蛋白质工程1

null蛋白质蛋白质工程井 健null1983年，Ulmer在“Science”上发表以“Protein Engineering‘’ (蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。 蛋白质工程的主要和基本目的可以概括为：以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造，、构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更加符合人类社会需要的新型蛋白质。 第一章 蛋白质结构基础第一章 蛋白质结构基础第一章 蛋白质结构基础 第一章 蛋白质结构基础 蛋白质工程的基本目标 蛋白质工程的理论基础 蛋白质三维结构与功能的关系 蛋白质结构知识的重要性 第一节 蛋白质结构的基本组件第一节 蛋白质结构的基本组件一、天然常见氨基酸 二、肽单位和多肽链 三、α 螺旋 四、β层 五、环肽链 六、疏水内核 一、天然常见氨基酸一、天然常见氨基酸 构成蛋白质分子的基本化学单位是氨基酸。在所有蛋白质中常见的天然氨基酸共20种。 在有机体内通过生物合成连接成多肽链，其顺序由编码基因中的核苷酸三联体遗传密码决定。 1．基本结构 1．基本结构 20种常见氨基酸中，19种都具有如下共同的化学结构： 其中心碳原子(Cα)除结合一个H原子外，还分别连接一个氨基(NH2)和一个羧基 (COOH)，构成氨基酸的主链，它们在所有氨基酸中都是相同的。R称为氨基酸的侧链，不同氨基酸的区别就是其侧链R的化学结构不同。 R H2N-CH-CO2Hnull另有一种脯氨酸具有类似而不相同的化学结构。它们的侧链与主链N原子共价结合，形成一个亚氨基酸。结构的特殊性决定了脯氨酸功能的特殊性。 2．基本性质2．基本性质20种不同的氨基酸侧链具有各种各样的化学特性，当它们以各种顺序结合成蛋白质分子时，其性质会有更多的变化，使其蛋白质的特性远不同于简单的有机分子。20种氨基酸侧链的性质是了解蛋白质的基本出发点。 （1） 疏水氨基酸 （2） 极性氨基酸 （3） 荷电氨基酸 3. 单一构型和旋转异构体 3. 单一构型和旋转异构体 （1）构型与构象 （2）天然氨基酸的单一构型 （3）优势构象与旋转异构体 二、肽单位和多肽链 二、肽单位和多肽链 1．肽链和肽单位 (1)肽键与多肽 20种氨基酸在蛋白质中是通过肽键(peptide bond)连接在一起的。一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接称为肽键： R1 R2 H2N-CHCOOH+H2N-CH-COOH R1 R2 H2N-CH-C-NH-CH-COOH+H2Onull (2) 肽单位与多肽主链 由于局部双键性质，肽键连接的基团处于同一平面，具有确定的键长和键角，是多肽链中的刚性结构，称为肽单位(peptide unit)。有序连接的肽单位就是多肽链的主链。因此，从结构上看，肽单位和侧链基团是蛋白质分子的基本建筑模块。 肽单位（阴影部分）连接形成的多肽链 2．多肽链的构象 2．多肽链的构象（1）扭角(torsion angle)或双面角(dihedral angle)系统 （2）多肽链的构象角 （3）Ramachandra构象图及多肽链构象的允许区 三、α螺旋 三、α螺旋 α螺旋(α-helix)是被首先肯定的一种蛋白质空间结构的基本组件，并被证实普遍存在于各种蛋白质中。基于相关小分子和肽单位结构的精确几何参数，美国加州理工学院的Linus Pauling在1951年首先提出。螺旋结构并预言它稳定地存在于蛋白质中。这一结构模型很快被美国剑桥的Max Parutz关于肌红蛋白和角蛋白的X射线衍射所支持，随后被第一个实验测定的高分辨率肌红蛋白的晶体结构(John Kendrew , 1959)所证实。现在大量已知蛋白质结构中，发现α螺旋普遍存在。 null1．基本结构参数 2．螺旋偶极子 3．两亲性螺旋 4．倾向于形成α螺旋的氨基酸 5．310螺旋和π螺旋 四、β层 四、β层 1．β链 2．平行β层和反平行β层 3．混合型β层和扭转β层 五、环肽链 五、环肽链1．回折(reverse turn) （1） β转折 （2）γ转折 2．β发夹 （1）β发夹(β－hairpin) （2）β凸起(β－bulge)null 长环肽链的构象常具有相当的柔性(flexibility) 功能意义：这类柔性肽链的构象一般在Ｘ射线结构分析和NMR结构分析中都难于测定。但这种构象柔性常常对蛋白质的功能发挥具有特定意义，通过这种柔性肽段的运动，可以将蛋白质的活性中心打开，也可以将其关闭，以适应在活性发挥不同阶段的不同立体化学环境要求。 长链环一般易受蛋白酶降解，它们常常结合金属离子(主要是Ca2+)来稳定自己并拮抗蛋白酶的攻击。null 短肽链环的构象取决于特定氨基酸残基位置 对I型β转折，任何氨基酸都可出现在其i～(i+3)的位置，但Pro不能出现在i+2位置。 在I型和Ⅱ型转折中，Gly主要位于i+3，Pro主要位于i+1；Asp、Asn、Ser和Cys经常出现在i位置，其侧链常与i+2残基NH成氢键；Gly和Asn最常出现在Ⅱ型转折的i十2位置，因为它们最易于接受在此位置所要求的主链构象角。 I’型转折的i+1和i+2位的优势氨基酸为Gly，Ⅱ’型在i+2位为Gly。 六、疏水内核 六、疏水内核疏水内核的形成与疏水相互作用 疏水内核在蛋白质中的分布 疏水内核是蛋白质折叠的主要驱动力 疏水内核是天然蛋白质稳定的基本结构因素null第二节 蛋白质结构的组织和主要类型 蛋白质结构的特点与组织形式 蛋白质结构的复杂性 蛋白质结构的有序性 null 一、蛋白质结构的层次体系 丹麦生物化学家 Kai Linderstram 首先将蛋白质结构划分为一级、二级和三级结构； 英国化学家 Bernal 又使用四级结构来描述复杂多肽链蛋白质分子的亚基结构。 随着大量天然蛋白质的结构测定及以此为基础的综合分析，在二级结构与三级结构之间又发现了结构模体(超二级结构)和结构域，从而揭示了蛋白质结构的丰富层次体系(structure hirarchy)。 1．一级结构(primary structure)1．一级结构(primary structure)● 一级结构是指多肽链中氨基酸的顺序，或氨基酸沿线性多肽链的排列。 ● 在有二硫键的蛋白质中，一级结构的内容也常包含二硫键的数量和配对方式。 ● 一级结构是蛋白质结构层次体系的基础，它是决定更高层次结构的主要因素。 ● 一级结构决定高级结构，这是蛋白质结构组织的基本原理。 ● 两个不同蛋白质的一级结构如果具有显著相似性，则称它们彼此同源(homology)。由于同源蛋白的编码DNA序列也有显著的相似性，因此一般认为它们在进化上是相关的，是从一个共同的始祖基因(ancestral gene)进化而来。 ● 氨基酸是构成一级结构的基本元素，存在于天然蛋白质中的常见氨基酸共有20种，它们彼此通过肽链相连。null● 概念：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角(Φ，Ψ)来表征，构成一种特征的多肽链线性组合，称为蛋白质的二级结构。二级结构是多肽主链局部区域的规则结构，它不涉及侧链的构象和与多肽链其他部分的关系。 ● 二级结构主要包括：α螺旋、平行β层、反平行β层，β转折、310螺旋。 ● 二级结构的规则构象主要被其内部形成的主链氢键所稳定，因此氢键的排布方式也是二级结构的重要特征。 3．结构模体(motif，structural motif） 3．结构模体(motif，structural motif）概念： 在蛋白质中常常发现，一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近，彼此按特定的几何排布形成简单地组合，可以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体。 特征：结构模体是一类超二级结构(supersecondary structure)．它们是三级结构的建筑模块。有的模体与特定的功能相关，如与DNA结合；许多模体并没有专一的生物功能，只是大结构和组装体的一个组成部分。 4．结构域 4．结构域概念： 二级结构和结构模体以特定的方式组织连接，在蛋白质分子中 形成两个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为 结构域(domain)。 特征：结构域是蛋白质三级结构的基本单位，它可由一条多肽链(在单 域蛋白质中)或多肽链的一部分(在多域蛋白质中)独立折叠形成 稳定的三级结构。一个分子中的结构域区之间以共价键相连 接，这是与蛋白质亚基结构(非共价缔合)的基本区别。一般说 来，较大的蛋白质都有多个域区存在，它们可以非常不同的方 式组合，从而以有限类型的域区结构组合成极为复杂多样的蛋 白质整体结构。正是在结构域的基础上，才有可能对蛋白质进 行结构分类。同时，结构域也是功能单位，不同的结构域常常 与蛋白质的不同功能相关联。 5．三级结构(tertiary structure) 5．三级结构(tertiary structure) 概念：结构域在三维空间中以专一的方式组合排布，或者二级结构、 结构模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同 盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布，这就是蛋 白质的三级结构。 特征：蛋白质的亚基和结构域是具有三级结构的蛋白质分子的亚单 位。对于无亚基并只有单结构域的蛋白质，三级结构就是它的 完整三维结构。对于大多数较大的蛋白质，它们具有多个结构 域或亚基，需要通过这些三级结构单位的进一步组织才形成完 整的分子。 6．四级结构 (quaternary structure)6．四级结构 (quaternary structure)概念：蛋白质分子的亚基结构。 特征：许多蛋白质作为完整的活性分子，是由两条以上的 多肽链组成，它们各自以独特的一级、二级、三级结 构相互以非共价作用联结，共同构成完整的蛋白质分子 。这些肽链单位称为亚基(subunit)，其聚合整体称为寡 聚体(oligomer)。多亚基蛋白中亚基的数目、类型、空间 排布方式和亚基间相互作用的性质，都属于蛋白质四级 结构的基本内容。 结构的复杂性结构的复杂性 随着蛋白质结构知识的不断丰富，许多蛋白质是以复合物、组装体作为完整的功能单位，其间所有三级折叠单位的组织方式也应纳入蛋白质四级结构的范畴。 水构成蛋白质结构和功能整体的有机组成部分，是蛋白质结构组织中的重要因素。 二、蛋白质结构分类 二、蛋白质结构分类 复杂性和多样性是蛋白质结构的重要特征，因此一般很难按蛋白质分子的整体形貌对已知蛋白质结构进行分类。随着已知蛋白质结构数量的增加，系统的比较研究发现，在结构域中结构模体的组织方式是有限的，而且一些组合具有明显的优势，常常出现在功能和序列都不相同的蛋白质中，使蛋白质的结构域表现出一些主要的类型。 以此为基础，M.Levitt、C.Chothia以及J.S.Richardson 对已知蛋白质结构进行了系统的解剖分析，在结构域水平将蛋白质的结构划分为以下5类。1．按结构域分类1．按结构域分类(1) α型结构(αstructure) (2) β型结构(β structure) (3) α/β型结构 (4) α+β型结构 (5) 无规型／富含二硫键和金属离子型null(1) α型结构(αstructure) 这类蛋白质主要由α螺旋组成，其螺旋含量一般在60％以上，有的高达80％。α螺旋在这类蛋白质中大多以反平行方式排布和堆积，所以又称反平行α结构。 按照螺旋排布的不同拓扑学特征，又可分为一些亚组。肌红蛋白、血红蛋白、烟草花叶外壳蛋白、细胞色素b，等均属此类结构。分 类分 类(1) 线绕式α螺旋(coiled-coil α helix) (2) 四螺旋束 (four helix bundle) (3) 珠状折叠(globin fold) (4) 复杂螺旋组合 (2)β型结构(β structure) 此类结构主要由反平行β层构成。β型结构在大小和组织上都有很大的变异范围，但在大多数情况下反平行β层都缠绕成一柱状或圆桶状，其缠绕方式可以是链间的顺序连接，也可以是链间的跨接。 丝氨酸属水解酶、免疫球蛋白A、一些球状RNA病毒的外壳蛋白等均属此类。分 类分 类β型结构组织较为复杂，具有相当大的多样性。根据其形貌和组织特征可概分为： 上一下桶式(up-and-down βbarrel)和开放式折叠(up-and-down open βsheet) 希腊钥匙(回纹)式折叠(Greek key β barrel) β螺旋折叠(parallel β-helix fold)null(3) α/β型结构 这是已知数量最多的一类结构，它由平行的或混合型的β层被α螺旋包绕构成，主要是β-α-β模体的组合。在这类结构中β层和螺旋内部各股链主要以平行方式排布，所以也称为平行α/β型。当然，其中螺旋与相邻β链彼此是反平行的。多数情况下，一个5～9条链组成的平行β层在中央，两侧是α螺旋，形成三层式结构。 依据β链组织方式的不同，它们呈现出许多不同类型。丙糖磷酸异构酶、醛缩酶、乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、磷酸甘油酸激酶等均属此类结构。分 类分 类3种基本类型： TIM桶式折叠(TIM barrele) 扭转开放式折叠(Rossman fold) 马蹄式折叠(horseshoe fold)null(4)α+β型结构 这类结构中既含α螺旋又含β层结构，但α螺旋与β层在空间上彼此不混杂，分别处于分子的不同部位，有时α螺旋和β层分别形成两个结构域。 已知这类结构的数量不多，因此有时将它们按α螺旋或β层部分的组织特征分别划入以上三种类型中。溶菌酶、嗜热菌蛋白酶、核酸酶等属此类结构。null(5)无规型／富含二硫键和金属离子型 这是一类小蛋白质分子，它们没有典型的二级结构，或者所含二级结构的组成和组织没有明显的规律可循。 这类蛋白质分子虽然不大(一般小于100个氨基酸残基)，但含有较多的二硫键或金属离子以稳定其三维结构，所以在有的分类中称它们为富含二硫键和金属离子型蛋白。null上列前三类结构所占的比例分别是20％(α型)、32％(β型)、35％(α/β型)。 尽管随着用于统计分析的数据基础不同，这些比例数字也会有所变化，但是都表明这三类结构包含了已知蛋白质的绝大部分。总 结 2．系统性分类 2．系统性分类随着已知蛋白质结构数量迅速增加，在蛋白质结构数据库(protein data bank，PDB)中登录的原子坐标已超过16 000个，这为蛋白质结构分类提供了新的更加丰富的数据基础。同时，蛋白质结构预测、蛋白质折叠以及蛋白质工程研究，需要更加深入和系统的蛋白质结构分类知识。因此，近年来发展了一系列按层次体系(hierarchy)对蛋白质结构进行分类的新方法、新程序，并将应用这些方法所获得的分类知识构建成数据库，以资源共享的原则免费开放使用。 目前较为系统和广泛使用的数据库为SCOP、CATH、DALI／FSSP／DDD。 第三节 多肽链的生物合成与折叠 第三节 多肽链的生物合成与折叠从前两节我们了解到，蛋白质是具有高度组织、结构极复杂的生物大分子，尽管它们的分子量可以从几千到百万道尔顿，它们的结构可以有多个层次、多种类型，但它们可以在有机体内被精确产生。了解这种复杂蛋白质结构的形成机理，对于以设计和构建新型蛋白质为目标的蛋白质工程的战略性考虑和具体途径选取，都有十分重要的意义。现在知道，蛋白质在体内的形成可以大致分为两个阶段。折叠机理认识折叠机理认识对多肽链的折叠机理，至今尚缺乏本质性和规律性的认识。因此，尽管目前对于蛋白质的序列知识已有了丰厚的积累，对蛋白质的复杂结构已有了深入的了解，但至今还不知道能将二者直接联系起来的规律。这使得在目前从氨基酸序列去构建期望的蛋白质结构还只能是个案研究课题，、也是通过蛋白质工程设计和制造新蛋白质的基础性困难。 一、多肽链的生物合成 一、多肽链的生物合成自然界中的蛋白质可以由几十个氨基酸组成，也可以由上千个氨基酸组成。 按化学，蛋白质的共价结构是极其巨大和复杂的，但它仍可在有机体内被精确地制造。 有机体中所有相同的蛋白质分子都有同样的一级结构，所有不同的蛋白质分子都具有不相同的一级结构。这是由于有一个精确的生物合成机理，严格控制着作为蛋白质一级结构主要基础的多肽链的生成。多肽链生物合成的主要环节多肽链生物合成的主要环节多肽链生物合成的主要环节包括： 基因携带规定氨基酸序列的核苷酸三联体遗传密码 双链DNA分子的遗传信息转录到单链信使RNA(mRNA) mRNA在核糖上的翻译 二、多肽链的折叠 ——蛋白质三维结构的形成 二、多肽链的折叠 ——蛋白质三维结构的形成 多肽链折叠的基本概念 多肽链折叠的生理意义 多肽链折叠的机理 1．蛋白质折叠的热力学基础 1．蛋白质折叠的热力学基础 天然态蛋白质的三维结构主要取决于氨基酸序列一级结构决定高级结构许多实验事实证明，在给定环境(溶剂、pH值、离子强度、温度以及其他成分的存在)中，天然蛋白质是一种相对于所有自由度来说总体系统吉布斯自由能极小的状态，即天然态三维结构是由各种组成原子间相互作用(也就是由组成氨基酸的序列)决定的。这就是一级结构决定高级结构原理，是蛋白质结构形成的基本原理。体外蛋白质复性研究体外蛋白质复性研究体外蛋白质复性研究是建立上述原理的主要实验基础。所谓复性，是指变性蛋白质重新恢复到变性前的天然三维结构状态，使蛋白质丧失了的生物活性重新恢复。2．蛋白质折叠的动力学因素2．蛋白质折叠的动力学因素 天然构象特点： 在生理条件下，对一给定的氨基酸序列只会产生一种天然构象，它比其他构象有显著低的自由能。 天然构象产生的动力学特性：蛋白质分子在体内和体外折叠所需的时间在0.1～1 000s之间。 一定的动力学途径以某种方式指导折叠过程动力学过程问题动力学过程问题动力学途径也会对正确折叠产生障碍。因为动力学上可以接受的构象并不是能量最低的构象，使蛋白质在折叠中有可能陷入具有高位垒的局部低能状态，达不到整体能量极小，从而不能形成正确的折叠结构。 因此，一个重要的问题是，活细胞如何能避免折叠途径堵塞在一个中间态阶段。通常出现的障碍通常出现的障碍对正确折叠最通常出现的障碍包括： ①中间体通过外露疏水基团的聚合； ②不正确二硫键的形成； ③脯氨酸残基的异构化。 为了清除这些障碍，细胞产生了一些特殊蛋白质来帮助蛋白质正确折叠，如伴侣蛋白、二硫键异构酶等。 熔球态 (melton globule) 熔球态 (melton globule)熔球态是折叠的中间体，疏水侧链内埋是重要驱动力，在折叠途径中第一个可观测的中间体是柔性无序的未折叠多肽链卷折成局部有组织的球状态，称为熔球体(melton globule)。 熔球体的形成是一个快速过程，只需几毫秒，目前对之了解甚少。但对于熔球体的特性已有一些了解。 研究方法与能量变化研究方法与能量变化NMR、氢交换、波谱学、热力学等，综合应用于蛋白质折叠途径的研究。 在折叠过程中，蛋白质经历从高能量非折叠态到局部能量极小的亚稳中间态(熔球态)和不稳定的高能过渡态，最后到达低能的天然态。 非折叠态是一个大量构象不同分子U1…Un的集合体，它们处于迅速的相互转换之中； 熔球态是结构相关分子M1…Mn的组装体，它们经历快速相互转换，并缓慢地变为单一的特征构象——折叠态。 从熔球态到折叠态的转化速度缓慢，需经过一高能过渡态。 帮助正确折叠的蛋白帮助正确折叠的蛋白(1) 分子伴侣(molecular chaperone) (2) 帮助正确二硫键形成的酶 (3) 肽酰脯氨酰异构酶 三、蛋白质结构与蛋白质工程 三、蛋白质结构与蛋白质工程 蛋白质工程中反向生物学研究 蛋白质工程的基本问题与基本困难