微生物遗传

第八章 微生物遗传 第八章 微生物遗传 遗传型：是指生物所携带的全部遗传因子及基因，是遗传的物质基础； 表型（表现型）：具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。 表型饰变：同样遗传型的生物，在不同的外界条件下，会呈现不同的表型，但这种表型的差异只与环境有关，表现为暂时性和不可遗传性，并且表现为全部个体的行为！ 遗传型变异（基因变异、基因突变）：由于环境因素等的影响，导致遗传物质改变，导致生物特性改变，与表型的饰变相比，这种变异是可以遗传的，而由于遗传物质的变异的频率一般很低，所以这种变异也常常表现为群体中极少数个体的行为（突变频率通常10-6-10-9）。 第一节 遗传的物质基础 一、三个经典实验 证明核酸是遗传物质的三个经典试验 1、经典转化实验 1928年F. Griffith利用肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）为实验材料，证明只有DNA被酶降解破坏的抽提物无转化活性，提出DNA是转化所必需的转化因子。 Avery在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验。 2、T2噬菌体感染实验 1952年A D Hershey和M Chase发表了证明DNA是噬菌体的遗传物质基础。 3、植物病毒的重建实验 1956年H Fraenkel-Conrat证明在RNA病毒中，遗传的物质基础也是核酸。 第二节 微生物的基因组结构 一、概念 基因组（genome）：一个物种的单倍体所有染色体及其所包含的遗传信息的总称。 原核生物（如细菌），多为单倍体（在一般情况下只有一条染色体） 真核微生物，多条染色体，例如啤酒酵母有16条染色体。有时为双倍体。 微生物基因组测序工作是在人类基因组的促进下开始的，最开始是作为模式生物，后来不断发展，已成为研究微生物学的最有力的手段。 截止到2001年4月：43种微生物完成了全基因组测序；100多个正在进行之中； http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.htmlp://www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html 美国基因组研究所(The Institute for Genomic Research，简称TIGR) 二、微生物与人类基因组计划 被选择进行全基因组测序的微生物： 1、人类基因组计划中的模式生物 a）从技术上从低等入手，建立技术、积累经验。通过对基因组结构相对简单生物，特别是微生物基因组的测序，对大规模测序的策略及技术进行检验，积累经验。 b）理论上利用基因组在进化上的连续性进行比较研究 通过对不同进化程度的基因组的、比较揭示更多的基本生物学信息。通过研究较为简单的基因组而解答复杂的人类基因组问， 2、与人类生活关系密切的微生物 重要的致病菌及一些工业生产菌 3、对阐明生物学基本问题有价值的微生物 例如一些古生菌：如Methanococcus jannaschii (詹氏甲烷球菌)等，它们是微生物世界多样性的代表，它们的序列比较有助于找出其进化关系。 三、微生物基因组结构的特点： 1、原核生物（细菌、古生菌）的基因组 1）双链环状的DNA分子（单倍体）。 链环状的染色体在细胞中以紧密缠绕成的较致密的不规则小体形式存在于细胞中，该小体称为拟核(nucliod)，其上结合有类组蛋白和少量RNA分子，使其压缩成一种手脚架形的致密结构。 2）基因组上遗传信息具有连续性 大肠杆菌和其它原核生物中基因数基本接近由它的基因组大小所估计的基因数；一般不含内含子，遗传信息是连续的而不是中断的。 3）功能相关的结构基因组成操纵子结构操纵子（operon） 功能相关的几个基因前后相连，再加上一个共同的调节基因和一组共同的控制位点（启动子、操作子等）在基因转录时协同动作。 4）结构基因的单拷贝及rRNA基因的多拷贝； 5）基因组的重复序列少而短； 2、真核微生物（啤酒酵母）的基因组 1）典型的染色体结构 该基因大小为13.5×106bp，分布在16条染色体中。象所有其它的真核细胞一样，酵母菌的DNA也是与四种主要的组蛋白(H2A、H2B、H3和H4)结合构成染色质(chromatin)的14bp核小体核心DNA； 染色体DNA上有着丝粒(centromere)和端粒(telomere)， 2）没有明显的操纵子结构 3）有间隔区（即非编码区）和内含子序列。 而原核生物中非编码区或内含子均非常少，而人类基因组测序后发现了大量的非编码区，被称为基因组上的荒漠，估计只有5-10%用于编码基因。 4）重复序列多 3、詹氏甲烷球菌的基因组 古生菌的基因组在结构上类似于细菌。但是信息传递系统(复制、转录和翻译)则与细菌不同而类似于真核生物。 1）一般而言，古生菌的基因组在结构上类似细菌，功能相似的基因组成操纵子；rRNA和tRNA 有重复；基本上无内含子； 2）负责信息传递的功能基因（复制、转录和翻译）类似于真核生物，特别是古生菌的转录起始系统基本上于真核生物类似。 3）古生菌的RNA聚合酶在亚基组成和亚基序列上也类似于真核生物的RNA聚合酶II和III. 4）启动子结构位于转录起始位点的25~30核苷酸处,于真细菌的-10~-35区不同. 5）翻译延伸，氨酰-tRNA合成酶基因，复制起始因子等均于真核生物相同。 第三节 质粒和转座因子 质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子， 主要存在于各种微生物细胞中。 转座因子（transposable element）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。 质粒和转座因子是细胞中除染色体以外的另外二类遗传因子 一、质粒的分子结构 1、结构 通常以共价闭合环状(covalently closed circle，简称CCC)的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒； 质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb（细菌质粒多在10kb以内）； 2、质粒的检测： a）提取所有胞内DNA后电镜观察； b）根据质粒的分子大小和结构特征，通过超速离心或琼脂糖凝胶电泳可将质粒与染色体DNA分开 c）对于常用菌，可用质粒所带的某些特点，如抗药性初步判断。（一般将菌点在相应的抗性平板上，若抗性还在，证明质粒可能还在，否则可能质粒已经丢失，在实验中经常采用这种方法对含质粒的菌株进行初步检测） 对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象（提取质粒时造成或自然存在），可以进行特异性单酶切，使其成为一条带。 二、质粒的主要类型 质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的。 在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。 致育因子（Fertility factor，F因子） 质粒所编码 抗性因子（Resistance factor，R因子） 的功能和赋 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 予宿主的表 毒性质粒（virulence plasmid） 型效应 代谢质粒（Metabolic plasmid） 隐秘质粒（cryptic plasmid） 1、致育因子(Fertility factor，F因子) F因子能以游离状态(F+)和以与染色体相结合的状态(Hfr)存在于细胞中，所以又称之为附加体(episome)。 2、抗性因子（Resistance factor，R因子） 抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。 R100质粒(89kb)可使宿主对下列药物及重金属具有抗性： 汞（mercuric ion ，mer）；四环素（tetracycline，tet ）；链霉素(Streptomycin, Str)；磺胺(Sulfonamide, Su)、氯霉素(Chlorampenicol, Cm)、夫西地酸（fusidic acid，fus）并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）  细菌素 抗生素 抑制或杀死近缘，甚至同种不同株的细菌 较广的抗菌谱 通过核糖体直接合成的多肽类物质 一般是次级代谢产物 编码细菌素的结构基因及相关的基因一般位于质粒或转座子上 一般无直接的结构基因，相关酶的基因多在染色体上 很多细菌能产生能抑制或杀死近缘、甚至同种不同株的细菌的因子（细菌蛋白），被称为细菌素，以和抗生素相区别。抗生素一般具有较广的抗菌谱。此外，抗生素一般是微生物的次级代谢产物（通过代谢过程而产生），而细菌素一般是直接通过核糖体直接合成的多肽类物质。编码细菌素的结构基因及涉及细菌素运输及发挥作用（processing）的蛋白质、及赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因一般都位于质粒或转座子上，因此，细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。细菌素一般根据产生菌的种类进行命名，例如大肠杆菌（E. coli）产生的细菌素为colicins（大肠杆菌素），而质粒被称为Col质粒。而枯草芽孢杆菌（B. subtilis）产生的细菌素被命名为subtilisin（枯草杆菌素）。等等。 细菌素首先发现于大肠杆菌中，有多种col质粒和产生多种colicins，其发挥作用的原理各不相同。例如，有的colicins从产生菌中释放后，结合到敏感菌细胞膜特定的受体上，而该受体一般是负责一些重要物质，如一些生长因子的运输的；而另外，有些colicins则阻止一些重要的细胞功能的进行。还有一些colicins则在细胞膜上形成通道，造成钾离子和质子的外泄，使细胞失去能化膜而不能产生能量。Colicin E2是一种DNA内切酶，能切断细胞DNA，而colicin E3是一种核酸酶，能在16SrRNA的特定位点进行切割从而使核糖体失活。 由G+细菌产生的细菌素或与细菌素类似的因子与colicins有所不同，但通常也是由质粒基因编码，有些甚至有商业价值，例如一种乳酸细菌产生的细菌素NisinA能强烈抑制某些G+细菌的生长，而被用于食品工业的保藏。 4、毒性质粒（virulence plasmid） 许多致病菌的致病性是由其所携带的质粒引起的，这些质粒具有编码毒素的基因，其产物对宿主（动物、植物）造成伤害。 产毒素大肠杆菌是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有为一种或多种肠毒素编码的质粒。 苏云金杆菌含有编码δ内毒素(伴孢晶体中)的质粒 根癌土壤杆菌所含Ti质粒是引起双子叶植物冠瘿瘤的致病因子 5、代谢质粒（Metabolic plasmid） 质粒上携带有有利于微生物生存的基因，如能降解某些基质的酶，进行共生固氮，或产生抗生素（某些放线菌）等。 降解质粒：将复杂的有机化合物降解成能被其作为碳源和能源利用的简单形式，环境保护方面具有重要的意义。 6、隐秘质粒（cryptic plasmid） 隐秘质粒不显示任何表型效应，它们的存在只有通过物理的方法，例如用凝胶电泳检测细胞抽提液等方法才能发现。 三、质粒的不亲和性 细胞内含有一种或多种稳定遗传的质粒，则认为这些质粒是亲和的。 将外源质粒导入到某一含有另一质粒的宿主细胞，几经传代后，大多数细胞中只含有一种质粒，那末，这两个质粒便是不亲和的。即它们不能同时存在于同一个细胞中。 能在同一细胞中存在的质粒属于不同的不亲合群，而在细胞中不能存在的质粒属于同一个亲合群。 四、转座因子的类型和分子结构 1、转座因子 广泛分布于原核和真核生物中，原核生物中转座因子有三种类型： 插入序列（IS），转座子（Tn），某些特殊病毒(Mu) IS最简单的转座因子。只含有编码转位所需的转座酶基因。分布在染色体、质粒和噬菌体上。 Tn比IS大，主要差别是Tn还含有宿主细胞的抗生素和某些毒素等抗性基因，如Tn5. Tn3。 Mu噬菌体是以E. coli为宿主的温和噬菌体，以裂解生长和溶原生长交替繁衍。基因组上除含有为噬菌体生长所必需的基因外，还含有转座必需的基因，因此是最大的转座因子。 2、转座的遗传学效应 1、插入突变 当转座因子插入某一基因中后，此基因的功能丧失，发生突变。 2、产生染色体畸变 转座是转座子一个拷贝的插入，处在同一染色体上不同位置的两个拷贝之间可能发生同源性重组，导致DNA的缺失或倒位，即染色体畸变。 3、基因的移动和重排 由于转座作用，使原来在染色体上相距很远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或表达单元，可能产生新的基因，在生物进化上具有意义。 第四节 基因突变及修复 基因突变：一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变。 DNA损伤修复机制 基因突变 前突可以通过DNA复制而成为真正的突变，也可以重新变为原来的结构，这取决于修复作用和其它多种因素。 基因突变是重要的生物学现象，它是一切生物变化的根源，连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。 自发突变 环境因素的影响，DNA复制过程的偶然错误等而导致，一般频率较低，通 突变 常为10-6-10-9 。 诱变 某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用，突变以较高的频率产生。 一、基因突变的类型及其分离 1、碱基变化与遗传信息的改变 同义突变、错义突变、无意突变、移码突变 2、表型变化 营养缺陷型、抗药性突变型、条件致使突变型、形态突变型 二、常见的微生物突变类型 1）营养缺陷型（auxotroph）：一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型，只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物（precursor）才能生长。 表型判断的：在基本培养基上能否生长。常用影印平板（Replica plating）法进行筛选。 营养缺陷型的表示方法： 基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：hisC （组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变） 表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：HisC 在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。 2）抗药性突变型（resistant mutant） 特点： 正选择标记：（突变株可直接从抗性平板上获得-----在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。） 表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性。 3）条件致死突变型（conditional lethal mutant 在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下没有致死效应的突变型。 常用的条件致死突变是温度敏感突变，用ts（temperaturesensitive）表示，这类突变在高温下（如42℃）是致死的，但可以在低温（如25-30℃）下得到这种突变。 三、基因突变的特点 1、特点1）非对应性；2）稀有性；3）规律性；4）独立性；5）遗传和回复性；6）可诱变性。 2、自发突变的分子基础 碱基互变异构体的存在。 3、实验证据 如何证明基因突变的非对应性？ 三个经典实验：变量实验、涂布实验、影印实验 证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！ 四、诱变剂与致癌物质——Ames试验 1、原理： 诱变剂的共性原则，即化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比：超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用；而90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。 2、应用：利用细菌突变来检测环境中存在的致癌物质是一种简便、快速、灵敏的方法。可以通过某待测物质对微生物的诱变能力间接判断其致癌能力。 3、概念：该方法是由美国加利福尼亚大学的Ames教授首先发明，因此又称Ames试验。 该试验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)的组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变性能来进行的。 由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使Ames试验的准确率达80-90%。 五、DNA 损伤的修复 1、光复活作用：由Phr基因编码的光解酶Phr进行。Phr在黑暗条件下专一性地识别嘧啶二聚体，并与之结合，形成DNA-酶复合物，在光照下，将二聚体解开。 2、切除修复：有成暗修复。该修复系统除了碱基错误配对和单核苷酸插入不能修复，几乎其他DNA损伤均可修复，使细胞内的主要修复系统。 3、重组修复：这是一种越过损伤而进行的修复。修复不将损伤部位出去，而是随着DNA复制逐渐稀释。 4、S0S修复：在DNA分子受到大面积损伤时而又到产生的一种应急反应。 第五节 细菌基因转移和重组 细菌的四种水平基因转移形式 接合 (conjugation)：细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导(transduction)：由噬菌体介导 自然遗传转化(natural genetic transformation)：游离DNA分子 + 感受态细胞 原生质体融合 (protoplast fussion)：原生质体+原生质体 一、细菌的接合作用(conjugation) 通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。 2. 机制 接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导；F因子的分子量通常为5×107，上面有编码细菌产生性菌毛（sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。 含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛；不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛。 F因子为附加体质粒 既可以脱离染色体在细胞内独立存在，也可插入（整合）到染色体上 F因子的四种细胞形式 (参见P202) a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）； b）F+菌株， F因子独立存在，细胞表面有性菌毛。 c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。 d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。 细胞表面同样有性菌毛。 1） F+×F-杂交 F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。 杂交的结果：给体细胞和受体细胞均成为F+细胞 理化因子的处理可将F因子消除而使F+菌株变成F-菌株 2）Hfr ×F-杂交 Hfr菌株的F因子插入到染色体DNA上，因此只要发生接合转移过程，就可以把部分甚至全部细菌染色体传递给F-细胞并发生重组，由此而得名为高频重组菌株。 Hfr菌株仍然保持着F+细胞的特征，具有F性菌毛，并象F+一样与F-细胞进行接合。所不同的是，当OriT序列被缺刻螺旋酶识别而产生缺口后，F因子的先导区(leading region)结合着染色体DNA向受体细胞转移，F因子除先导区以外，其余绝大部分是处于转移染色体的末端，由于转移过程常被中断，因此F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞(或接合子)大多数仍然是F-。 染色体上越靠近F因子的先导区的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的的时间就越早，频率也高。 F因子不易转入受体细胞中，故Hfr×F-杂交后的受体细胞（或称接合子）大多数仍然是F-。 3）F′×F-杂交 Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时， 形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子， 特称为F′因子。 细胞基因的这种转移过程又常称为性导（sexduction）、F因子转导（F-duction），或F因子媒介的转导（F-mediated transduction）。 F′×F-与F+×F-的不同：给体的部分染色体基因随F′一起转入受体细胞 a）与染色体发生重组；b）继续存在于F′因子上，形成一种部分二倍体； 二、细菌的转导（transduction） 由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式：一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中。能将一个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体。 细菌转导的二种类型：普遍性转导和局限性转导 1、普遍性转导（generalized transduction）：噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程。 噬菌体的DNA包装酶也能识别染色体DNA上类似pac的位点并进行切割，以“headful”的包装机制包装进P22噬菌体外壳，形成只含宿主DNA的转导噬菌体颗粒（假噬菌体）。因为染色体上的pac与P22 DNA的pac序列不完全相同，利用效率较低，这种“错装”机率一般仅约10-6-10-8 普遍性转导的基本要求： 形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主DNA的包装机制并在宿主基因组完全降解以前进行包装。 普遍性转导中外源DNA的三种后果 1)进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子. 2) 如果转导DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达，就成为流产转导（abortive transduction），其特点是在选择培养基平板上形成微小菌落。DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。 3）被降解, 转导失败，在选择平板上无菌落形成。 2.局限性转导(specialized transduction)  温和噬菌体感染受体菌后，其染色体会整合到细菌染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，如果该溶源菌因诱导而发生裂解时，在前噬菌体两侧的少数宿主基因，（对λ噬菌体分别是gal和bio基因），会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，由此产生了一类特殊的噬菌体----缺陷噬菌体，缺陷噬菌体除含大部分自身的DNA外，缺失的基因被几个位于前噬菌体整合位点附近的宿主基因取代，这样形成的杂合DNA分子在宿主细胞内能够象正常的λDNA分子一样进行复制、包装，提供所需要的裂解功能，形成转导颗粒。 该缺陷噬菌体没有正常噬菌体的溶源性和增殖能力，感染受体细胞后，通过DNA整合进宿主染色体而形成稳定的转导子。 局限性转导与普遍性转导的主要区别： 1）被转导的基因共价地与噬菌体DNA连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而完全转导包装的可能全部是宿主菌的基因； 2）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。 溶源转变（lysogenic conversion）：一个与转导相似又不同的现象。 温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。 溶源转变与转导的不同： ①温和噬菌体不携带任何供体菌的基因，当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶源转变而获得的形状也同时消失。 ②这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的。 三、细菌的遗传转化（genetic transformation） 定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。 感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞。包括：自然遗传转化（natural genetic transformation） 和人工转化（artificial transformation）。 自然感受态的出现是细胞一定生长阶段的生理特性，受细菌自身的基因控制； 人工感受态则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内。（该过程与细菌自身的遗传控制无关！） 1、自然遗传转化（简称自然转化） 自然转化过程的特点： a）对核酸酶敏感；b）不需要活的DNA给体细胞；c）转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（DNA），给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d）通常情况下质粒的自然转化效率要低得多； 枯草芽孢杆菌的自然转化模型： a）当枯草芽孢杆菌在葡萄糖基本培养基中培养到对数生长末期到稳定期，细胞向胞外分泌一种小分子的蛋白质，称为感受态因子，其分子量为5000到10000道尔顿。 b）当培养液中的感受态因子积累到一定浓度后，与细胞表面受体相互作用，通过一系列信号传递系统诱导一些感受态一特异蛋白质(competence specific protein)表达，其中一种是自溶素(autolysin)，它的表达使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。 c）DNA以双链形式在细胞表面的几个位点上结合并遭到核酸酶的切割，核酸内切酶首先切断DNA双链中的一条链，被切断的链遭到核酸酶降解，成为寡核苷酸释放到培养基中，另一条链与感受态一特异蛋白质结合，并被引导进入细胞， d）进入细胞的外源DNA通过同源重组以置换的方式整合进受体染色体DNA，经复制和细胞分裂后形成重组体。 枯草芽孢杆菌的自然转化的特点： 1）枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌细胞对双链DNA的吸附和摄取是没有特异性的，转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系，关系越近，则DNA之间的同源性也越高，就越容易在DNA之间发生重组，产生转化子。 2）自然感受态除了对线型染色体DNA分子的摄取外，也能摄取质粒DNA，但在通常情况下质粒的自然转化效率要低得多，这是因为质粒作为细菌染色体外独立存在的遗传物质和染色体DNA同源性很差（否则会因为和染色体DNA之间的重组而不稳定），这样被切割成单链后进入细胞的质粒DNA将很难通过重组重新恢复成有活性的状态（双链闭合环状），或通过整合进染色体而使相关性状得到表达；如要提高质粒的自然转化效率，可以用二种方法：i）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；ii）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌-------重组获救。 3）噬菌体DNA也可被感受态细胞摄取并产生有活性的病毒颗粒，这个过程被称为转染(transfection)，其特点是提纯的噬菌体DNA以转化的（而非病毒感染）途径进入细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。 现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染。 2、人工转化 在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。 不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。 用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。 质粒的转化效率高； 四、原生质体融合 1、原生质体的制备 不同微生物使用相应的酶处理：溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶 保持原生质体的完整性需要在高渗溶液中。 2、原生质体融合和再生 PEG或电场诱导下融合。融合受不同阳离子和浓度的影响，同时pH也有影响。 融合后需要涂布再生培养基。 3、融合子的选择 依靠选择培养基上的遗传标记，如营养缺陷型的互补标记。 体外DNA重组技术---DNA shuffling 该技术可在短的实验循环中定向筛选出特定基因编码的蛋白活性提高几百倍功能性突变株。 原理：将来源不同但功能相同的一组同源基因，用DNA核酸酶I进行消化产生随机小片断,让这些小片段组成一个库，使之互为引物和，进行PCR扩增，当一个基因拷贝片断作为另一个基因拷贝的引物时，引起模板转换，发生重组。导入体内，选择正突变作为新一轮的体外重组。一般通过2~3次循环，可获得产量提高的突变题。 五、基因定位和基因组测序 基因定位：通过遗传重组等手段确定不同的基因在染色体上的位置及相对距离，从而获得遗传图谱。 细菌基因转移的三种方式（接合、转导、转化）都可以用来进行细菌基因组作图。 基因组测序：测定待测生物基因组的所有碱基排列顺序，并在此基础上对遗传信息进行研究和分析。 第六节 真核微生物的遗传学特性 真核微生物具有有性生殖，具有复杂的核，基因组有许多染色体组成并且线性，在基因的分配和分离上具有更复杂的调控机制。 酵母菌的遗传 1、酵母菌的接合型遗传 2、酵母菌的质粒 3、酵母菌的线粒体 丝状真菌的准性生殖 以粗糙咏孢菌(Neurospora crassa)、构曲霉(Aspergillus nidulans)为模式菌株 准性生殖：不经过减数分裂就导致基因重组的生殖过程。包括异核体的形成、二倍体的形成及体细胞交换和单元化。 第七节 微生物育种 1、诱变育种 2、筛选策略 营养缺陷型突变株、抗阻遏和抗反馈突变型、抗性突变、DNA Shuffling技术 第八节 菌种保藏 性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。 主要有如下几个因素会对微生物菌种的稳定性造成影响： 1．变异：即通过变异而失去重要的遗传特性，例如发酵生产能力下降，或研究中所需要的营养缺陷型由于回复突变等而改变。 2．污染：由于微生物在自然界中种类多，分布广，空气、桌面、皮肤表面都有大量的各种微生物存在，因此在进行微生物菌种操作（包括接种、培养等）时非常容易污染，从而造成菌种的丢失。 3．死亡：微生物容易在实验室里用人工配制的各种培养基培养，但如果超过时间不转接菌种，由于疏忽培养条件发生改变，及其它各种以外情况（如冰箱停电）都容易造成菌种的死亡。而且这种损失有时是不可挽回的。 菌种保藏：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱！ 一、菌种的衰退与复壮 菌种衰退的特点：大量群体中的自发突变 菌种的复壮： 1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种。 a）纯种分离； b）通过寄主体进行复壮 2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种维护工作中不断筛选“正变”个体。 二、防止衰退的措施 1）减少传代次数； 2）创造良好的培养条件； 3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查； 4）采用有效的菌种保藏方法。