实验一葡聚糖凝胶柱层析分离核黄素牛血清白蛋白

课程名称 课程名称 生物制药技术 项目/主题 葡聚糖凝胶柱层析分离核黄素牛血清白蛋白 课 类 实验 课 序 周二5-8 学时 4 班级/小组 09生物制药3班 地 点 实验楼202 时间 2010-10-25下午 教学 目的 1.​ 了解凝胶层析的基本原理。 2.​ 熟悉凝胶层析的操作原理 3.​ 掌握组分的洗脱与鉴定 能力（技能）目标 知识目标 熟悉凝胶层析的操作掌握组分的洗脱与鉴定 掌握凝胶层析的基本原理和凝胶分子筛知识 重点 难点 与 解决 分子筛原理 方案：通过板书，作图以及打比方使学生掌握 参考 资料与 媒体 http://www.biochemistry.com, http://www.shsy.js.zwu.edu.cn/listw.asp? 教学 条件 演示 教学 小结 经过演示后大部分同学做得比较成功 教师 签名 陈辉芳 检查者 签名 检查 日期 单元（节）首页 第 1 单元1（节） 单元（节）教学设计活页 第1 单元（节）第 1 页 步骤 教学内容 方法 手段 学生活动 时间分配 1 2 实验原理 凝胶过滤是利用具有一定口径范围的多孔凝胶的分子筛作用对生物大分子进行分离的层析技术。当样品随流动相经过由凝胶组成的固定相时，分子量大的物质不能扩散进入凝胶颗粒内部，于是随流动相流经颗粒之间的狭窄空隙，首先洗脱出层析柱；分子量小的物质可以扩散进入凝胶颗粒内部，比较大分子量物质流经的载面积宽，流动速度慢，于是与分子量大的物质分离开来，最后被洗脱出来（如下图）。即固定相的网孔对不同分子量的样品成分具有不同的阻滞作用，使之以不同的速度通过凝胶柱，从而达到分离的目的，凝胶过滤又因此得名“分子筛层析”和“凝胶排阻层析”。 本实验用葡聚糖作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量267）和牛血清白蛋白（白色，相对分子质量67000）混合物作为样品，在层析时，前者相对分子质量小，可进入凝胶分子网络，所受阻力大，移动速度慢；后者相对分子质量大，不能进入凝胶分子网络，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快。该两种组分各有颜色，便于观察，不必另行显色。洗脱液收集后，在分光光度计上测定两种组分的吸光度，绘制洗脱曲线。 三、实验试剂 1．葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50 2．核黄素饱和水溶液 3．生理盐水 4．10mg/ml牛血清白蛋白溶液 5．0.1mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲液（PB）：量取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml、0.1mol/L磷酸二氢钠280ml，混匀。 4、​ 实验器材 1.分光光度计 2.托盘式扭力天平 3.水浴锅 4、层析柱 5、​ 操作 （一）溶胀凝胶 称取葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50 3g，加PB 50ml，置沸水浴中溶胀2h，用PB漂洗，去除漂浮的细小颗粒。 （二）装柱 1.​ 将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填入一薄层玻璃棉或海绵垫。 关住层析柱出口，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓倒入层析柱中。 讲解 演示 聆听 观看 35 45 单元（节）教学设计活页 第1 单元（节）第 2 页 步骤 教学内容 方法 手段 学生活动 时间分配 3 3．当凝胶颗粒沉积约2cm高时，打开出口，使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，直至凝胶床高达12cm时为止。关闭层析柱出口。要求凝胶床无气泡、无断层、面平整。 （三）制样 将核黄素饱和水溶液和血红蛋白溶液按1：1（体积比）混匀。 （四）加样 打开层析柱出口，使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床表面平齐时，关上出口。用刻度吸管吸取待分离样品溶液0.5ml，在接近凝胶床表面处沿层析柱内壁缓缓加入。打开层析柱出口，使样品溶液进入凝胶床。然后再用滴管沿层析柱内壁加入PB，高度约1cm。 （五）层析 保持4~6滴/min的流速。 （六）收集 每管收集约1ml，收集至流出液为无色。 （七）测定 用紫外分光光度计，在280nm波长下，以PB调零，测定牛血清白蛋白各管吸光度；用可见光分光光度计，在450nm波长下，以PB调零，测定核黄素各管吸光度。 结果处理 以管号为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制洗脱曲线。、 注意事项 （1）凝胶床要均匀，中间要连接，不得有气泡或断纹，表面要平整。 （2）加样不可过多，以免分离不完全。 （3洗脱速度不可过快。 思考题 要使凝胶床达到实验要求，需注意哪些操作？ 巡回指导 操作 150