人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件

CRTER P.O.Box1200,Shenyang 110004 kf23385083@ sina.com www.zglckf.com Conditions for inducing the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells into chondrocytes Abstract AIM:To analyze the isolation, purification and in vitro proliferation and differentiation ofm esenchym alstem cells (M SCs)into chondrocyte and provide evidences forrepairdefectofchondrocytes with M SCs. METHODS:The experim entwas perform ed atthe Departm entofBiochem istry and M olecularBiology,M edicalCollege, Nanchang University from M arch 2005 to April2006. Experim entalm aterials: Bone m arrow aspiration sam ples were obtained sterilely from 8 adulthum an donors aged 28 to 65 years old withoutsevere hem atopietic and genetic diseases. M SCs were isolated and cultured. They allknew the fact, agreed to participate into the trialand signed the inform ed consent. Experim entalm ethods: 3-passage M SCs in logarithm ic growth phase were collected, induced to differentiate into cartilages by low-glucose DM EM m edium containing 2 m g/L insulin,3 m g/L transferring,1 m m ol/L pyroracem ic acid, 100 nm ol/L dexam ethasone and 10 μg/L transform ing growth factor (TGF) β1 in the experim entalgroup. M SCs were cultured in low-glucose DM EM m edium in the controlgroup.Cellappearance was observed underinverted m icroscope.7 and 14 days afterinduction, expression ofcartilage specific Ⅱ collogen was determ ined by sem i-quantitative RT-PCR. Contents ofproteoglycan and m ucopolysaccharides were saffron crocus O-brilliantgreen staining.Celldifferentiation was observed. RESULTS:①m orphologic change ofhum an M SCs with lightm icroscope: Cellcolony was obvious 7 days afterculture. Severalordecades round cells appeared in the center, and surrounding am oeboid cells showed radiated shape around centralcells. 14-day cultured cells were parallelor vortex shape, arranged closely. ②differentiation ofM SCs into chondrocyte: Cells grew slowly in the experim entalgroup as com pared with the controlgroup, and showed ovalor triangle; antennallike process stretched outin partialcells. Cells deform ed obviously and arranged closely with m any connected processes,showing significantchondrocyte characteristic 14 days afterculture.③Saffron crocus O staining in M SCs: M SCs were dark in saffron crocus O-brilliantgreen staining in the experim entalgroup. M SCs were negative stained in the controlgroup. ④m RNA expression oftype Ⅱ collagen COL2A1 by RT-PCR: The expression ofcollagen type Ⅱ COL2A1 m RNA ofM SCs was positive in the experim entalgroup and obvious fluorescentstrap appeared in 400- 500 bp strap atdays 7 and 14, and the expression was m ore significantatday 14. The controlgroup cells were negative. CONCLUSION:Hum an M SCs are isolated and cultured successfully by directadherentculture m ethod, and M SCs are differentiated into chondroblasts with m orphologicalbiochem icalfeatures. W an FS, Zhou HH, Liu ZQ, Zhang SR.Conditions forinducing the differentiation ofhum an bone m arrow m esenchym alstem cells into chondrocytes.Zhongguo ZuzhiGongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2007;11(20):3920-3923(China) [www.zglckf.com /zglckf/ejournal/upfiles/07-20/20k-3920(ps).pdf] 摘要 目的:人骨髓间充质干细胞分离、纯化、体外扩增及其向软骨细胞分化的条件,为人骨髓间充质干细胞用于修复损伤的软 骨组织提供依据。 方法:实验于2005-03/2006-04在南昌大学医学院生化与分子生物学教研室完成。实验材料:无菌条件下采集无血液系统疾 病和家族遗传史的28～65岁成人骨髓8份,进行骨髓间充质干细胞分离与培养,骨髓采集经患者及医院同意,并签署知情同意 书。实验方法:取第3代对数生长期骨髓间充质干细胞,实验组使用特定的、内含 2 m g/L胰岛素、3 m g/L转铁蛋白、1 m m ol/L 丙酮酸、100 nm ol/L地塞米松和 10 μg/L转化生长因子 β1的低糖 DM EM培养基诱导人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化, 对照组细胞以低糖DM EM基础培养液培养。倒置显微镜下观察细胞形态,诱导7,14 d采用半定量 RT-PCR方法细胞软 骨特异性Ⅱ型胶原表达,蕃红花O-亮绿染色分析蛋白多糖粘多糖含量,观察细胞分化情况。 结果:①光镜观察成人骨髓间充质干细胞的形态变化:培养 7 d细胞集落明显,集落中央为数个至数十个圆形细胞,周围变形 细胞围绕中央细胞呈放射状生长。培养14 d细胞呈平行状或旋涡状排布,细胞排列紧密。②骨髓间充质干细胞向软骨细胞的 诱导分化:实验组细胞生长较对照组慢,培养 7 d后细胞大多呈椭圆形或三角形,部分细胞伸出似触角突起,培养 14 d细胞变 形较明显,排列较为紧密,细胞突起多见,突起间相连,呈较明显软骨细胞形态特征。③骨髓间充质干细胞的番红花-O染色:实 验组骨髓间充质干细胞蕃红花O-亮绿呈深染色,对照组人骨髓间充质干细胞呈阴性染色。④RT-PCR检测软骨特异性的Ⅱ型 胶原COL2A1 m RNA表达:实验组诱导培养7,14 d人骨髓间充质干细胞有Ⅱ型胶原 COL2A1 m RNA表达,400～500 bp条 带间可见明显的荧光条带,诱导培养14 d时表达更明显。对照组未见Ⅱ型胶原COL2A 1m RNA表达。 结论:采用直接贴壁培养法成功分离和培养出人骨髓间充质干细胞,并将人骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞,该软骨细 胞具有软骨细胞的形态、生化特征。 关键词:人骨髓细胞;间充质干细胞;软骨细胞;诱导分化 万福生,周红辉,刘卓琦,张少容.人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件[J].中国组织研究与临床康复,2007,11(20):3920-3923 [www.zglckf.com /zglckf/ejournal/upfiles/07-20/20k-3920(ps).pdf] 南昌大学,1医学院 生化与分子生物学 教研室,2实验动物 科学部,3第二附属 医院耳鼻喉科,江西 省南昌市 330006 万福生☆,男,1957 年生,江西省临川市 人,汉族,2004年江 西医学院毕业,博 士,教授,主要从事 心肌细胞生物学的 研究。 W anfs01@ 163.com 江西省卫生厅资助 课(2004B03)* 中图分类号:R394.2 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2007)20-03920-04 收稿日期:2006-10-25 修回日期:2007-03-16 (06-50-10-7706/GW·Q) 人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件*☆ 万福生 1,2,周红辉 1,刘卓琦 1,张少容 3 临床医学 1Departm ent of Biochem istry and M olecular Biology, M edical College, 2Departm ent of Laboratory Anim al Science, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 3Departm ent of Otorhinolaryngology, Second Affiliated Hospital, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province,China W an Fu-sheng ☆ , Doctor, Professor, Departm ent of Biochem istry and M olecular Biology, M edical College, Departm ent of Laboratory Anim al Science, Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province,China W anfs01@ 163.com Supported by: the grants from Jiangxi Health Bureau, No. 2004B03* Received:2006-10-25 Accepted:2007-03-16 中国组织工程研究与临床康复 第11卷 第20期 2007-05-20出版 JournalofClinicalRehabilitativeTissueEngineeringResearch M ay 20,2007 Vol.11,No.20 3920 CRTER 沈阳 1200邮政信箱 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com 0 引言 目前临床上多通过自体或异体移植成形 软骨或具有成软骨潜能的组织来治疗关节软 骨缺损,这些组织移植后能生成透明软骨样组 织,但其生物学性能、耐磨性、韧性均欠佳,易 退变。近年随着干细胞研究热的兴起,国内外对 骨髓间充质干细胞诱导分化成软骨细胞报道也 日渐增多,骨髓间充质干细胞的一个重要特点 是造血支持细胞[1-3]。骨髓间充质干细胞在组 织工程、细胞移植和基因治疗等领域的应用前 景十分广阔[4]。但许多研究结果主要来自动物 实验,对人骨髓间充质干细胞的研究较少[5-10]。 有研究显示,人骨髓间充质干细胞也具有多向 分化的潜能,可以分化为骨细胞[11]。 1 材料和方法 设计:对比观察实验。 单位:南昌大学医学院。 材料:实验于2005-03/2006-04在南昌大 学医学院生化与分子生物学教研室完成。肝素 抗凝的成人骨髓8份,来自南昌大学医学院第 一、二附属医院,男5例,女3例,28～65岁,无 血液系统和家族遗传病史,骨髓采集经患者及 医院同意,并签署知情同意书。 设计、实施、评估者:实验设计为第一、二 作者,实施为第一、二、三作者,资料收集为第 二、四作者,评估为第三、四作者,评估采用盲 法,以上人员均经过正规培训。 方法:成人骨髓间充质干细胞的分离、培 养与实验分组:无菌条件下采集无血液系统疾 病和家族遗传史的 28～65岁成人骨髓 8份, 用含体积分数为 0.1FBS的 DMEM培养液 5 倍稀释,400g离心5min,弃上清及脂肪层, 加入5mL含体积分数为0.1FBS的DMEM培 养液,制成细胞悬液。将其接种于间充质干细胞 培养液 (低糖DMEM,含10%FBS,100u/mL 青霉素,100mg/L链霉素)中,置于 37℃、含 体积分数为0.05CO2的孵箱内培养。待细胞 长至铺满瓶底 80%时,用 0.25%的胰蛋白酶 消化传代,以(6～8)×103/cm2密度接种传代培 养。 定向诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞 分化[10]:取第3代对数生长期骨髓间充质干细 胞,实验组细胞加入诱导分化培养液进行培 养。细胞贴壁生长后第三四天开始进入对数生 长期,此时更换培养液为诱导分化培养液,继 续培养。实验分两组:实验组细胞以无血清低 糖DMEM诱导分化培养液培养,每孔加入液 体2mL,内含2mL/L胰岛素、1mmol/L丙酮 酸、100nmol/L地塞米松和10μg/L转化生长 因子 β1;对照组细胞以低糖 DMEM基础培养 液培养,每孔加入液体2mL。细胞在37℃、体 积分数 0.05的 CO2饱和湿度的孵箱内培养, 每三四天换液 1次。每天在倒置显微镜下观 察。分别在诱导后7,14d取出玻片,进行细胞 形态学、组织化学分析及RT-PCR检测。 骨髓间充质干细胞的番红花-O染色方 法[12]:对诱导后 7,14d爬片细胞及对照组细 胞进行蕃红花O-亮绿染色,按文献[12]方法进 行,光镜下观察着色情况。 骨髓间充质干细胞软骨特异性的Ⅱ型胶 原mRNA的表达:借助引物设计软件Primer Premier5.0设计GAPDH的引物为 5’-TCA ACG GCA CAG TCA AGG-3’,5’-AAG GTGGAAGAGTGGGAGT-3’,产物长度 为 718bp;COL2A1引 物 为 5’-CCTGAA ACTCTG CCA CCC T-3’,5’-TGA ACC TGCTATTGCCCTCT-3’,产物长度为 434bp。按TrizolReagent试剂盒使用说明书 提取细胞总 RNA。取总 RNA10μL,75℃变 性 5min后,再加无核酶水 5μL,RNasin 0.5μL,随机引物 2μL,加 5×逆转录缓冲液 5μL,10mmol/LdNTP1.5μL,M-MLV1μL (200U/μL),反应总体积为 25μL,37℃ 60min后再 94℃3min终止逆转录反应。 PCR过程:各取cDNA产物2μL,COL2A1和 GAPDH的正、反义引物各 1μL(10μmol), 2×TaqPCRMasterMix12.5μL,加 ddH2O 6.5μL,总反应体积25μL。反应条件:94℃ 3min;94℃45s,55℃45s,72℃45s,38 个循环;72℃延伸10min。通过GIS-2009全 自动数码凝胶图像分析系统分析各条带的吸 光度,以 GAPDH的表达量为对照计算各组 COL2A1mRNA的相对表达量。 主要观察指标:①光镜下观察细胞形态变 化。②番红花-O染色观察细胞诱导分化情况。 ③软骨特异性的Ⅱ型胶原 COL2A1mRNA的 表达变化。 统计学分析:统计学处理由第二作者应用 课题背景:骨髓 间充质干细胞具 有 贴 壁 生 长 特 性,在体外易分 离和扩增,易于 外源基因的转入 和表达,是一种 理想的治疗性细 胞和基因治疗靶 细胞。但许多研 究结果主要来自 动物实验,对人 骨髓间充质干细 胞研究较少。本 课题为江西省卫 生厅资助课题, 主要是进行成人 骨髓间充质干细 胞的分离、培养 及定向诱导其向 软骨细胞分化的 研究。 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 万福生,等.人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 3921 CRTER P.O.Box1200,Shenyang 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com万福生,等.人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件 SPSS13.0统计软件分析,所有实验数据均用 x±s表示,进行方差分析,以 P<0.05表示差 异有显著性意义。 2 结果 2.1 体外培养成人骨髓间充质干细胞的形态 变化 在光镜下可见,接种后 24h即有少量 圆形细胞贴壁,48h后贴壁细胞增多(图 1a)。 72h后已出现数个细胞集落(图 1b)。经过 2 次换液后,细胞呈成纤维样细胞形态(图 1c)。 培养7d细胞集落更加明显,集落的中央为数 个至数十个圆形的细胞,周围是数个至十数个 变形细胞围绕中央细胞呈放射状生长 (图 1d)。培养21d细胞汇合成片铺满培养瓶底, 呈典型的长梭形(图1e)。培养14d第3代骨 髓间充质干细胞镜下呈平行状或旋涡状排布, 细胞排列紧密(图1f)。 2.2 骨髓间充质干细胞向软骨细胞的诱导分 化 用诱导培养液培养的实验组细胞生长慢 于对照组,培养 7d后实验组细胞大多呈椭圆 形或三角形,可见部分细胞伸出似触角的突起 (图2a)。培养14d实验组骨髓间充质干细胞 变形较明显,细胞呈三角形或多角形,细胞排 列较为紧密,细胞突起较培养 7d的细胞更多 见,突起间相连,呈较明显的软骨细胞形态特 征(图2b)。 2.3 骨髓间充质干细胞的番红花-O染色 取诱导后7,14d爬片细胞及对照组细胞进行 蕃红花O-亮绿染色,结果显示,诱导后 7d骨 髓间充质干细胞淡染,呈弱阳性染色,在细胞 密集处(细胞集落)有较深的着色(图 3),诱导 14d骨髓间充质干细胞深染,呈现明显阳性, 细胞胞质及胞外基质染色较深(图 4),对照组 骨髓间充质干细胞呈阴性染色。 2.4 软骨特异性的Ⅱ型胶原COL2A1mRNA 的表达 结果显示,诱导培养 7,14d细胞 在 400～500bp条带间可见明显的荧光条 带,14d组荧光强于7d组,对照组常规培养 7,14d细胞未见此荧光印记(图5)。表明实验 组表达了Ⅱ型胶原 COL2A1mRNA,且培养 14d的比培养 7d骨髓间充质干细胞有更高 的Ⅱ型胶原COL2A1mRNA表达,而对照组 没有Ⅱ型胶原COL2A1mRNA表达。吸光度 分析可见:诱导培养 7d与 14d组间 COL2A1/GAPDH吸光度积分值之比分别为 0.315±0.014和 0.761±0.04,两者间差异有显 著性意义 (P<0.01);诱导 14d组细胞 COL2A1mRNA表达高于诱导7d组细胞。 相关链接:目前临 床上多通过自体 或异体移植成形 软骨或具有成软 骨潜能的组织来 治疗关节软骨缺 损,但其易退变。 随着软骨组织工 程的发展给软骨 缺损修复带来了 新的希望。获得一 定数量的能满足 治疗需要的种子 细胞是组织工程 的关键。骨髓间充 质干细胞具有多 向分化能力、强大 的增殖能力及连 续传代培养和冷 冻保存而多向分 化潜能不丢失等 重要生物学特征, 使其很有可能成 为软骨组织工程 理想的种子细胞 来源。 应用要点:①用 直接贴壁培养法 成功分离和培养 出骨髓间充质干 细胞。②有关骨 髓间充质干细胞 定向诱导分化研 究,其实验材料 大多数为动物骨 髓 间 充 质 干 细 胞,本实验成功 将人骨髓间充质 干细胞诱导培养 分 化 成 软 骨 细 胞。诱导培养后 形成的软骨细胞 具有软骨细胞形 态特征,并能分 泌软骨细胞的细 胞外基质成分粘 多糖和特异性Ⅱ 型胶原。 3922 CRTER 沈阳 1200邮政信箱 110004 kf23385083@sina.com www.zglckf.com ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 万福生,等.人骨髓间充质干细胞分化为软骨细胞的诱导条件 ISSN1673-8225 CN21-1539/R www.zglckf.com kf23385083@sina.com 3 讨论 骨髓间充质干细胞最初的分离和培养是由 Friedenstein在上世纪 70年代中期建立的。自 Friedenstein之后,人们提出了多种从骨髓中分离骨髓 间充质干细胞的,主要有贴壁法、密度梯度离心 法、免疫磁珠或流式细胞仪分离法[13-15]。3种方法各有 优缺点:贴壁方法虽然分离细胞纯度较低,但简单有 效;密度梯度离心可获较高纯度的细胞,也无需特殊设 备;第3种方法虽然分离细胞的纯度高,应用单克隆抗 体磁珠分离系统或流式细胞仪技术,对骨髓间充质干 细胞的活性影响较大,甚至导致细胞失去活性[14],且需 要特殊的设备和技术。本实验中使用贴壁法将初步离 心的细胞接种培养瓶中,利用骨髓间充质干细胞黏附 生长的特点,通过换液以去除悬浮生长的红细胞和白 细胞,从而获得较纯的骨髓间充质干细胞。 转化生长因子 β1(TGF-β)是一族具有多种功能 的多肽类生长因子,可通过与存在于骨髓间充质干细 胞表面的特异性受体相结合而产生对细胞的诱导分化 作用[16]。转化生长因子是骨髓间充质干细胞向软骨细 胞诱导分化的关键细胞因子之一。在哺乳动物组织中 有 3种存在形式,即 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,均具 有参与胚胎形成和发育、调控间充质细胞分化与增殖、 参与创伤愈合等多种功能[17],并且能显著刺激软骨细 胞的增生、分裂和分化。Wei等[18]证实在兔关节软骨损 伤后局部TGF-β1浓度升高可以促进骨髓间充质干细 胞对关节软骨的修复。在软骨组织损伤修复中,TGF-β 可从周围组织的细胞外基质中获得或由迁移而来的炎 症细胞分泌产生。体外培养骨髓间充质干细胞时, TGF-β1可以诱导其定向分化为软骨细胞,其Ⅱ型胶原 的表达与TGF-β1剂量呈正相关[19]。诱导培养液中胰 岛素和地塞米松能促进细胞有丝分裂,胰岛素、转铁蛋 白为体外培养细胞的成活、有丝分裂、脂肪酸和糖原合 成所必须,地塞米松可抑制骨髓间充质干细胞向脂肪 细胞分化并可与骨髓间充质干细胞的糖皮质激素受体 结合,促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化[20]。 软骨细胞分泌大量的细胞外基质,其中Ⅱ型胶原 占大部分,它和Ⅸ型胶原是软骨细胞的特征性标志[21]。 本实验用RT-PCR分析显示,诱导培养7d和14d的 细胞可见明显的软骨特异性的Ⅱ型胶原 mRNA条带, 14d组明显强于 7d组,而对照组进行常规培养 7d 和14d细胞未见Ⅱ型胶原 mRNA条带,说明实验组 细胞有软骨细胞特征性Ⅱ型胶原 COL2A1mRNA表 达,而对照组无Ⅱ型胶原COL2A1mRNA表达。经蕃 红花-O对骨髓间充质干细胞染色,发现诱导后 7d组 骨髓间充质干细胞呈弱阳性染色,诱导 14d组骨髓间 充质干细胞呈现强阳性染色,对照组骨髓间充质干细 胞呈阴性染色。结果表明诱导培养 7d骨髓骨髓间充 质干细胞分泌少量粘多糖,诱导后 14d组骨髓间充 质干细胞胞内及胞外都可见明显的阳性染色,表明在 细胞内外有较多的粘多糖存在,未经诱导的对照组骨 髓间充质干细胞无粘多糖的分泌。诱导分化后的骨髓 间充质干细胞能够分泌软骨细胞特征性粘多糖和表达 Ⅱ型胶原 COL2A1mRNA,表明在本实验条件下已成 功将骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。 4 参考文献 WangFS,TresterC.Bonemarrowcellsandmyocardialregeneration. 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