可溶性氮测定方法

FNCPSL0075 动物饲料 可溶性氮的测定 稀盐酸中用胃蛋白酶处理法 F_NCP_SL_0075 动物饲料—可溶性氮的测定—稀盐酸中用胃蛋白酶处理法 1 范围 该国际了在稀盐酸中用胃蛋白酶处理后测定动物饲料可溶性氮含量的。 该方法不能区别蛋白氮和非蛋白氮。 注 : 用此方法得到的值同体内消化率没有直接关系。 如果从实验结果中除去非蛋白氮，它的含量应该用一个适宜的方法测定。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。在标准出版时，所示 版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨，使用下列标准最新版本的可能 性。 ISO 5983：1997 动物饲料中氮含量测定和粗蛋白质含量的计算——K 氏法。 ISO 6498：1983 动物饲料试样的制备。 3 原理 样品在胃蛋白酶稀盐酸溶液中于 400C 培养 48h。 悬浮液过滤并按照 K 氏方法即可测定滤液的氮含量也可测定滤器上残渣氮含量。 4 试剂 只能使用认可的分析级试剂，蒸馏水或去离子水或至少同等纯度的水。 所有试剂(除标准材料外)实际都应该是无氮化合物。 4.1 稀盐酸，c(HCl)=0.075mol/L。 4.2 胃蛋白酶，活性 2.0U/mg 与附录 A 中给出的定义一致。按附录 A 中规定的方法检查胃蛋白 酶活性。 4.3 胃蛋白酶盐酸溶液，酶活性约 400U/L。 在 1L 稀盐酸溶液中(4.1)溶解 0.2g±0.001g 胃蛋白酶。使用之前立即制备该溶液。 如果胃蛋白酶活性偏离 2.0U/mg，调节胃蛋白酶质量以便获得一个胃蛋白酶活性为 400U/L 的溶液。 4.4 盐酸，c(HCl)=7.5mol/L (ρ20=1.125g/ml)。 5 仪器设备 一般实验室设备，特殊的如下。 5.1 水浴或培养葙，温度能维持在 400C±10C。 5.2 K 氏烧瓶，适宜容积。 5.3 滤纸，快速，耐酸。 5.4 蒸馏和滴定装置。 6 采样 6.1 散装产品采样方法 根据堆型和体积大小分区设点，按货堆高度分层采样。 6.1.1 分区设点：在货堆的不同方位选若干个采样区。各区设中心、四角五个点，货堆边缘的点在距边缘 约 50cm 处。 6.1.2 采样：按区设点，先上后下逐点采样，各点采样数量一致。 6.2 散装采样方法 散装或罐车在出口处根据采样量的需要，间隔采样。 6.3 袋装采样方法 6.3.1 采样包数：5 包至 10 包逐包采样；10 包以上选取 10 包采样；5 包以下不采。采样包的选取参照 6.1.2。 6.3.2 采样：将取样钎槽口朝下，从包的一角水平斜向插向包的对角，然后转动取样钎至槽口朝上取出， 每包采样次数一致。或拆包采取。 6.4 成品出料口采样方法 在出料口采样，每 10 袋或间隔 2min，取样铲采样。 6.5 样品的缩分 将样品倒在清洁、光滑、平坦的桌面或光面硬纸上，充分混匀后将样品摊成平面正方形，然后以两 条对角线为界分成四个三角形，取出其中两个对角三角形的样品，剩下的样品再按上述方法反复缩分，直 至最后剩下的两个对顶三角形的样品接近平均样品所需的重量为止。 实验室收到的样品的真实性和代性以及在传送和贮存时不发生损坏是十分重要的。 保存样品时应避免样品发生变质和变化。 7 试样制备 按照 ISO 6498(即 FNCPSL0067)制备试样。 如果试样脂肪含量超过 10%(m/m)，按照 ISO 6498 提取脂肪，计算(条款 9)时要考虑提取的脂 肪含量。 8 操作步骤 8.1 试料 称取 2g 制备的试样，精确至 0.001g。 8.2 培养 将试料置于 500ml 容量瓶中并加 50ml 事先加热到 400C 的胃蛋白酶溶液。振摇以避免结块。 检查悬浮液的 pH 值低于 1.7。将烧瓶置于 400C 水浴或培养箱中放 48h。8h、24h 和 32h 后振摇。 48h 后加 15ml 盐酸并冷至 200C。用水稀释至刻度，振摇并通过滤纸过滤。按 8.3 或 8.4 进行。 8.3 滤液氮含量的测定 8.3.1 有机物消化 取 250ml 滤液转移到 K 氏烧瓶中，加入 15g 的硫酸钾，0.3g 氧化铜或 0.9~1.2g 五水硫酸铜。 对于 1g 干物质的试料要加 25ml 硫酸 , 以后每增加 1g 干物质多加 6~12ml。充分混合，确保 试料完全润湿，混合并煮沸。 保持溶液充分沸腾直至水分几乎全部蒸发。小心去除最后微量水，减低加热速度。液体变清 澈后，继续加热 1h，然后移开放冷。 8.3.2 蒸馏和滴定 8.3.2.1 氨的蒸馏 小心加入 250~350ml 水 , 使硫酸盐全部溶解 , 如必要可将烧瓶放在热水加速溶解 , 回旋混合 , 冷却。加几粒浮石。 注：对某些特定的样品 ,其硫酸盐不能完全溶于水中 , 此时建议 , 用较少的硫酸钾重新消解。 向蒸馏装置的收集瓶中吸移 25ml 硫酸 , 根据试料预期的氮含量 , 选择其浓度。加 100~150ml 的水加几滴混合指示剂，也可在收集瓶中移入 250ml 硼酸 , 加几滴混合指示剂。 注：建议蒸馏中同时进行氨滴定 , 这样有助于确定蒸馏终点。 将冷凝器末端插入收集瓶的溶液中 , 没入深度至少 1cm。 向消煮瓶中沿瓶壁慢慢加入 100ml 氢氧化钠溶液。 立即将此烧瓶接入蒸馏装置。 加热，使其 30min 内可以收集约 150ml 的馏出液。蒸馏终点用石蕊试纸检验冷凝器末端馏出 液的 pH, 如反应呈碱性 , 需继续蒸馏。 注意：蒸馏结束前 , 应将冷凝器末端提离收集液 , 以避免倒吸。 如果用硫酸做吸收液，蒸馏期间收集瓶内溶液呈碱性，需做适当调整后重新测定。 8.3.2.2 滴定 注：推荐滴定时用 pH 计自动指示终点 , 否则用混合指示剂的颜色变化指示终点。 如 果 用 硫 酸 做 吸 收 液 , 用 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 收 集 瓶 中 过 量 的 硫 酸 ( 选 择适当的浓度 c (NaOH) = 0 .1mol /L 或 c (NaOH) = 0 .25mol /L) , 直至 pH 计指示终点或 溶液颜色由紫变绿。 如果用硼酸做吸收液 , 则用硫酸 [选择适当的浓度 c(H2SO4)= 0.05mol/L 或 c(H2SO4)= 0.125mol/L] 滴定氨 , 直至 pH 计指示终点或溶液颜色由绿变紫。 如果不能同时进行滴定 , 滴定应在蒸馏完成后尽快进行 , 保证馏出液温度不超过 25℃，以避 免氨的损失。 用相同程序完成空白试验但省略试料。按条款 9 进行。 8.4 残渣和试样氮含量测定 8.4.1 残渣中有机物的消化 用温水冲冼滤纸和残渣至它们无酸性。转移滤纸和残渣到一个 K 氏消化瓶中。加入 15g 的硫 酸钾，0.3g 氧化铜或 0.9~1.2g 五水硫酸铜。 对于 1g 干物质的试料要加 25ml 硫酸 , 以后每增加 1g 干物质多加 6~12ml。充分混合，确保 试料完全润湿，混合并煮沸。 注：可以适当的加入一种抗泡剂。 开始猛烈煮沸去掉水分，然后减低加热速度至去掉最后微量水分。液体变清澈后，继续加热 1h，然后移开放冷。 8.4.2 蒸馏和滴定 8.4.2.1 氨的蒸馏 小心加入 250~350ml 水 , 使硫酸盐全部溶解 , 如必要可将烧瓶放在热水加速溶解 , 回旋混合 , 冷却。加几粒浮石。 注：对某些特定的样品 ,其硫酸盐不能完全溶于水中 , 此时建议 , 用较少的硫酸钾重新消解。 向蒸馏装置的收集瓶中吸移 25ml 硫酸 , 根据试料预期的氮含量 , 选择其浓度。加 100~150ml 的水加几滴混合指示剂，也可在收集瓶中移入 250ml 硼酸 , 加几滴混合指示剂。 注：建议蒸馏中同时进行氨滴定 , 这样有助于确定蒸馏终点。 将冷凝器末端插入收集瓶的溶液中 , 没入深度至少 1cm。 向消煮瓶中沿瓶壁慢慢加入 100ml 氢氧化钠溶液。 立即将此烧瓶接入蒸馏装置。 加热，使其 30min 内可以收集约 150ml 的馏出液。蒸馏终点用石蕊试纸检验冷凝器末端馏出 液的 pH, 如反应呈碱性 , 需继续蒸馏。 注意：蒸馏结束前 , 应将冷凝器末端提离收集液 , 以避免倒吸。 如果用硫酸做吸收液，蒸馏期间收集瓶内溶液呈碱性，需做适当调整后重新测定。 8.4.2.2 滴定 注：推荐滴定时用 pH 计自动指示终点 , 否则用混合指示剂的颜色变化指示终点。 如 果 用 硫 酸 做 吸 收 液 , 用 氢 氧 化 钠 溶 液 滴 定 收 集 瓶 中 过 量 的 硫 酸 ( 选 择适当的浓度 c (NaOH) = 0 .1mol /L 或 c (NaOH) = 0 .25mol /L) , 直至 pH 计指示终点或 溶液颜色由紫变绿。 如果用硼酸做吸收液 , 则用硫酸 [选择适当的浓度 c(H2SO4)= 0.05mol/L 或 c(H2SO4)= 0.125mol/L] 滴定氨 , 直至 pH 计指示终点或溶液颜色由绿变紫。 如果不能同时进行滴定 , 滴定应在蒸馏完成后尽快进行 , 保证馏出液温度不超过 25℃，以避 免氨的损失。 用相同程序完成空白试验但省略试料。按条款 9 进行。 8.4.3 空白试验 用相同步骤完成空白试验但省略试料。 9 结果计算 9.1 用 8.3 中规定的步骤得到的可溶性氮含量的计算 对于样品测定和空白试验所提供接收氨的硫酸用量是相等的，试样可溶性氮含量的计算用公 式： w1= m McVV ××− )(2 10 式中： w1——用 8.3 规定的步骤得到的试样可溶性氮含量，g/kg； V0——空白试验所用氢氧化钠溶液体积，ml； V1——测定(8.3.2)所用氢氧化钠溶液体积，ml； c——滴定用氢氧化钠溶液浓度，mol/L； m——试料质量，g； M——氮的摩尔质量( M=14g/mol)，g/mol； 报告结果精确至 0.1g/kg。 9.2 用 8.4 规定的步骤所得可溶性氮含量的计算 对于样品测定和空白试验所提供接收氨的硫酸用量是相等的，试样可溶性氮含量的计算用下 述公式： w2= m McVV N ××−− )( 10W 式中： W2——用 8.4 规定的步骤所得到的试样可溶性氮含量，g/kg ; V0——空白试验所用氢氧化钠溶液体积(见 ISO5983:1997，4.9.1)，ml； V1——测定(8.4.2)所用氢氧化钠溶液体积(见 ISO5983:1997，4.9.1)，ml； c——滴定用氢氧化钠溶液(见 ISO5983:1997，4.9.1)浓度，mol/L； m——试料质量，g； M——氮的摩尔质量( M=14g/mol)，g/mol； WN——8.4.3 中测定的试样的氮含量，g/kg； 报告结果精确至 0.1g/kg。 9.3 可溶性粗蛋白质含量的计算 如果以可溶性粗蛋白质表示结果，用测定的可溶性氮含量乘系数 6.25。 10 精密度 10.1 重复性 用相同方法，同一种试验材料，在同一实验室，同一操作者用相同设备在短时间间隔内所得 到的二个独立单个试验结果之间差值，超出表 1 中所列 r 值的情况不大于 5%。 10.2 再现性 用相同方法，同一种试验材料，在不同实验室，不同操作者用不同的设备所得到的二个单个 试验结果之间差值，超出表 1 中所列 R 值的情况不大于 5%。 表 1 重复性限(r)和再现性限(R) 样 品 可溶性粗蛋白质 含量均值， g/kg 1) r， g/kg R， g/kg 苜蓿草粉 玉米麸质饲料 椰子粕 牧草青贮 骨粉 羽毛粉 136.6 141.5 149.5 192.9 512.0 574.3 7.2 8.9 7.4 7.9 8.9 22.1 26.5 28.9 31.6 36.3 63.1 166.3 1) 以干物质为基础 11 试验报告 试验报告应详细说明： 完整鉴定样品所需全部信息； 使用的采样方法，如果知道； 应用的方法； 获得的试验结果，以可溶性氮或可溶性蛋白质表示，后者使用转换系数(即 6.25)； 如果重复性被检查的话，最后得到的结果； 该国际标准中没有规定的操作细节，或者被认为是可任意选择的，还有当完成方法时难 免发生的能影响试验结果的任何细节。 12 附录 A 实验室间的联合试验结果 试验是于 1987 年，由 ISO/TC 34/SC 10 动物饲料分会组织，按 ISO 5725：1986 规定的方法 进行的。最后的统计分析按 ISO 5725-2 进行。该试验有 25 个实验室参加，研究的样品包括玉米 面筋饲料、配合饲料、鱼粉、浓缩饲料（2 种）、预混合饲料和酵母。 表 A.1 实验室间联合试验的统计结果 样 品 1) 参 数 1 2 3 4 5 6 7 剔除界外值后保留 的实验室数 25 25 25 25 25 25 25 粗蛋白含量 , g/ kg 704 810 456 29.8 394 474 252 重复性标准偏差 (Sr), g/kg 4.6 4.5 3.2 0.85 2.9 2.3 3.2 重复性相对标准偏差 , % 0.65 0.55 0.71 2.85 0.75 0.50 1.26 重复性限 (r), [r=2.8Sr], g/kg 12.88 12.60 8.96 2.38 8.12 6.44 8.96 重现性标准偏差 (SR), g/kg 10.6 12.9 12.5 4.3 12.4 10.3 8.2 重现性相对标准偏差 , % 1.51 1.59 2.75 14.5 3.16 2.17 3.24 重 现 性 限 (R), [R=2.8 SR], g/kg 29.68 36.12 35.00 12.04 34.72 28.84 22.96 1）样品 1: 鱼粉；样品 2: 玉米面筋饲料；样品 3: 酵母 ; 样品 4: 预混合饲料 ; 样品 5: 浓缩饲料 ; 样品 6: 浓缩饲料 ; 样品 7: 配合饲料。 2）以干基计 13 参考文献 ISO 6655 ：1997 动物饲料中可溶性氮含量的测定——稀盐酸中用胃蛋白酶处理