氢氧化铌 ,总 B 酸量与总 L 酸量比值提高了 8. 55 %。 (2) 氢氧化铌在高温下转变成了氧化铌晶体 , 用磷酸处理过的氢氧化铌试样比未处理的在催化剂 表面更加分散 ,有利于提高催化剂的活性。 (3) 氢氧化铌改性沸石分子筛催化剂表面上总 B 酸量、L 酸量随氢氧化铌含量的增加而减少。由 于多价金属离子的水解作用 ,铌的引入导致催化剂 表面酸中心重新分布 ,使沸石分子筛催化剂的酸量 适当 ,有利于脱烯烃反应的进行。 (4) 强 B 酸中心不利脱烯烃反应的进行。 参考文献 : [1 ] 　余励勤 ,李宣文. 固体催化剂的研究方法 [J ] . 石油化 工 ,2000 ,29(8) :6212635. 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