酶与辅酶

null第5章 酶与辅酶(enzymes and coenzymes)第5章 酶与辅酶(enzymes and coenzymes) 主要内容：主要讲解酶的化学本质、结构和特性；酶促反应动力学；酶的作用机理；酶活性的调节；酶的应用；还介绍了别构酶、共价调节酶、同工酶等的概念、性质、生物学意义。 null第1节 维生素与辅酶 主要内容： 主要介绍各种维生素的结构、性质和功能，维生素与辅酶的关系。 null（一）维生素的概念（二）分类 维生素脂溶性维生素：A、D、E、K 水溶性维生素：B族（B1、B2、B3、B5、 B6、B7、B11、B12） 和维生素C 一、维生素的概念和类别null二、脂溶性维生素 （一）维生素A族 1、结构 null维生素A原（β-胡罗卜素） null2、性质 3、功能 （1）维持上皮组织的正常结构和功能 （2）维持正常视觉（明视觉和暗视党） null暗视觉的生化基础 ① 暗视觉中的感光物质——视紫红质视紫红质 视蛋白+视黄醛 杆状细胞中含有感光物质——视紫红质 VitA （末端—OH） 醇脱氢酶 视黄醛 （末端—CHO） 弱光null视紫红质中的视黄醛是11-顺视黄醛。 11-cis-Retinalnull② 11-顺视黄醛与视蛋白以schiff base结合 视蛋白Schiff 碱视紫红质null③ 视循环 null（二）维生素D族 1．结构 维生素D和D原都是类固醇化合物，其母核为环戊烷多氢菲。 维生素D的通式 null食物25-羟胆钙化醇 1,25-二羟胆钙化醇 胆钙化醇（维生素D3）肝羟化肾羟化nullnullnull2．功能 （1） 维生素D的主要功能是调节钙、磷代谢，可促使小肠 吸收钙，使血钙浓度增加，也可促使小肠吸收磷，使 血磷浓度升高。 null小肠粘膜细胞null（2）有助于血液凝固 （3）降低神经兴奋的作用 null（三）维生素E族（又称生育酚、育酚） 1．结构 6-羟苯骈二氢吡喃衍生物 null2．性质 维生素E对氧十分敏感，极易被氧化而保护其他物质不被氧化，是动物和人体中最有效的抗氧化剂。 null3．功能 （1）抗不育 （2）保护肌肉 （3）维持红细胞的正常形态和功能 null（四）维生素K族 维生素K族有K1、K2、K3、K4 。 K1、K2是天然存在的。 K3、K4是人工合成的。 null1．结构 nullnull2．功能 促进血液凝固，所以维生素K也称凝血维生素。Vit KnullvitK的作用是促使肝脏合成凝血酶原 另外，其它凝血因子7、9、10的合成也依赖于vitK null尿激酶原 血纤维蛋白溶酶原 降解物 （血栓溶解） 尿激酶血纤维蛋白溶酶血纤维蛋白null脂溶性维生素总结 null三、水溶性维生素和辅酶 （一）B族维生素 1．维生素B1（硫胺素thiamine） （1）结构 null硫胺素+ATP → TPP+AMPnull（2）功能 ① B1的辅酶形式TPP，是丙酮酸脱羧酶和α-酮 戊二酸脱羧酶的辅酶，参与α-酮酸的氧化脱 羧。另外还是转酮酶的辅酶，参与糖代谢。 ② 促进年幼动物的生长发育 ③ 保护神经系统 null2．维生素B2（核黄素riboflavin） （1）结构 null（2）功能 维生素B2是FMN是FAD的组成成分，FMN和FAD是脱氢酶的辅酶。 nullnull（3）性质 ① 氧化型的FMN或FAD是黄色的，还原后成无色。 ② FMN或FAD有强烈的黄绿色荧光，还原后荧光消失。 ③ 紫外吸收氧化态吸收峰为260nm，375nm，450nm，还原后260nm还存在，但375nm，450nm的吸收峰消失。null3．维生素B3（泛酸，遍多酸pantothenic acid） （1）结构 null（2）功能 B3是CoA的组成成分，CoA是生物体内转酰基酶的辅酶（主要作为转乙酰基酶的辅酶），参与转酰基作用。 nullnull4．维生素B5（也称维生素pp、抗癞皮病维生素或 烟酰胺nicotinamide） （1）结构 维生素B5是吡啶的衍生物 吡啶-3-羧酸 nicotinic acid 吡啶-3-酰胺 nicotinamidenull（2）功能 B5是NAD和NADP的组成成分，NAD和NADP是许多脱氢酶的辅酶，参与递氢。nullnullOx型Red型nullOx型Red型NAD+ NADH + H+(NAD) (NADH2)NADP+ NADPH + H+(NADP) (NADPH2)null5．维生素B6（吡哆素） （1）结构 null( PLP )( PMP )null（2）功能 PLP和PMP主要作为氨基酸转氨酶、氨基酸脱羧酶、氨基酸消旋酶的辅酶。 null6．维生素B7（生物素biotin） （1）结构 null（2）功能 B7作为多种羧化酶的辅酶，起CO2载体的作用。 nullnullnull7．维生素B11（叶酸folic acid, FA; 亦称蝶酰谷酸，pteroyl glutamic acid） （1）结构 null（2）功能 叶酸在5、6、7、8位加上四个氢，生成四氢叶酸（Tetrahydrofolate, THFA, THF），四氢叶酸是一碳单位的载体，传递一碳单位。 null8．维生素B12（氰钴胺素cyanocobalamin） （1）结构 B12的咕啉核心null氰钴胺素cyanocobalaminnull（2）功能 主要的辅酶形式是5′—脱氧腺苷钴胺素 另一种辅酶形式是甲基钴胺素 nullB12辅酶的功能 ① 分子内重排 ② 核苷酸还原成脱氧核苷酸（在某些细菌中） null③ 甲基转移 B12还可促使红血球的生成和成熟，缺乏B12得恶性贫血。 nullB族维生素总结null（二）维生素C（抗坏血酸 ascorbic acid） 1．结构 Ascorbic acid ( vitamin C )或null2．性质 null3．功能 （1）参与体内的氧化一还原反应 （2）维生素C是羟化酶的辅酶，参与体内的多种羟化作用。 如促进胶原蛋白和粘多糖的合成 ，维持细胞间质的完 整，促进伤口愈合。缺乏维生素C引起毛细血管出血， 造成坏血病。（3）在某些代谢中起作用 （4）解毒作用 （5）增强机体抗病力 null三、其它的辅酶（一） CoQ(泛醌)n=6~10，微生物n=6，动物组织n=10。结构:功能: 传递氢或电子null（二）硫辛酸 Lipoic Acid硫辛酸（6,8-二硫辛酸）nullnull功能: 在机体代谢中，作为酰基载体。 功能基团是-SH。 null第2节　酶(Enzyme)null　　酶是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的生物分子，大多数酶主要是蛋白质。 　　酶的催化活性依赖于天然的完整蛋白质的构象，如果酶蛋白变性或解离为亚基，其催化活性通常会丧失。二、酶的概念一、酶的发展史null酶enzymes除蛋白质部分外，不需要其它的化学成分的酶，即不需要辅助因子(Cofactor)需要其它的化学成分(Cofactor)的酶Cofactors一种或多种无机离子，如Fe2+, Mn2+等复合有机或金属有机(metalloorganic)分子, 即辅酶(Coenzymes)辅基(prosthetic group): 与酶蛋白共价结合的辅酶或金属离子称为酶的辅基null全酶(Holoenzyme): 具有完整催化活性的酶(酶蛋白＋辅助因子)辅酶主要功能是作为电子或特殊功能团(specified functional groups)的载体(carriers)有一些酶可被磷酸化、糖苷化或其它化合物修饰。这些修饰涉及到这些酶的活性的调节。（二）酶是生物催化剂（二）酶是生物催化剂1．酶与一般催化剂比较 共性 （1）用量少而催化效率高：细胞内含量少； （2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，反应前后本身不发生变化； （3）降低反应所需的活化能 nullnull例 ：2H2O2→2H2O+O2 null2．酶作为生物催化剂的特性 （1）高的催化效率 就分子比(molecular ratio)而言， 以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。 例 ：2H2O2→2H2O+O2 1mol H2O2酶能催化 5×106mol H2O2的分解 1mol Fe3+只能催化6×10-4molH2O2的分解 nullnull 以转换数(turnover number,即每个酶分子每分钟催化底物转变的分子数)表示，大部分酶为1000左右，β-半乳糖苷酶为12500， β-淀粉酶为1100 000，最高的是碳酸酐酶，达36000000。 酶如何有如此惊人的催化能力呢?nullnull（2）高的专一性 （3）温和的反应条件 （4）酶在体内受到严格调控：如酶浓度的调节、激素调节、反馈调节、抑制剂和激活剂的调节、别构调节、酶的共价修饰调节、酶原活化等。 （5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关（三）酶的化学本质 （三）酶的化学本质 1．大多数酶是蛋白质（Most enzymes are proteins） 1926年美国Sumner 脲酶的结晶，并指出酶是蛋白质 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶，并进一步了酶是蛋白质。 null 20世纪80年代发现某些RNA有催化活性，还有一些抗体也有催化活性，甚至有些DNA也有催化活性，使酶是蛋白质的传统概念受到很大冲击。 2．某些RNA有催化活性 1982年美国T. Cech等人发现四膜虫的rRNA前体能在完全没有蛋白质的情况下进行自我加工，发现RNA有催化活性 Thomas Cech, University of Colorado at Boulder, USA null 1983年美国S.Altman等研究RNaseP（由20%蛋白质和80%的RNA组成），发现RNaseP中的RNA可催化E. coli tRNA的前体加工。 Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA nullnullnullnull Cech和Altman各自独立地发现了RNA的催化活性，并命名这一类酶为ribozyme（核酶），2人共同获1989年诺贝尔化学奖。 3．抗体酶（abzyme） 抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋白。 抗体酶：指具有催化功能的抗体分子，在抗体分子的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。 1986年美国Schultz和Lerner两个实验室同时在Science上发表论文，报道他们成功地得到了具有催化活性的抗体。 null4．有些DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等发现有些DNA分子亦具有催化活性。 （四）酶的组成（四）酶的组成1．单纯蛋白质酶类 2．结合蛋白质酶类 全酶=酶蛋白+辅助因子（辅酶、辅基或金属离子） 注意几个概念 辅酶（coenzyme） 辅基（prosthetic group） 单体酶（monomeric enzyme） 寡聚酶（oligomeric enzyme） 多酶复合体（multienzyme complex）三、酶的命名和分类三、酶的命名和分类 1961年国际酶学委员会（enzyme commission）提出的酶的命名和分类方法。 国际系统命名法（1）标明底物，催化反应的性质 例: G-6-P→F-6-P G-6-P异构酶null（2）两个底物参加反应时应同时列出，中间用冒号（:）分开。如其中一个底物为水时，水可略去。 例1： 丙氨酸+α-酮戊二酸 → 谷氨酸+丙酮酸 丙氨酸:α-酮戊二酸氨基转移酶 例2： 脂肪+H2O → 脂酸+甘油 脂肪水解酶null2．习惯名称（recommended name） （1）底物 （2）反应性质 （3）底物，反应性质 （4）来源或其它特点国际系统分类法1．分类: 6大类酶，氧化还原、转移、水解、 裂合、异构、连接 注意顺序不能变！null2．编号: 用4个阿拉伯数字的编号表示，数字中用“·”隔开，前面冠以EC（为Enzyme Commission）。 EC 类.亚类.亚亚类.排号，如EC 1.1.1.1 Enzyme Handbook， Thomas E Barman编，Vol I, Vol II 1969年。 Enzyme Handbook，Thomas E. Barman编 Supplement I, 1974年。 nullnullnullnullnullnull四、酶的分离、纯化及活力测定四、酶的分离、纯化及活力测定（一）酶的分离纯化 1．选材 2．破碎细胞 3．抽提 4．去核酸、去多糖 5．纯化 6．保存 由于酶的特殊性，在提纯过程中要注意 : 1．全部操作在低温0～4℃。 2．在分离提纯过程中，不能剧烈搅拌。 3．在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇。 4．在分离提纯过程中要不断测定酶活力和蛋白质浓度，从而求得比活力，还要计算总活力。 null总活力＝单位体积的酶活力(U/ml)×分离溶液总体积(ml)null（二）酶活力的测定 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 酶活力的测定 1．测定酶活力时应注意几点 （1）应测反应初速度（initial velocity or initial speed） （2）酶的反应速度一般用单位时间内产物的增加量来表示。 （3）测酶活力时应使反应温度、pH、离子强度和底物浓度等因素保持恒定。 （4）测定酶反应速度时，应使[S]>>[E]。 null2．酶活力和比活力表示方式 （1）酶活力（enzyme activity）（2）酶的比活力（specific activity，也称比活性） 比活力：指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白质来表示，比活力说明酶的纯度。 比活力= 酶活力（U/ml）/蛋白质浓度（mg/ml）（3）转换数（TN or kcat)（4）分子活性（molecular activity） （5）催化中心活性（catalytic center activity） null3. 酶活力的测定方法 （1）分光光度法（spectrophotometry） 该法要求酶的底物和产物在紫外或可见光部分光吸收不同。 优点： 简便、迅速、准确。 一个样品可多次测定，有利于动力学研究。 可检测到10-9mol/L水平的变化。null（2）荧光法（fluorometry） 该法要求酶反应的底物或产物有荧光变化。 主要的优点：灵敏度很高，可以检测10-12mol/L的样品。 酶蛋白分子中的Tyr、Trp、Phe残基以及一些辅酶、辅基，如NADH、NADPH、FMN、FAD等都能发出荧光。 （3）酶偶联法(enzyme coupling assay) 第一个酶的产物为第二个酶的底物，这两个酶系统在一起反应。 （4）电化学法（electrochemical method） 五、酶的作用动力学（kinetics）五、酶的作用动力学（kinetics）（一）底物浓度对酶反应速度的影响 1．米氏方程的提出 中间复合物学说： 第二步: ES→E+P V∝[ES] null 1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程 null2．米氏方程的推导 基本前提：反应方程式: 在米氏方程推导中引入3个假设: （2）∵ [S]>>[E] ∴[S] － [ES]≈[S] V∝[ES] 米氏方程的推导米氏方程的推导将（4）代入（3），则：恒态法null3．米氏方程的讨论 （1）米氏方程与一级反应和零级反应 （2）Vmax与酶的转换数 （3）酶被底物饱和的百分数 （4）米氏的实际应用 （5）米氏方程——双曲线方程形式 null4．米氏常数的意义 有关米氏常数说明几点 （1）Km是酶的一个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度无关 （2）如酶能催化几种不同的底物，对每种底物都有一个特定的Km值，其中Km值最小的称该酶的最适底物。 （3）Km除了与底物类别有关，还与pH、温度有关， 所以Km是一个物理常数，是对一定的底物、一定的pH、一定的温度而言的。 （4）Km与Ks：Km不等于Ks，只有在特殊情况下即 和底物的亲和力。 null5．米氏常数的求法 （1）v对[S]作图 （2）双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法） null（3）v对 作图（Eadie-Hofstee法） null（4） [S]/v 对[S]作图（Hanes-Woolf法） null（5）直接线性作图法 （Eisenthal和Cornish-Bowden法） null（二）双底物双产物反应 双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 : 双底物 双产物的反应 序列反应 （sequential reactions） 乒乓反应 （ping pong reactions） 有序反应 （orderd reactions） 随机反应 （random reactions） null1．序列有序反应（ordered reactions 写作 ordered Bi Bi） null2．序列随机反应（random reactions， 写作Random Bi Bi） null3．乒乓反应（ping pong reactions，写作uni uni uni uni ping pong or Ping Pong Bi Bi） null（三）酶浓度对酶反应速度的影响 1．反应速度与酶浓度成正比 [S]>>[E] V∝[E] 2．V与[E] 关系的几点讨论 （四）pH对酶反应速度的影响 1．酶反应的最适pH（optimum pH） 2．pH影响反应速度的原因 ( 1 ) pH影响了酶分子、底物分子和ES复合物的解离状态。 ( 2 ) 过高、过低的pH导致酶蛋白变性。null（五）温度对酶反应速度的影响 1．最适温度（optimum temperature） 最适温度与最适pH一样，也不是一个固定的常数，它随底物的种类、浓度, 溶液的离子强度, pH, 反应时间等的影响。例: 反应时间短，最适温度高。 反应时间长，最适温度低。null（六）激活剂对酶反应速度的影响 （七）酶的抑制作用和抑制作用动力学 1、不可逆抑制作用（irreversible inhibition） 2、可逆抑制作用(reversible inhibition)及其动力学 （1）竞争性抑制作用（competitive inhibition） null（2）非竞争性抑制作用（noncompetitive inhibition） null（3）反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition） 六、酶的专一性及活性中心六、酶的专一性及活性中心（一）酶的专一性（特异性，specificity） 1、绝对专一性（absolute specificity） null2、相对专一性（relative specificity） （1）基团专一性（group specificity） （2）键专一性 A — Bnull3、立体专一性（stereospecificity） （1）D-，L-立体异构专一性 （2）几何异构专一性 （3）酶能区分从有机化学观点来看是属于对称分子中两个等 同的基团，只催化其中的一个基团，而不催化另一个。 nullnull（二）关于酶作用专一性的几种假说 1、锁钥学说（lock and Key theory） 1894年 Fischer 提出null2、三点附着学说 null3、诱导契合学说（induced-fit theory） 1958年 Koshland提出nullnull（三）酶的活性中心（active center） 1、活性中心的概念 酶是蛋白质，是大分子化合物，在这样一个大分子中只有一小部分是与底物结合，并与催化作用直接有关，这个部位称酶的活性中心。 组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和ASP的-COOH，Lys的ε-NH2，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团。七、酶的作用机理七、酶的作用机理（一）与酶高效率有关的因素 1、邻近效应与定向效应 （proximity and orientation effect） 邻近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应。 定向效应: 指酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确定向。 nullnull2、张力效应和底物形变（strain and distortion） null3、酸碱催化（acid-base catalysis） nullnull4、共价催化（covalent catalysis） 什么是共价催化？ 5、酶活性中心的疏水环境效应 null（二）某些酶的活性中心及其作用机理 1、溶菌酶（Lysozyme） nullnullnullnullnull2、胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin） nullnull形成酰化中间物 nullnullnullnull3、羧肽酶A（carboxypeptidase A，CpA） nullnullnullnull酶单独存在时 :null酶底物复合物 :八、别构酶（也称变构酶，allosteric enzyme）八、别构酶（也称变构酶，allosteric enzyme）（一）别构酶结构上的特点 （二）别构酶性质上的特点 （三）别构酶的别构效应（allosteric effect） 1、什么是别构效应 2、同促效应与异促效应 null（四）别构酶的作用动力学 1、正协同效应（positive cooperative effect） null2、负协同效应（negative cooperative effect） 3、正协同效应别构酶与米氏酶动力学比较 null4、负协同效应别构酶与米氏酶动力学比较 null怎么区分米氏酶与别构酶？ koshland建议用饱和比值（saturation ratio, Rs） 典型的米氏酶 RS=81 具有正协同效应的别构酶 RS<81 具有负协同效应的别构酶 RS>81 null目前常使用Hill系数区分米氏酶与别构酶 Hill方程 : 将Hill方程中的有关参数换成别构酶中的有关参数 n为Hill系数，米氏酶Hill系数 n=1正协同效应的别构酶 n>1负协同效应的别构酶 n<1null（五）别构酶调节酶活性的机理1、对称或协同模型（symmetry or concerted model,也称齐变模型、MWC模型） 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 该模型的要点 : null2、序变模型（sequential model，也称KNF模型） 1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。 该模型的要点 :九、共价调节酶（covalently modulated enzymes） 九、共价调节酶（covalently modulated enzymes） 什么是共价调节酶？ 常见的是磷酸化/脱磷酸化，腺苷酰化/脱腺苷酰化，乙酰化/脱乙酰化，尿苷酰化/脱尿苷酰化，甲基化/脱甲基化，S-S/SH相互转变，共6种类型。 null共价调节酶最典型的例子是动物组织的糖原磷酸化酶 1. 糖原磷酸化酶催化的反应 催化糖原的磷酸解，生成G-1-P。 null2、结构特征 十、同工酶（isoenzyme or isozyme）十、同工酶（isoenzyme or isozyme）（一）同工酶的概念 同工酶的概念 同工酶的性质 null（二）乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH） 1、组成和电泳行为 null2、功能 催化的反应 十一、酶原的激活 十一、酶原的激活 null1、胃蛋白酶原（pepsinogen）的激活 2、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活 nullnull3、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活 十二、固定化酶（immobilized enzyme）十二、固定化酶（immobilized enzyme） 固定化酶是将水溶性的酶连接到固相载体上，使它以固相的状态作用于底物，因此也称固相酶。 固定化酶的优点 固定化酶的理化性质null固定化酶的制备 ① 吸附法 null② 偶联法 null④ 包埋法