显微镜检查

null临床病原体检查临床病原体检查李一荣临床病原体检查目的临床病原体检查目的明确感染是否发生以及病原体的类型。 提供体外抗微生物药物敏感实验的结果。 密切监视烈性传染病与新的传染病的发生，及时向行政主管部门。 配合相关机构进行流行病学调查。感染性疾病的现状感染性疾病的现状感染性疾病的病原体：细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体 以及寄生虫等。 自从抗生素的发现和预防接种的实施，许多曾严重危害人体健康的病原体已消灭或基本消灭。 新的传染病陆续被发现，曾绝迹的老传染病部分死灰复燃。 条件致病菌感染比例增加。 多重耐药菌株不断出现。 临床病原体检查的基本程序临床病原体检查的基本程序医生、护士、病人、检验师：正确采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学和分子生物检测、病原体分离培养鉴定、药敏实验——报告结果。 医生：明确诊断、合理用药。标本采集的基本原则标本采集的基本原则根据病史与临床表现确定标本采集的类型与部位，尽量采集病变明显部位标本。 在发病的早期或急性期采集标本，最好在抗生素使用前（如使用过抗生素应在申请单上注明）。 采集标本防止污染，并置于无菌容器，加盖密封、立即送检。 标本必须贴上标签，与检验申请单同时送检。检验申请单的基本检验申请单的基本内容The patient,s name and hospital number. Age and sex. Collection date and time. Diagnosis. Exact nature and source of the specimen. Ordering physician. Immunization history and antimicrobial therapy. Objective.标本送检标本送检标本要求在30min内送检，否则影响阳性率。 烈性传染病标本需专人护送。 检验科可拒收部分标本检验科可拒收部分标本The information on the label does not match the information on the requisition. The specimen has been transported at the improper temperature or in improper medium. The quantity of specimen is insufficient for testing . The specimen is leaking . 检验科可拒收部分标本检验科可拒收部分标本The specimen transport time exceeds 2 hours postcollection and the specimen is not preserved. The specimen was received in a fixative which kill any microorganism present. The specimen is dried. The specimen has been received for anaerobic culture from a site known to have anaerobes as part of normal flora. 血液标本的采集血液标本的采集适应症：疑似菌血症、败血症或脓毒血症的病人。 一般在抗生素使用前，于发热初期或高峰期采血。 24小时内采血2~3次可提高阳性率。 血液与培养基的比例为1：10，一般成人血量10~20ml，婴儿1-5ml。血液标本的采集方法血液标本的采集方法呼吸道标本采集呼吸道标本采集类型：鼻咽拭、痰和经气管采集的标本。 上呼吸道存在正常菌群，在采集标本与结果分析时应予考虑。 痰标本的采集痰标本的采集采集时间：晨痰，且在取痰前用清水反复漱口。 方法：（1）自然咳痰法：（2）气管镜下采集法；（3）气管穿刺法。尿标本的采集尿标本的采集无菌采集中段尿 如考虑厌氧菌感染，采取膀胱穿刺法采集标本。 排尿困难者考虑导尿采集标本。粪便标本采集粪便标本采集自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。 排便困难者，采用直肠拭子采集。 怀疑霍乱弧菌感染引起的腹泻，立即接种或将标本置于碱性蛋白胨或卡-布运送培养液送检。 传染性腹泻应连续送检3次。生殖道标本生殖道标本男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。生殖道标本生殖道标本女性：用无菌棉纤采集阴道或宫颈分泌物。怀疑厌氧菌感染，应采用阴道后穹隆穿刺法，并立即接种于厌氧平板。 疑似梅毒螺旋体感染，直接从外生殖器硬下疳蘸取渗出液，置于盖玻片上，立即送检。脑脊液脑脊液由临床医生采用腰椎穿刺，抽取2-3ml，置于无菌容器中立即送检，不能暂时保存于冰箱中。胸腹水等穿刺液标本胸腹水等穿刺液标本标本采集应在用药前或停止用药后1~2天后进行。 用无菌注射器抽取可疑标本，分别置于抗凝与不抗凝无菌容器中立即送检。 怀疑厌氧菌感染，采用床边接种为宜。脓液及创伤感染分泌物标本脓液及创伤感染分泌物标本开放性脓肿及脓性分泌物：用无菌棉纤采取脓液或病灶深部分泌物，置于斯氏运送培养基送检。 封闭性脓肿：局部消毒后，用注射器抽取，怀疑厌氧菌感染，应隔绝空气采集。 大面积烧伤的创面分泌物：用无菌棉纤多点采取脓液或分泌物，置于无菌试管中送检。检查方法检查方法直接显微镜检查。 病原体抗原与抗体的检测。 病原体核酸的检测。 病原体的分离培养与鉴定。SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原体的确定SARS（severe acute respiratory syndrome ）病原体的确定电子显微镜发现为 某种冠状病毒电子显微镜发现为 某种冠状病毒基因组测序锁定为 新型冠状病毒基因组测序锁定为 新型冠状病毒复制出相应的动物模型复制出相应的动物模型建立新的检测方法建立新的检测方法PCR法 间接免疫荧光法 ELISAnull直接显微镜检查的目的与评价（1）直接显微镜检查的目的与评价（1）染色标本目的：了解细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体。 评价：为临床初步诊断提供依据。如CSF找到抗酸杆菌，应初步考虑结核分枝杆菌感染。null革兰氏阳性球菌革兰氏阴性杆菌null墨汁染色找 新型隐球菌 抗酸染色直接显微镜检查的目的与评价（2）直接显微镜检查的目的与评价（2）不染色标本：用于观察病原体的大小、形态与运动等特性。 结果评价：部分病原体可借此初步诊断，如暗视野显微镜下见弹簧状螺旋体，应怀疑梅毒螺旋体的感染。病原体分离培养与鉴定的目的病原体分离培养与鉴定的目的明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。细菌分离培养与鉴定的结果评价细菌分离培养与鉴定的结果评价正常人群的无菌体液中检测到细菌，应考虑细菌为感染的病原体。 存在正常菌群的标本检测到细菌，应结合细菌的量考虑是否为致病菌。 如临床表现支持感染，但培养阴性，应考虑为标本不合格、培养不恰当等因素。 直接镜检找到病原体，而培养阴性，应考虑有L细菌、厌氧菌或苛氧菌感染。病毒分离培养与鉴定的结果评价病毒分离培养与鉴定的结果评价必须结合流行病学资料、临床表现、标本来源及病毒种类加以分析。 从组织、血液以及脑脊液中分离到病毒可明确诊断。 从呼吸道、肠道等分离到病毒，如该病毒人体不能长期携带，有诊断价值，如麻疹病毒、流感病毒等。反之需相应的临床表现，才有病原学意义，如巨细胞病毒，肠道病毒等。 阴性不能排除病毒感染。病原体核酸的检测病原体核酸的检测聚合酶链式反应：扩增病原体微生物特异的DNA或 RNA片段。 探针杂交法：通过已知序列的探针与病原体的核苷酸杂交，用以了解病原体的有无。病原体核酸检测结果评价病原体核酸检测结果评价是检测病原体微生物最灵敏的方法，但具有一定的假阳性与假阴性。 阳性只表明存在某种病原体的核酸，是否正被感染应结合临床具体分析。病原体抗原与抗体的检测病原体抗原与抗体的检测特异性 IgM可作为感染性疾病的早期诊断指标，且可区分原发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的滴度呈4倍或4倍以上升高，考虑病原体感染。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确感染的病原体。第二节 临床常见病原体检查第二节 临床常见病原体检查临床常见病原体为：细菌、病毒、支原体、衣原体、立克次体 以及寄生虫等。细菌感染检查项目的选择细菌感染检查项目的选择普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。 流行病学调查：病原体抗体检测，如ASO试验与Widal反应等。病毒感染检查项目的选择病毒感染检查项目的选择细胞培养快速复制的病毒：细胞培养。 细胞培养不能快速复制的病毒：目前多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸，如CMV。 不能细胞培养的病毒：病毒核酸检测与病毒特异性抗体检测，如HCV、HPV等。真菌感染检查项目的选择与应用评价（1）真菌感染检查项目的选择与应用评价（1）直接显微镜检查：初步明确真菌感染。 真菌感染检查项目的选择与应用评价（2）真菌感染检查项目的选择与应用评价（2）分离培养：明确何种真菌感染。 真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织胞浆菌等。 真菌抗体检测：深部真菌的检测。寄生虫感染检查项目的选择与应用评价寄生虫感染检查项目的选择与应用评价直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。 寄生虫抗体检测：辅助诊断。支原体感染检查项目的选择与评价支原体感染检查项目的选择与评价直接显微镜检查：无价值。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测支原体抗原与核酸，用于早期快速诊断。 螺旋体感染检查项目的选择与评价螺旋体感染检查项目的选择与评价直接显微镜检查有初步诊断价值。 特异性抗体的检测为确诊依据。衣原体感染检查项目的选择与评价衣原体感染检查项目的选择与评价直接显微镜检查：检查衣原体包涵体可提供早期初步诊断。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测衣原体抗原与核酸，用于早期快速诊断。第四节性传播疾病病原体检测第四节性传播疾病病原体检测性传播性疾病（sexually transmitted disease,STD）：是指通过各种性接触而传播的侵犯皮肤、性器官及全身多脏器的疾病，简称性病（venereal disease）重要的性病及病原体重要的性病及病原体 性病 病原体 淋病 淋球菌 梅毒 梅毒螺旋体 艾滋病 人类免疫缺陷病毒 非淋球菌尿道炎 溶脲支原体、沙眼衣原体等 生殖器疱疹 单纯疱疹病毒 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒淋病病原体的检测方法选择与评价（1）淋病病原体的检测方法选择与评价（1）直接显微镜检查：多形核白细胞内见革兰氏阴性双球菌，男性泌尿生殖道标本可明确诊断，而女性需结合培养结果分析。淋病病原体的检测方法选择与评价（2）淋病病原体的检测方法选择与评价（2）分离培养；广泛采用，阳性即可确诊。 PCR：可用于早期快速诊断，但假阳性率高。 特异性抗原与抗体检测：方法尚不成熟。梅毒螺旋体感染检查项目的选择与评价梅毒螺旋体感染检查项目的选择与评价直接显微镜检查：有初步诊断价值。 非特异性抗体的检测：过筛试验。 特异性抗体的检测：确诊试验。非淋球菌性尿道炎检测方法选择与评价非淋球菌性尿道炎检测方法选择与评价特异性抗体的检测：意义不大。 分离培养；阳性可确诊。 直接显微镜检查：适用于衣原体的检测。 目前临床多检测抗原与核酸，用于早期快速诊断。艾滋病病原体检测艾滋病病原体检测直接显微镜检查与分离培养：临床较少采用。 HIV-RNA检测：排除假阳性可确诊。 HIV抗体检测：ELISA等为过筛实验，Westerblot为确诊实验。单纯疱疹病毒单纯疱疹病毒分离培养；阳性可确诊。 目前临床常检测HSV-DNA与HSV抗原，用于早期快速诊断。 人乳头瘤病毒 人乳头瘤病毒不能分离培养 目前临床常检测HPV-DNA与HPV抗原，用于早期快速诊断。 重要的性病及诊断金重要的性病及诊断金标准 性病 诊断金标准 淋病 分离培养 梅毒 特异性抗体检测 艾滋病 免疫印迹法与RT-PCR 非淋球菌尿道炎 分离培养、鉴定 生殖器疱疹 分离培养、鉴定 尖锐湿疣 PCR第三节 医院感染常见病原体检查第三节 医院感染常见病原体检查医院感染（nosocomial infection）：又称医院获得性感染（hospital acquired infection），指患者在入院时不存在，也不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得的而在出院后发病的感染。广义的医院感染对象不仅指住院患者，还包括门诊病人、医院职工、探视人员与陪护人员等。医院感染的高危人群医院感染的高危人群慢性疾病，如肿瘤、糖尿病以及肝硬化等。 免疫抑制剂及激素的使用着。 化疗及放疗患者。 手术及麻醉患者。 使用介入性诊断与治疗的患者。 广谱抗生素使用者。医院感染的感染源医院感染的感染源病人、医院职工、探视人员、陪护人员。 医院环境、未彻底消毒的医疗器戒、血液制品等。 医院感染常见的病原体医院感染常见的病原体细菌为主要病原体。 细菌的种类因时、地和人而异。 不同临床类型其感染细菌的构成比不同。医院感染检查内容医院感染检查内容基本原则与病原体感染类似，但更应注意正常菌群的污染以及条件致病菌在医院感染中的地位。 定期对医院环境进行病原体监测。 定期对医疗器械的消毒效果进行监测。第五节 细菌耐药性检查第五节 细菌耐药性检查 抗微生物药物敏感试验(antimicrobial susceptibility test, AST)对敏感性不能预测的临床分离株进行药敏试验，以指导临床选择治疗药物。体外抗菌药物敏感试验的目的体外抗菌药物敏感试验的目的临床分离菌株，如不能对抗生素敏感性进行预测，必须常规进行药敏试验。 临床治疗效果差而考虑调整抗菌药物时。 了解细菌耐药的流行病学情况。 评价新抗菌药物的抗菌谱和抗菌活性等。体外抗菌药物敏感试验的方法体外抗菌药物敏感试验的方法体外抗菌药物敏感试验主要包括抑菌试验、杀菌试验、联合药敏试验和检测细菌产生的抗生素灭活酶等。常用方法有: 纸片扩散法（Kirby-Bauer test） 稀释法（dilution test） E试验法（E test） 杀菌试验 体外联合药物敏感试验 药敏试验结果的解释（1）药敏试验结果的解释（1）敏感（susceptible）：表示测试菌能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭。 耐药（resistant）：表示测试菌不能被测定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度所抑制或杀灭，治疗无效。 药敏试验结果的解释（2）药敏试验结果的解释（2）中介 (intermediate) : 该范围作为敏感与耐药之间的缓冲区，避免由于微小技术误差影响实验结果。 最低抑菌浓度（MIC）：能够抑制检测菌肉眼可见生长的最低药物浓度称为测定药物对检测菌的最低抑菌浓度。特殊的耐药菌监测的特殊试验特殊的耐药菌监测的特殊试验 由于细菌存在一种或几种耐药机制，造成了细菌的多重耐药性。单一的药敏试验已不能完全表示细菌的耐药性，必须进行一些特殊的耐药性监测试验。β-内酰胺酶的检测β-内酰胺酶的检测β-内酰胺酶：可水解β-内酰胺类抗生素。 临床意义：（1）流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌以及卡拉莫拉汉菌等阳性，表示对青霉素、氨卞西林以及阿莫西林耐药。（2）葡萄球菌属以及肠球菌属等，阳性表示对青霉素、氨基组青霉素、羧基组青霉素以及脲基组青霉素耐药产超广谱β-内酰胺酶(extend spectum β-lactamase, ESBL)的肠杆菌科细菌产超广谱β-内酰胺酶(extend spectum β-lactamase, ESBL)的肠杆菌科细菌超广谱β-内酰胺酶是由质粒介导的β-内酰胺酶，可水解青霉素类、头孢菌素和氨曲南，主要在大肠埃希菌和克雷伯菌属等肠杆菌科细菌中产生。 临床意义临床意义产ESBL细菌,不论体外药物敏感试验结果如何, 对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南治疗均无效。耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的肠球菌定义: 对30μg万古霉素纸片抑菌圈直径≤19mm， 或MIC≥32μg/ml应视为耐万古霉素肠球菌（vancomycin resistant enteroccoccus，VRE）。 临床意义临床意义耐万古霉素肠球菌目前尚无有效的治疗方法，但是对青霉素敏感的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗，若对青霉素耐药而不是高水平耐氨基糖苷类可用壁霉素和庆大霉素。另外氯霉素、红霉素、四环素（或多西环素、或米诺环素）及利福平可用于VRE株。耐青霉素的肺炎链球菌 耐青霉素的肺炎链球菌 定义：1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径<19mm且MIC>2μg/ml应视为耐青霉素肺炎链球菌（penicillin resistant strepttococcus paeumoni，PRSP）。 临床意义临床意义PRSP对氨苄西林、 氨苄西林/舒巴坦、 头孢克肟、 头孢唑啉的临床治疗疗效很差，治疗时参考药敏结果选择药物，经验治疗重症感染时，可用头孢曲松或头孢噻肟联合万古霉素用药。耐甲氧西林的葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）耐甲氧西林的葡萄球菌（methecillin resistance staphylococcus，MRS）1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤10mm，或MIC≥4μg/ml的金黄色葡萄球菌, 1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径≤17mm，或MIC≥0.5μg/ml的凝固酶阴性葡萄球菌称耐甲氧西林葡萄球菌。临床意义临床意义对所有β-内酰胺类药物均无效,并对氨基糖甙类、大环内脂类、克林霉素和四环素等抗生素多重耐药。治疗首选药物为万古霉素。