四种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响

中国临床康复 第9眷第78脚 2005-05-14出版 Chinese Journal of Clinical Rehabilitation, May 14 2005 Vol. 9 No. 18 67 ·盖础研究 · 四种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响★ 曾润铭’，刘梦璋’，林 替 2PER Effects of four anti-rheumatoid arthritis of fibroblast-like synoviocytes in vitro drugs on proliferation Zeng Run-mi?? ????Meng-zhaple' s Hos Oncology, ', Lin Jing2, 'Department of Orthopaedics, ShantouSec al, Shantou 515031, Guangdong Province, China; Peo二ter of 为(46.14士4.20)%和(31.52士2.86)%，第10天分别(47.00土1.89)% 和(46.73士3.83) %。消炎痛及地塞米松对成纤维样滑膜细胞增殖无明 显抑制作用。这种抑制作用对于类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞增 殖尤为明显。雷公藤多贰比甲氨蝶吟对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑 制作用有更明显的时间依赖性。 结论:雷公藤、甲氨蝶吟对于类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖 有明显抑制作用，适当延长甲氨蝶吟用药间隔时间对于抑制滑膜组织 过度增生及血管臀的形成效果可能相似。 主词:关节炎，类风湿;成纤维细胞;滑膜/细胞学;细胞分离/方法; 细胞培养/方法 Nanfang Hospital, First Military Medical University of Chinese PI-A, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China Correspondence to: Zeng Run-mlng*, Master, Attending physician, De- partment of Orthopaedics, Shantou Second People' s Hospital, Shantou 515031, Guangdong Province, China hosward@ 21cn. corn Received: 2004一07一21 Accepted: 2004一11一23 Abstract AIM: To investigate the effect of four common anti-inflammatory arthritis drugs for rheumatoid arthritis (indometacin, dexamethasone, Tripterygium wilfordii Hook) on the in vitro proliferation methotrexate and synoviocytes(F1S) so as to rheumatoid arthritis to improve METHODS: The experiment provide clinical agents for their function. fibroblast-like patients with was conducted in the Laboratory for Biology, First Military Medical University from May 2003 to Cellular February 2004. The tissues of rheumatoid arthritis were obtained from the patients who had been operated with total knee replacement or arthroscopic synovectomy for their rheumatoid arthritis in the Department of Spinal Orthopaedics, Nanfang Hospital of First Military Medical University and in the Second Department of Surgery of Shantou Second People's Hospital, and the synovial tissues from the patients without the history of arthritis after traumatic am- putation of extremities. FLS were obtained场digesting synovial tissues with collagenase. After 12 hours of inoculation, the 2"a to 4' passages of FLS were cultured in the presence of four anti-inflammatory drugs respectively -for 24 hours. In vitro proliferation of FLS was assessed by the methyl-thiazolyl-tetrazolium(MTT) assay at day 5 and 10 and then analyzed ??? ?? ??? statistically. RESULTS: methotrexate Tripterygium The inhibition rate of FLS proliferation by wilfordii Hook was (46. 14土4. 20) % and( at day 5, spectively, and (47.00士1.89)% and (46.73土3.83 31.52士2 % at day 86 10 while indometacin or dexamethasone had FLS proliferation. The decreased proliferation of FLS on inhibitive effect on was more significantly changed in methotrexate 山eumatoid arthritis than in the effect of Tripterygium normal wilfordii arthritis. Compared with Hook on FLS was more significantly related with a time-dependent decrease in cell proliferation CONCLUSION: Methotrexate and Tripterygium wilfordii Hook has obviously inhibitive effects on the proliferation of FLS in rheumatoid efficacy in the inhibition of hyperplasia of synovium and arthritis. Similar pannus might be found when interval of time for administration of methotrexate is properly prolonged. Zeng RM, Liu broblast-like MZ, Lin J. Effeds of four anti-inflammatory drugs on synoviocytes of patients with rheumatoid arthritis proliferation of fi- ia vitro. Zhongguo Linchuang Kangfu 2005; 91181: 67一9(China) _.______._曾润铭，刘梦璋，林替.四种常用抗类风湿性药物对成纤维样R膜Mfg体外09A 的影响UI.中国HE床康复,2005,9(18):67一9 (www. zglckf. coml 摘要 目的:探讨叫噪美辛、雷公藤多贰、甲氨蝶吟、地塞米松4种常用抗类风 湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响，为类风湿性关节炎患 者临床用药，改善其功能提供依据。 方法:实验于2003一05/2004一02在的第一军医大学细胞生物实验室 完成。类风湿性关节炎及正常滑膜组织，分别来源于第一军医大学南方 医院脊柱骨病科和汕头市第二人民医院外二科因类风湿性关节炎而行 全膝关节置换术或经关节镜滑膜切除术的患者和无关节炎病史的创伤 性截肢患者，用原酶消化法获得成纤维样滑膜细胞。用第2一4代细胞 在接种12h后分别加人上述药物处理24 h，在第5和第10天分别用四 甲基偶氮哇盐法测定细胞增殖情况并统计分析。 结果:雷公藤、甲氨蝶吟第5天对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑制率分别 0 引言 类风湿性关节炎是一类以进行性滑膜炎症和关节 破坏为特征的疾病。抑制滑膜组织增生及血管聆的形 成是类风湿性关节炎治疗的目的之一。成纤维样滑膜 细胞是滑膜组织及血管黯主要构成的细胞，针对其过 度增殖的内在机制及药物的干预影响的研究较少。目 前类风湿性关节炎的治疗常用有 4类药物，即叫噪美 辛、雷公藤多贰、甲氨蝶吟、地塞米松。本实验旨在观 察、比较上述 4种药物对于类风湿性关节炎成纤维样 滑膜细胞体外增殖的影响。 1 和方法 :以细胞为对象，分组对照的观察。 单位:解放军第一军医大学细胞生物实验室。 材料 :实验于 2003一05/2004一02在第一军医 大学细胞生物实验室完成。实验组为类风湿性关节 炎滑膜组织标本 6个，取材于在第一军医大学南方 医院脊柱骨病科和汕头市第二人民医院外二科 6例 因类风湿性关节炎而行全膝关节置换术或经关节镜 滑膜切除术的患者(均知情同意)，男:女 二2: 4，平均 年龄 (28.67土8.29)岁，术前诊断符合《类风湿关节 炎诊治指南》“’，术后病理诊断证实滑膜组织炎 症。对照组为正常滑膜组织标本 3个，取 自3例无关 节炎病史的外伤性截肢患者 (均知情同意)，男:女 = 2: 1，平均年龄(26.3315.51)岁，排除手术后病理 诊断有滑膜组织炎症者。实验试剂及仪器 :叫噪美辛 (Sigma)用二甲基亚矾 (Sigma)溶解备用;地塞米松 (天津天药药业公司)、甲氨蝶吟 (上海衡山药业有限 公司)、雷公藤多贰 (株州制药三厂)均为市售产 品。雷公藤多贰溶于蒸馏水后，0 45 }L孔径滤膜过滤 备用;RPMI 1640 (Gibco )、四甲基偶氮哇盐 (Sigma) , 酶联仪(BIO-RAD Model 550，日本)。 设计、实施、评估者:实验设计和实施干预为第一 作者，资料收集为第二作者，评估为第三作者。 干预措施:成纤维样滑膜细胞分离及培养:手术中 所获得的滑膜组织，在无菌条件丫移入培养皿中。用 D-Hanks洗涤3次，仔细剔除脂肪组织后获得白色滑 膜组织。按文献提供方法‘2刃，获得成纤维样滑膜细胞加 1671一5926 CN 21一1470/R kj23385083C@ 曾润铭，等.四种常用抗类风湿性药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影晌ISSNwww .类风湿性关节炎 口正常滑膜细胞 ? ， ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ?????? ? ?? ? 地塞 叫噪 甲氨 米松 美辛 蝶吟 雷公藤 对照 a:第5天 .类风湿性关节炎 口正常滑膜细胞 ? ? ?????? ? ?? ? 人含 100 mL/L胎牛血清的 RPMI 1640培养液中，置 37℃，体积分数为0.05的C02培养箱中培养。实验用 第 2一4代细胞。 药物对成纤维样滑膜细胞增殖的影响:取处于对 数生长期的成纤维样滑膜细胞，用含有2. 5 mL/L胰蛋 白霉 0. 2 mL/L乙二胺四乙酸二钠消化后使细胞游离 状态，反复吹打使成单细胞悬液，用锥虫蓝拒染法检测 细胞活力 > 95%，各组细胞分别稀释至 5x106L一’。细 胞悬液接种在%孔培养板中，每孔加人200 N1,L，重复 3次。12 h后换液并分别在培养液中加人药物，其最终 浓度分别为甲氨蝶吟(1 mg/L)、地塞米松((1 mg/L), 叫噪美辛(10 mg/L)或雷公藤多贰(10 mg/L)。同时设 立不加药物的阴性对照及不加细胞空白对照。于24 h 后吸弃培养液，换液时不加药物干预，换液 3d/次。 按文献提供方法 〔31，分别于第 5天和第 10天取一组 培养板用四甲基偶氮哩盐比色法测定各组的A值均 值，记录并计算各药物对成纤维样滑膜细胞的抑制 率 (抑制率 =1一实验组 A值均值/对照组 A值均值 x 100%)。 主要观察指标:①不同药物对成纤维样滑膜细胞 体外增殖的影响。②药物对成纤维样滑膜细胞增殖的 时间依赖性。 统计学分析:由第二作者应用SPSS 11. 5进行统 计处理。数据均以x1:表示。两组间比较用 t检验，多 重比较用析因设计方差分析。 2 结果 2.1 不同药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响 在未施加干预因素条件下，类风湿性关节炎成纤维样 滑膜细胞的增殖速度快于正常成纤维样滑膜细胞。在 施予干预因素后的第 5天雷公藤多贰对成纤维样滑膜 细胞的增殖的抑制作用最明显 (P<005)，甲氨蝶吟 对成纤维样滑膜细胞的增殖有抑制作用。雷公藤多贰 和甲氨蝶吟对类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞 的抑制作用 比正常成纤维样滑膜细胞的抑制作用明 显(P<005)。而地塞米松和叫噪美辛对成纤维样滑 膜细胞的增殖没有明显抑制作用。见图 10 2.2 药物对成纤维样滑膜细胞增殖的时间依赖性 比 较5d和 10d不同药物的抑制率，发现雷公藤多贰在 第 5天的抑制率最强。虽然甲氨蝶吟对成纤维样滑膜 细胞的抑制作用在处理后初期的抑制作用比雷公藤 多贰弱，但在体外对成纤维样滑膜细胞有效时间长。 而雷公藤多贰处理组在 5d和 10d抑制率差异无显著 性意义，显示有明显药物的时间依赖性。见表 to its p31肇 flK*fh X * q雷公藤对照 b:第10天 图1 不同药物对成纤维样滑膜细胞体外增殖的影响 表 1 各种药物在不同时间对成纤维样滑膜组织增殖抑制率的影响 (x士s，%)? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?类风湿性关节炎成纤维 样滑膜组织标本(n二6) 第5天 第10天 第5天 第10天 ? ? ??? ?、 ? ? ? ?? ? ? ?， ?? ?? ?? ?? ??????? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 与同一药物处理组第5天比较，"t=7.881, P <0.01; 0t=4.009 <0.05 一4.29土1. 一7.09士6. 33.90士2 42. 68 t 2 0t二3.873 3 讨论 在类风湿性关节炎中，滑膜组织过度增生及血管 翁组织直接侵蚀关节软骨及破坏关节周围的骨组织。 成纤维样滑膜细胞是滑膜组织的主要组成成分，其来 源于间质细胞。虽然在体内成纤维样滑膜细胞与血管 翁细胞有一定的区别『41，但在体外分离和培养后，滑膜 各层的成纤维样滑膜细胞和血管黔细胞几乎没有区 别。成纤维样滑膜细胞除了参与滑膜组织对关节软骨 破坏及关节周围的骨组织破坏之外，还分泌多种细胞 因子间接对骨与软骨的损害〔2，5]。在体外，类风湿性关 节炎的成纤维样滑膜细胞所具有分泌上述细胞因子的 功能能够维持数代。所以，抑制成纤维样滑膜细胞增 殖是治疗类风湿性关节炎的手段之一[[61。但目前对于 类风湿性关节炎滑膜细胞体外增殖活性以及各类药物 对其抑制效应的比较性研究还较少。 对于类风湿性关节炎与正常的滑膜细胞的体外增 殖活性研究，从现有的文献的结果还存在有争议性。 Mohr等 「7’认为类风湿性关节炎的滑膜细胞的体外增 殖速度比其他炎性关节炎或正常关节的成纤维样滑膜 细胞增殖速度快 ;而 Lories等 [“」用细针活检所获得的 滑膜组织中对成纤维样滑膜细胞倍增时间的研究结果 认为，各类炎性关节炎的体外增殖速度没有明显不 同。本实验结果表明类风湿性关节炎比正常的成纤维 样滑膜细胞在体外 2一4代增殖速度快。虽然这种增殖 活性的增加尚不能足以完全解释类风湿性关节炎滑膜 组织增生、充血、水肿的临床表现，但减缓其增殖活性 可能可以抵消部分由于炎性因子对关节炎症特别是类 风湿性关节炎的滑膜组织增生所带来的影响。 从本研究结果看，地塞米松和叫噪美辛处理对成 纤维样滑膜细胞增殖活性没有明显抑制作用，地塞米 松和叫噪美辛其作用类风湿性关节炎与正常的成纤维 样滑膜细胞比较没有明显区别。因此，经过地塞米松 ISSN 1671 -5926 CN 21 - 1470/R www. zglckf com 中国临床康复 2005年，月14日 第9卷 第18期 或pail噪美辛治疗类风湿性关节炎滑膜组织过度增生 可能没有直接受到抑制，成纤维样滑膜细胞分泌某些 炎性因子可能同样没有受到抑制。所以，尽管非类固 醇类抗炎药和糖皮质激素类能缓解类风湿性关节炎 症状，但关节破坏还是出现或加重，而改善抗类风湿 性病情的药物能潜在地减少或预防关节损害。 甲氨蝶吟和雷公藤多贰对于成纤维样滑膜细胞增 殖活性抑制明显 ，短期的药物处理能维持较长的时 间。雷公藤多贰处理组在初期对于成纤维样滑膜细胞 的抑制效应明显强于甲氨蝶吟，但在后期持续抑制效 应弱于甲氨蝶吟，有明显的时间依赖性。甲氨蝶吟作 为对类风湿性关节炎联合治疗的基本药物，是一类改 善的抗类风湿性病情的慢作用药，但对于改善和延缓 病情进展的作用维持有效时间长。对成纤维样滑膜细 胞增殖活性抑制明显。经过甲氨蝶吟治疗患者的成纤 维样滑膜细胞体外培养，，其细胞倍增时间长于未经甲 氨蝶吟治疗患者的成纤维样滑膜细胞，这种抑制作用 在体外也能维持较长时间‘“’。甲氨蝶吟和雷公藤多贰 对于类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖活性 抑制比正常的成纤维样滑膜细胞明显。这可以解释在 临床上使用雷公藤多贰治疗比甲氨蝶吟治疗后局部 症状的缓解快的原因。尽管 目前有雷公藤多贰缓释片 应用于临床 『91，雷公藤多贰还是通常以小剂量维持治 疗，而甲氨蝶吟被推荐每周 1次给药。由于成纤维样滑 膜细胞对于甲氨蝶吟的药物作用的时间依赖性较弱， 如果从抑制成纤维样滑膜细胞过度增殖的角度考虑， 适当延长甲氨蝶吟用药间隔时间对于抑制滑膜组织 过度增生及血管翁的形成的效果可能相似。这样可能 将减少抗类风湿药物治疗所带来的不良反应。雷公藤 多贰能抑制类风湿性关节炎的成纤维样滑膜细胞增殖 活性 ，可能也是一种潜在地减少或预防关节损害药 物。这一点还需要进一步临床研究验证。 本实验主要不足之处在于样本量少，这对于实验 结果是否产生偏倚需要增加病例数量来加以验证。 雷公藤多贰、甲氨蝶吟对类风湿性关节炎的成纤 维样滑膜细胞增殖有明显抑制作用，地塞米松及oil噪 美辛对成纤维样滑膜细胞增殖则无明显抑制作用。雷 公藤多贰比甲氨蝶吟对成纤维样滑膜细胞体外增殖抑 制作用有更明显的时间依赖性。 致谢:感谢南方医院脊柱骨病科金大地教授对本实验的指导和支 持。 4 参考文献 1 中华医学会风湿病学分会，类风湿关节炎诊治指南(草案)1.11中华风湿病 学杂志，2003,7 (4):250一54 2 Takayanagi H, Iizuka H, Juji T, et al. 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