fMRI评价NGF基因治疗对犬脑出血血肿灶周神...

实验研究 fMRI evaluation of NGF gene therapy on neural functional recovery in the region of perihematoma after intracerebral hemorrhage LIUHuai�jun , HE Dan, WANG Yong, HUANG Bo�yuan, CHI Chen, YAN Li�qun, WANG Guo�shi, FENG Ping�yong (Department of Radiology , the Second Affiliated Hospital of H ebei Medical University , Shij iazhuang 050000, China) [Abstract] � Objective � To study the applied value of using fMRI to evaluate the therapeutic effect of NGF gene on neural functional re� covery in the region of perihematoma after experimental intracerebral hemorrhage ( ICH) . Methods� Twenty�four healthy dogs were divided into three groups randomly: NGF group ( n= 12) , ICH group ( n= 8) and control group ( n= 4) . The examinations of Purdy score, MR scanning and TEM were carried out at 1, 3, 10, 28 day after ICH. Results� Compared with ICH group, the volume of hematoma and ede� ma in NGF group had no significant difference (P > 0. 05) , whereas ADC and rCBF in NGF group had significant difference at 1- 3 day (P < 0. 05) . At 10- 28 day, the volume of hematoma and edema, ADC and rCBF in NGF group were obviously better than that in ICH group ( P < 0. 05) . The dynamic changes of MR were correlated with the changes of clinic neural function and pathological result. Conclu� sion� fMRI was an objective and effective method to evaluate quantitatively and qualitatively the results of gene therapy. [Key words] � Intracerebral hemorrhage; Functional magnetic resonance imaging ; Gene therapy; NGF fMRI评价 NGF基因治疗对犬脑出血血肿 灶周神经功能修复的影响 刘怀军,贺 � 丹, 王 � 勇,黄渤源,池 � 琛,颜立群,汪国石,冯平勇 (河北医科大学第二医院放射科,河北 石家庄 � 050000) [摘 � 要] � 目的 � 探讨 fMRI在评价神经生长因子( NGF)基因治疗犬脑出血疗效中的价值。 � 健康家犬 24 只,随机分 为 3组: NGF组( n= 12) , 脑出血组( n= 8)和对照组( n = 4)。在脑出血后 1 天、3 天、10 天、28 天四个时间点进行 MR 扫描、 Purdy评分和透射电镜观察。结果 � NGF组 1~ 3 天时血肿、水肿体积与脑出血组比较无显著性差异 ( P > 0. 05) , 血肿灶周 ADC、rCBF与脑出血组比较有显著性差异( P< 0. 05)。10~ 28天血肿、水肿体积和血肿灶周 ADC、rCBF均显著好于脑出血组 (P < 0. 05) ,且 fMRI动态演变与临床神经功能转归和病理结果相一致。结论 � fMRI 能客观、有效地定性和定量评价 NGF 基 因治疗脑出血的疗效。 [关键词] � 脑内出血; 功能磁共振成像; 基因治疗; NGF [中图分类号] � R743. 34; R445. 2� [文献标识码] � A � � [文章编号] � 1003�3289( 2004) 11�1663�04 [基金项目] 本研究为河北省自然基金资助项目( C2004000590)。 [作者简介] 刘怀军(1953- ) , 男, 天津人, 大学,博士生导师, 主任医师, 教授。研究方向:中枢神经系统影像诊断。E�mail : Danhe@ 126. com [收稿日期] 2004�07�10 � � 脑出血( intracerebral hemorrhage, ICH)的传统治疗手段一 直是手术清除血肿、脱水剂控制水肿,临床高死亡率和致残率 一直没有得到根本性改善。基因治疗是 ICH新的治疗方法, 目前国内外开展很少。本研究利用功能性磁共振( fMRI) 技 术,结合组织病理学, 在分子水平评价神经生长因子( nerve growth factor, NGF)对血肿灶周神经功能修复的影响,旨在寻找 客观、有效的在体手段以评价基因治疗对 ICH的疗效。 1 � 与方法 1. 1 动物选择和分组 � 选择健康家犬 24只(河北医科大学第 二医院实验动物中心提供) ,雌雄不限,体重 10~ 18 kg,平均 15 kg,月龄 11~ 24个月,平均 18个月。随机分为 3组: �NGF 组(治疗组) : 12只,于造模后 0. 5 h,微量进样器将 NGF 2000 AU(相当于 4 �g/ 0. 5 ml) ,立体定向导入血肿灶周区; ICH组 (脑出血组) : 8只,只注血,不注药; ! CO组(对照组) : 4只,除 麻醉和进针外,不注血和注药。 1. 2 脑出血模型建立 � 采用立体定向自体血脑内注入法制 做犬脑出血模型。选择额叶皮层注血,注血量选择 3 ml,注血 时间 5 min,压力< 100 mmHg,一次性注入不抗凝自体血,同时 注意留针 10 min,针头楔面向外。模型制做成功:造模后 CT显示额叶皮层目标血肿区出现高密度阴影,无硬膜下血肿 和脑室系统积血, Purdy神经功能缺损评分[ 1] 6~ 8分。 1. 3 神经功能缺损评分 � NGF组和 ICH 组在实验开始后 1、 3、10、28天采用Purdy评分标准进行意识、行为、转头、转圈及 ∀1663∀中国医学影像技术 2004年第 20卷第 11期 � Chin J Med Imaging Technol, 2004,Vol 20,No 11 偏盲五方面的神经功能缺损评分。 1. 4 MR扫描 � 对NGF组和 ICH组,在实验开始后 1、3、10、28 天,采用Toshiba VISART/Hyper 1. 5T超导磁共振系统进行MR 检查, T2WI 采用自旋回波( SE) 序列,参数为 TR/TE= 4 000 ms/ 108 ms。DWI采用单次激发自旋回波�平面回波( SE�EPI) 技术, 各方向 b= 1 000 s/mm2 , TR/ TE 为 10 000 ms/ 120 ms。 PWI采用单次激发梯度回波( EPI)序列, TR/ TE= 1 000 ms/ 40 ms,从留置针静脉团注马根维显( Gd�DTPA, 0. 2 ml/ kg,德国先 灵公司生产) ,注射速率 5 ml/ s,随后以同样速率注射 10 ml生 理盐水,注射对比剂和扫描同时进行。在 SGI 图像工作站上 进行图像后处理。在T2WI测定血肿、水肿体积, DWI测定血 肿周边组织ADC值, PWI测定血肿周边组织 rCBF。所获图像 由两名放射科医师共同分析诊断。 1. 5 电镜观察 � 在 1、3、10、28 天的预定时间点, NGF组随机 抽取 3只动物, ICH 组随机抽取 2只动物, CO组随机抽取 1只 动物,过度麻醉后迅速取脑,制备电镜标本,透射电镜下超微 观察血肿灶周神经元受损情况。 1. 6 统计学分析 � 采用 SAS 6. 12软件进行资料的统计学处 理。所有数据用均数 # 标准差( -x # s )表示,经正态性分析 和方差齐性检验后,进行单因素方差分析( one�way ANOVA) , 以 P< 0. 05为差异有显著统计学意义。 2 � 结果 2. 1 神经功能缺损评分 � 术后 NGF组和 ICH 组动物麻醉复 苏后均出现神经系统定位体征。NGF 组 1~ 3天评分与 ICH 组比较无显著性差异( P> 0. 05) ,但 10~ 28天评分显著优于 ICH组( P< 0. 05,表 1)。 表 1 � 各组动物神经功能缺损评分比较( -x # s ) 组别 1天 3天 10天 28天 NGF组 8. 12 # 1. 37 5. 46 # 1. 05 2. 84 # 1. 53* 2. 15 # 1. 13* ICH组 8. 23 # 1. 41 5. 38 # 1. 22 3. 74 # 1. 08 3. 32# 1. 46 CO组 2 2 2 2 ANOVA: NGF 组与 ICH 组比较, * P < 0. 05 2. 2 MR影像学变化 2. 2. 1 T2WI 变化 � T2WI可以反应血肿大小和血肿灶周血管 源性水肿的程度和范围。CO 组: T2WI 信号强度正常值为 2876. 45 # 126. 34。ICH 组: 1 天时表现为血肿区呈高信号,而 血肿灶周高信号提示为血管源性水肿。3天时血肿区高信号 更加明显,血肿灶周水肿达高峰,局部脑沟、脑回模糊不清,并 可见脑室受压、中线移位等占位征象。10 天时血肿部分吸 收,水肿开始消退减轻,表现为血肿范围缩小,信号强度下降 (图 1、2) ; 28天时血肿绝大部分吸收,软化灶形成, 水肿极轻 微,表现为血肿区信号强度稍高或趋于正常,灶周轻度水肿或 无水肿,可见低信号含铁血黄素环形成。NGF 组: 1~ 3 天 T2WI 变化基本同 ICH 组,但 10天时血肿大部分吸收,血肿区 信号强度明显下降,水肿明显减轻(图 3、4) ; 28天时,血肿完 全吸收,血肿区信号强度接近正常,灶周无水肿,有铁血黄素 环形成。 2. 2. 2 ADC图变化 � ADC 图和 ADC值可以反应血肿灶周脑 缺血性损害所致的细胞毒性水肿的程度和范围。CO 组:其 ADC图反应正常状态下额叶水分子的布朗运动, rADC值为 ( 13. 06 # 2. 57) ∃ 10- 4。ICH 组: 1天时血肿区极低信号,血肿 灶周以高信号为主,同时局部可伴有等、低信号的存在,其高 信号区域与T2WI 显示的血肿灶周高信号区域相一致, ICH 早期以血管源性水肿为主, 低信号区域表示缺血和细胞 毒性水肿的存在,而等信号区域一般认为是混合性水肿所致。 3天时血肿灶周高信号范围和强度下降、同时等、低信号的范 围有扩大趋势,这是由于此时细胞毒性水肿严重的结果。两 种性质水肿并存,加重了脑水肿的程度和范围。10天时无论 是血管源性水肿还是细胞毒性水肿都开始消退,血肿灶周以 稍高和等信号为主,范围逐渐缩小。28天时血肿灶周无或仅 有轻度水肿,呈等或略高信号。NGF组: 3~ 10 天 ADC图和 ADC值变化均好于 ICH 组,说明细胞毒性水肿较 ICH 组轻。 28天时 ADC图和ADC值变化趋于正常。 2. 2. 3 rCBF图变化 � rCBF图和 rCBF值可以反应血肿灶周脑 组织血流灌注状态的变化。CO组:反应正常状态下额叶脑血 流灌注状态, rCBF值为( 46. 26 # 2. 34) ∃ 10- 3。ICH组: 1天时 血肿灶周低灌注, rCBF值明显减低,部分区域由于血肿对周 围组织的机械性压力减轻,以及侧支循环的建立可见高灌注 现象; 3天时血肿灶周血流开始恢复,呈较低灌注; 10天时血 肿灶周稍低灌注; 28天时血肿灶周血流灌注仍未恢复正常, 为略低灌注。NGF组: 1~ 10 天血肿灶周灌注状态好于 ICH 组, 28天与对侧基本相同。 MR图像综合分析表明; NGF组 1~ 3天血肿、水肿体积与 ICH 组比较无显著性差异( P > 0. 05) ; 10~ 28天血肿、水肿体 积与 ICH 组比较有显著性差异( P< 0. 05)。NGF组 1~ 28天 血肿灶周 ADC、rCBF均显著优于 ICH组( P< 0. 05,表 2)。 表 2 � 各组动物MR影像学变化比较( -x # s ) 1天 3天 10天 28天 NGF 组 � Vh 2. 87 # 0. 11 2. 86# 0. 14 0. 68# 0. 05* 0. 06 # 0. 01* * � Ve 4. 24. # 1. 45 6. 35# 1. 67 2. 87# 0. 14* 0. 22 # 0. 01* * � rADC 7. 58 # 0. 28* 8. 82 # 0. 34* 11. 47 # 0. 76* 13. 12 # 0. 36* � rCBF 31. 83 # 3. 76* 34. 83# 3. 76* 39. 16 # 4. 84* 44. 25 # 2. 19* ICH 组 � Vh 2. 82 # 0. 19 2. 83# 0. 19 0. 98 # 0. 08 0. 18 # 0. 03 � Ve 4. 51 # 1. 01 6. 31# 1. 01 4. 35 # 0. 19 0. 46 # 0. 02 � rADC 6. 75 # 0. 39 7. 05# 0. 52 9. 56 # 0. 43 11. 62 # 0. 16 � rCBF 28. 62 # 2. 40 31. 62 # 2. 24 37. 51 # 3. 26 40. 47 # 3. 49 CO 组 � rADC 12. 78 # 2. 27 12. 83 # 3. 31 13. 46 # 2. 87 13. 10 # 2. 65 � rCBF 46. 65 # 3. 93 45. 26 # 2. 34 46. 41 # 3. 74 46. . 37 # 2. 48 ANOVA: NGF组与 ICH 组比较, * P < 0. 05, * * P < 0. 01。Vh (血肿体积, ml) , Ve(水肿体积, ml) , rADC(相对表观弥散系数, ∃ 10- 4, mm2/ s ) , rCBF (相对脑血流量, ∃ 10- 3, ml∀100mg- 1∀min- 1) ∀1664∀ 中国医学影像技术 2004年第 20卷第 11期 � Chin J Med Imaging Technol, 2004, Vol 20, No 11 图 1、2 � ICH 组 3天时, T2WI 显示左额叶高信号血肿和周围高信号血管源性脑水肿, 28天时血肿仍未完全吸收,边缘可见半环形极低信号含铁血黄 素沉积,血肿灶周仍有轻度脑水肿 � � 图 3、4 � NGF 组 3天时, T2WI 显示左额叶高信号血肿和周围高信号血管源性脑水肿, 28天时血肿完全吸收, 水肿消退,仅见极低信号的含铁血黄素沉积 图 5 � ICH 组 3天电镜,可见神经元损伤较重,表现为胞体肿胀,核膜模糊,染色质浓缩成块,细胞器稀疏、水肿明显 图 6 � NGF组 3天电镜可见神经元损伤较轻,表现为胞体肿胀,核膜清晰,染色质稍增多,有边聚趋势。水肿较轻 2. 3 电镜观察神经元、神经胶质细胞超微结构 � CO组:细胞 胞体圆形或锥形,核大而圆,核仁居中,边界明显,核膜光滑。 细胞质中线粒体较多,内嵴清晰,双层膜结构完整, 内质网分 布均匀,高尔基体无扩张。ICH 组: 3天时锥体细胞胞体和胞 核形状不规则,核膜呈波浪状,染色质浓缩成块(图 5) ,线粒 体损伤变性严重,膜双层结构模糊不清,嵴断裂甚至消失,粗 面内质网严重脱颗粒,高尔基复合体、细胞间质和细胞内严重 水肿,神经胶质细胞增生、肥胖。28 天血肿灶周锥体细胞形 态大致正常,轴突数目增多,神经胶质细胞数目明显增多,有 胶质瘢痕形成,细胞内和细胞间水肿明显减轻。NGF组: 3天 时锥体细胞胞体和胞核肿胀,核膜清晰,染色质稍增多,边聚 (图 6)。线粒体中度水肿,核间隙水肿,膜双层结构局部模糊 不清,嵴部分断裂,粗面内质网轻、中度脱颗粒,高尔基复合体 轻�中度水肿,神经元旁可见聚集成束的神经微丝。28天NGF 组胶质细胞数目明显增多,形态大致正常,突触数目明显增 多、轴突延伸,侧支发芽,神经纤维排列相对有序,细胞内和细 胞间水肿消失。 3 � 讨论 � � ICH的致残率极高,如何最大限度促进受损神经功能的 康复一直是困惑我们的难。目前,有关 NGF应用于 ICH的 治疗研究报道较少。本实验将外源性 NGF立体定向导入额 叶血肿临皮层面的灶周区,免疫组化 SP法发现 NGF在血肿 灶周有效表达,激光共聚焦显微镜和透射电镜可观察到 NGF 具有保护神经元,减少神经元坏死和凋亡,促进轴突伸长和突 触重建,促进神经元再生、迁移和分化以及抑制胶质瘢痕的形 成和神经纤维的缠结等方面的作用[ 2�4]。 � � 由于治疗效果不可避免地要受到自体环境的影响,目前 对脑血管病基因治疗疗效的观测多偏重于体内研究。利用影 像学方法,尤其是磁共振成像技术,可于活体状态下在分子水 平上直接观察病灶,特别是灶周组织在基因药物作用下范围 ∀1665∀中国医学影像技术 2004年第 20卷第 11期 � Chin J Med Imaging Technol, 2004,Vol 20,No 11 和程度的变化以及病变恢复情况。 磁共振技术除常规磁共振( T1WI、T2WI 和 FLAIR)外,还 有近年来出现的功能性磁共振( fMRI)新技术,包括弥散加权 成像( DWI)、灌注加权成像( PWI)、弥散张量成像( DTI)以及应 用血氧合水平依赖法( BOLD)。DWI 对水分子的布朗运动很 敏感,可以检测活体组织水的表观扩散系数( ADC)。缺血性 损害表现为 ADC降低和 DWI 信号升高, PWI 可通过时间�信 号强度变化曲线计算局部相对脑血流量( rCBF)、局部相对脑 血容量( rCBV)和脑血流平均通过时间(MTT)等参数,定量分 析缺血区血流灌注情况[ 5�7]。因此, T2、DWI和 PWI 三项指标 可以清楚显示 ICH后血肿、血管源/细胞毒性水肿和血流灌注 状态的动态变化过程,以及用NGF基因治疗干预后的相应影 像学变化,为应用MR评价NGF治疗 ICH 后病灶在不同发展 阶段的影像学表现创造了条件。 本组结果中,在脑出血早期( 1~ 3 天) , 与 ICH 组相比, NGF组PWI显示血肿灶周 rCBF下降程度及DWI显示ADC值 降低程度均较轻,同期组织病理学发现NGF组神经元受损程 度轻,多为变性的神经细胞,表现为核偏移,染色质边聚等可 逆性改变,如果消除不利因素的影响或及时干预治疗,可恢复 其形态,挽救其功能;而 ICH组神经元受损程度重, 多为变质 的神经细胞,表现为核固缩、核破碎、核溶解,甚至形成鬼影细 胞等不可逆性改变。上述结果表明,早期 fMRI 指标可以反映 神经元和神经胶质细胞的的存活状态。在脑出血中后期( 10 ~ 28天) ,与 ICH 组相比, NGF组血肿灶周 rCBF, ADC、T2WI 恢 复明显优于 ICH 组,同期组织病理学发现血肿和水肿体积,以 及神经元再生、轴突生长和胶质细胞适度增生情况均优于 ICH 组,说明晚期 fMRI 指标可以反映血肿吸收、水肿消退程 度以及血肿灶周神经功能修复状况。 本实验表明, MR 影像学的动态演变与病理和临床神经 功能转归相一致, 说明 MR能在活体状态下于分子水平对 NGF基因疗效进行客观的定性和定量评价,具备分子影像学 的功能,具有较好的临床应用价值。 [参考文献] [ 1] � Purdy PD, DevousMD, Bat ijer HH, et al . M icrof ibril lar collagenmodel of canine cerebral infarction[ J] . Stroke, 1989, 20(10) : 1361�1367. [ 2] � Sharp ER, Liu J, Bernabeu R. Neurogenesis following brain ischemia[ J] . Brain Res Dev Brain Res, 2002, 134(1) : 23�30. [ 3] � Parent JM, Vexler ZS, Gong C, et al. Rat forebrain neurogenesis and stri� atal neuron replacement after focal stroke[ J] . Ann Neurol, 2002, 52( 6) : 802�813. [ 4] � Magavi S, Macklis JD. Indut ion of neuronal specif ic neurogenesis in the adult cerebral cortex of adult mice: manipulation of neural precursors in situ [ J] . Brain Res Dev Brain Res, 2002, 134( 1) : 57�76. [ 5] � Kang BK, Na DG, Ryo JW. Diffusion�weightedMR imaging of intra� cere� bral hemorrhage[ J] . Korean J Radiol, 2001, 2( 4) : 183�191. [ 6] � Schellinger PD, Fiebach JB, Hoffmann K, et al. Stroke MRI in intracere� bral hemorrhage: is there a perihemorrhagic penumbra[ J] ? Stroke, 2003, 34 ( 7) : 1674�1679. [ 7] � Carhuapoma JR, Wang PY, BeauchampNJ, et al. Diffusion�weightedMRI and proton MR spect roscopic imaging in the study of secondary neuronal in� jury after intracerebral hemorrhage[ J] . Stroke, 2000, 31( 3) : 726�732. Supraclavicular lymphocele: case report 锁骨上囊状淋巴管瘤 1例 杜学文,林丹丹,李欣茹,刘育平 (解放军第 513医院超声科, 甘肃 兰州 � 732750) � � [Key words] � Clavicle; Lymphocele � � [关键词] � 锁骨; 囊状淋巴管瘤 � � [中图分类号] � R445. 1� [文献标识码] � B � � [文章编号] � 1003�3289( 2004) 11�1666�01 [作者简介] 杜学文( 1972- ) ,女,四川南充人,大专,主治医师。 [收稿日期] 2003�12�22 � � 患者男, 34 岁,发现右锁骨上窝淋巴结肿大 1 月余。超声检 查(见图) : 右锁骨上窝探查右颈总静脉外上方见 4. 9 cm ∃ 1. 7 cm的混合性包块, 以液性为主, 形态不规则, 边界清, 内透声欠 佳,内可见豆腐渣样改变, 并可见斑片状强回声。其内下方见 2. 2 cm ∃ 0. 8 cm 大小的低回声区与之紧密相连, 该低回声区形 态不规则,边界清, 内透声欠均匀。在颈总静脉与该低回声区之 间见 1. 5 cm ∃ 0. 6 cm 大小的低回声区, 形态欠规则, 边界清, 内 回声均匀。超声诊断: � 右锁骨上窝混合性包块, 淋巴管瘤可能 性大; 右锁骨上窝淋巴结肿大。术后病理: 囊肿型淋巴管瘤。 � � 讨论 � 囊状淋巴管瘤为先天性良性肿瘤 ,好发于颈部及腋 窝,多发生于新生儿。该患者发现本病已为成年, 较少见。超声 能准确提供肿块大小、位置与周围血管、组织的关系。 ∀1666∀ 中国医学影像技术 2004年第 20卷第 11期 � Chin J Med Imaging Technol, 2004, Vol 20, No 11