薄层色谱法分要低聚乳果糖

国属 盛 缀 鸦 ■ ■：建立了薄板层析扫描法测定低聚乳果糖含量的。通 过多次实验确定了低聚乳果糖薄层色谱的条件，其 最佳展开荆为正丙醇：水=9：2，显色荆为苯胺一二苯胺一磷 酸溶液 ，扫描波长为 530nm。 关■词：低聚乳果糖，薄层色谱，薄层扫描 Absl删 ：The thin —layer chromatography method was established to determine lactosucrose The analvsis condition was confirmed by many experiments．The optimum mobile phase was normaI propyI alco hoI： water=9：2 Lactosucrose was visualized by aniline- diphenylamine-phosphoric acid． Wave Iength for scanning was h=530nm． 脚 wer~：lactosucrose； thin-layer chromatography； thin- Iayer scan 中图分类号：Ts2O1．1 文献标识码：A 文 章 编 号 ：1002—0306(2004)01—0131—03 目前 ，对 低 聚乳 果糖 的常 规分 析 常采 用 高效 液 相 色谱 法 ，但高 效 液相 色谱 的色谱 柱 较难 制 备且 分 析费用 较 高 。薄 层 色谱具 有 操 作简 单 、快捷 、灵敏 度 高和 准确 可靠 等 特点 ，可 以广 泛应 用 于实 验室 研 究 ， 但 尚未 见到 采用 薄层 色 谱 分析 法 分析 低 聚乳 果糖 的 报 道 。本文通 过 系统 的研究 ，建立 了低 聚乳 果糖 的薄 层色 谱 分析 法 ，为低 聚乳果 糖 的生 产 和 应用 提供 了 一 种经 济 、简便 的分析 方法 。 1 与方法 1．1 材料与仪器 硅 胶 G 青 岛海 洋化 工 有 限公 司产 品 ；其 它 试 剂 均 为 分析 纯 ；低 聚乳 果 糖标 准样 购 于 日本 ；节 杆 菌 10138 购于 中 国工 业微 生 物菌 种保 藏 中心 ；酵 母 膏 1．2％ ，蛋 白 胨 0．8％ ， 蔗 糖 4％ ，MgsO ·7H2O 0．1％ ，(NH4)2HPO4 0．4％ ，调 pH 为 7．0，0．1MPa灭 菌 20rain。 日本 岛津 CS一9301型 薄层扫 描仪 ，微量 注射 器 。 1．2 实验方法 收稿日期：2003一O3—26 作者简介：朱桂兰(1980-)，女，硕士研究生。 (江南大学食品学院，无锡 214036) 朱桂兰 童群义 1．2．1 溶液 配制 1．2．1．1 标 准 溶 液 的配 制 准 确 称取 低 聚 乳 果 糖标 准 品溶 于去 离子水 中 ，定容 后备 用 。 1．2．1．2 苯胺一二 苯胺一磷 酸 显 色剂 的制 备 把 4g二 苯 胺 ，4mL苯 胺 及 85％ 的磷 酸 20mL溶 于 200mL丙 酮 液 中 。 1．2．1．3 样 品液 的制备 菌种 活化 后 按 2％的 接种量 接 入培 养基 中 ，30℃ ，1 10r／min培养 48h。培养 结束后 将 培 养液 以 4000r／min离 心 20min，收 集 上清 液 即粗 酶 液 。将 粗 酶液 和糖 液 (40％蔗糖 和 4o％乳糖 的混 合 液 )等体 积混 合 ，于 pH6．5，37℃反 应 24h得低 聚乳 果 糖 酶 反 应 液 。 将 3mL 的 酶 反 应 液 与 7mL乙 醇 混 合 ， 静 置 30min，然后 过滤 ，滤 液备用 。 1．2．2 试验 条件 1．2．2．1 薄层 条 件 称取 硅 胶 G溶 解 于一 定 比例 的 水 和 CMC中 ，涂 布 于洁 净 的玻 璃板 上 ，自然 凉干 ，于 ll0℃下 活化 lh，置 于 干燥 器 中备 用 。用 微量 进 样器 点 样 ，放 入展 开槽 中上 行法 展 开 ，展 开前 沿距 玻 璃板 上 端 lcm 时 ，取 出用 电 吹风机 吹 干 ，使 用喷 雾 法显 色 ，在 ll0℃下 烘 干 10min。 1．2．2．2 扫 描 条件 用 薄层 扫 描 仪 扫 描 显 色后 的硅 胶 板上 低 聚乳 果 糖斑 点 吸 收光谱 ，发 现最 大 吸 收波 长 为 530nm。最终 确定 薄层 扫描 条件 为 ：扫描 波长为 530nm，狭缝 尺 寸为 0．4mmx0．4mm，灵敏 度 中等 ，线性 SX=3。 2 结果与讨论 2．1 展开剂的选择及溶剂系统比例的优化 ． 低 聚乳 果糖 极 易 溶 于水 ，极 性较 大 ，根 据 溶剂 洗 脱顺 序 选择 了三 种展 开 剂 系统进 行 对 比 ，即 正丙 醇／ 水 、氯仿／甲醇／水／乙 酸和 正 丁 醇／乙酸／水 。 三种 展 开剂 对低 聚乳 果糖 的分 离结果 见表 1。 从 表 1可 以看 出 ，Ⅱ系统 的 分离 效果 最 差 ，I和 Ⅲ 系统 分离 效果 都 很好 ，斑 点 为 圆形 且 无拖 尾 现象 ， 其 中 I系统 低 聚乳 果 糖 和乳 糖 的分 离效 果 优 于 Ⅲ系 统 。考 虑综 合情 况 ，最 后 选择 I系统 为最 佳 展 开剂 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 分 析 检 测 表 l 各展开系统对低聚乳果糖的分离结果 注：I正丙醇：水=9：2(体积分数)；Ⅱ氯仿：甲醇：水：乙酸=15：12：1：3(体积分数)；Ⅲ正丁醇：乙酸：水=8：3：2(体积分数)。 表 2 精密度实验结果 ．0L表 1还 nJ"以 看 出 ，对 于 同 一 种 糖 在 不 同 的 展 开 系 统 中 ，其 比移值 不 同 ；在 同一 种展 开剂 中 ，随 单 糖 个 数 的增 加 ，比移 值减 小 。 2．2 显色剂的选择 通过 对碘 蒸气 、浓硫 酸 及苯 胺一二苯 胺一磷 酸 显 色 的 比较 ，碘 蒸 气 和浓 硫 酸显 色 背 景干 扰较 大 ，且 不 太 灵 敏 ，而 用 苯 胺 一二 苯 胺 一磷 酸 显 色 ，背 景 干 扰 小 ， 显 色 点 清 晰 。 2．3 定性测定 分别 将 葡 萄 糖 、蔗 糖 、乳 糖 、低 聚 乳 果 糖 标 准 品 和样 品点 于同 一薄 层板 上 ，其 展 开结 果 如 图 l所示 。 ．0L图 l可 以看 出 ，被 测 样 品 中含 葡 萄糖 、蔗 糖 、乳 糖 和 低 聚 乳 果 糖 ，据 推 测 还 有 一 定 量 的 果 糖 。 由于 所 选 的 展开 剂不 能 很好 地 分 离葡 萄糖 和果糖 ，它们 的斑 点重 合在 一起 ，所 以从 薄层 图中未 见有 果糖 的斑 点 。 a．葡萄糖 b．蔗糖 c．乳糖 d．低 聚乳果糖 e．样品 图 l 低聚乳果糖的薄层色谱图 2．4 定量测定 2．4．1 标 准 曲 线 分 别 吸 取 10mg／mL的 低 聚 乳 果 糖 标 准 溶 液 O．5、1、2、3、4、51xL，点 于 同一 块 硅 胶 板 上 ，用展 开 剂 I、苯 胺一二苯胺 一磷 酸 显色 剂 ，岛津 CS一9301型 薄层 扫描 仪 于 530nm处 扫 描 。以 低 聚乳 果糖 的检测 量 为横 坐 标 ，斑 点 的积 分 面积 为纵 坐 标 ， 其 标 准 曲线如 图 2，求 得 回归方 程为 ： Y=3179．8X-t-1723．6 R2=0．9901 2．4．2 精 密 度 和稳 定性 试 验 将 低 聚乳 果糖 标 准 溶 液 21xL在 同一薄 板 上点 6个 点 ，按上 述 方法 展 开 ，显 —— _—— 喜 ■_ _ 旧 鹫 莨 罂 进样量 ( L) 图 2 低聚乳果糖 曲线 色 ，扫描 ，得 各 点 积分 面 积 ，结 果 见 表 2，求 得 6次 测 定 值 的相对标 准偏 差为 2．34％。 对 上述 展 开 的斑 点 ，每 隔一 定 mJ-间 扫描 一 次 ，结 果 在 2h内 ，斑 点 积 分 面 积 稳 定 ，若 将 展 开后 的薄 板 放 入 密 封 容 器 中 ，24h测 定 与 显 色 后 立 即 测 定 并 无 太 大 影 响 。 2．4．3 酶 反应 液 中低 聚 乳果 糖 的定 量测 定 和 回收率 实验 在 硅胶 板上点 4个 4 L的样 品 ，按前 面 同样 的 方 法展 开 ，显色 ，扫描 ，得 到斑 点 面积分 别为 ：4733．92、 4904．78、4824．72、4798．52。根据 标准 曲线采用 外标法得 到酶 反应 液 中低 聚 乳 果 糖 的 含量 分 别 为 ：7．89、8．34、 8．13、8．06mg／mL，其 相对标准偏差 为 2．30％。 将 处 理 的 酶反 应 液 5mL加 入 lmL的低 聚 乳 果 糖 标 准溶 液 ，吸取 21xL样 液 和 21xL低 聚乳 果 糖标 准 溶 液在 薄 板上 点 样 ，按 以上 方 法展 开 ，显 色 ，扫描 ，按 外 标法 求得 回收 量 ，结果 见 表 3。 表3 回收率测定结果 试品 对鬟回 3 结论 本 文 建 立 了低 聚 乳 果 糖 的 薄层 色 谱 分 析 法 ，不 但 得 到 了较好 的分 离效 果 ，而 且利 用此 法 对 低聚 乳 (下转 第 123页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 毒 质 或抗 生 素 ；而 在美 国作 为产 生 细菌 素 的引 物 时 不 需 要 特 殊 的 考 虑 ，而 用 纯 化 的 细 菌 素 用 于 食 品 保 鲜 时 ，需 要 FDA 的 认 可 。 利 用 细 菌 素 进 行 结 构 基 因 的克 隆 ，已将 细 菌 素 基 因 克 隆 到 不 产 生 细 菌 素 的 乳 酸 菌 中 ，通 过 人 工 大 量 合成 细 菌 素 ，提 高细 菌 素 的 产 量 。尽 管 细 菌 素 已 有所 应 用 ，但 对其 很 多 性 质 了解 的 还 不 够 深 入 ，所 以 在使 用 细 菌 素 作 为食 品防 腐 剂 或 添 加 剂 时 ，需 要 考 虑 食 品 的结 构 和 成 分 对 细 菌 素 的 影 响 ；还 有 温 度 、pH 变 化 等 也会 影 响 细 菌 素 的活 性 ，这 是 由 于细 菌 素 一 般 在 pH 变 化 范 围 不 大 时 才 有 活 性 ，如 Nisin 在 pH2时 的 溶 解 度 比 pH8时 大 了 228倍 【“】。 目前 使 用 最广 泛 、研 究最 彻 底 的细 菌 素 是 Nisin，所 以其 他 细 菌 素 要 用 于 食 品 工 业 之 前 必 须 要 进 行 广 泛 的 毒 理 研 究 。 随着 生 物技术 和分 子生 物学 的不 断进 步 ，细 菌 素 的研 究 和应 用 已引起 了研 究 者 的 高度重 视 ，随之 将 会有更 多 的 细菌 素应 用 于食 品 工业 及新 药 开发 领 域 。相 信 随着细 菌素研 究 的深入 ，不 久 的将 来就 可不 用担 心化学 防腐 剂对 人类 的危 害。 食 品添 加 jN 参考文献： 【l】 aenh r，T R．FEMS Mierobiol Re,4Jl，1993(12)：39-85． 【2】 Nilisson，L．Chen，Y， Chikindas， M． Appl Environ Microbiol[J]．2O00．66：769-774． [3]3 Terebiznik M R，Jagus R J，et a1．Food Prot[J]，2000，63： 741-746． 『4】 Jennifer Cleveland， Thomas J M， et a1． International Journal of Microbiology[J]，2001，71：1-20． 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很 好 的装 饰性 ，新 颖 、 别 致 、美 观 ，具 有提 高 内装 物 品档 次 又增 加 市场 宣 传 的效果 。再 加上 该 易拉 盖 密封 性 好 ，拉启 方 便 ，使得 这 种 复 合型 易拉 盖 在罐 盖行 业 备 受青 睐 ，为易 拉 罐 新 产 品开 发包 装 封 口多 提供 了一项 选 择 ，也 多 了一 份 商 机 。 参考文献： 【1】 刘乘．复合易拉盖成型工艺及设备研究【J】．包装与食品机 械。2002(3)， 【2】 日本包装技术协会编，蔡少龄译．包装技术手册【M】．机械 工 业 出版社 ．1994． 【3】 赵淮．包装机械选用手册【M】．化学工业出版社，2001． (上 接 第 132页) 果 糖 进 行 了 定 量 测 定 ，结 果 表 明 ，这 种 方 法 完 全 可 以 应 用于 指导 低 聚乳 果糖 的生产 和 应 用试 验 。但 由于 薄层 板 系 自制 ，板与 板 间 的差别 较 大 ，喷雾 显 色 时不 能完 全均 匀 ，导致 斑 点 之 间有 一定 的差异 ，因此该 法 适合 于酶 法 生产 低 聚乳 果糖 的初期 研究 中菌 种筛 选 时产量 和 酶 活 的相对 评 估 ，更 精确 的研究 则需 要 采 用 高效液 相 色谱等 昂贵 的测定 方法 。 参考文献： [11 葛文光．低聚乳果糖的生理功能及加工特性[11．食品科学， *- --4-,*-4-*---4- 1998，19(6)：16～2O． 【2】 K Fajita，M Hirayama，H Hashimoto，et al Purification and 8one Properties of B—Fructofuranosider from Arthrobacter sp．K一1[J]．A c Biol Chem，1990，54(4)：931-919． 【3】 王肇慈．粮油食品卫生检测【M】．北京：中国轻工业出版社， 2oo1．1 17～135． 【4】 K Fujita， M Hirayama， H Hashimoto。 et a1． Transfructosylation Catalyzed by 13一Fructofuranoside from Arthrobacter sp．K-1[J】．A c Biol 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