琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳 v琼脂糖凝胶电泳是采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物的一种简单、快速分离纯化和鉴定核酸特别是DNA的方法。 琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取出来的，为一种聚合链线性分子。琼脂糖凝胶的孔经较大，主要用于分离较大片段的DNA分子（100bp～60kb）。 1、​ 电泳基本原理 与蛋白质分子相类似，核酸分子也是两性电解质。 ⑴在pH3.5时，核酸分子带正电荷，在电场中向负 极移动； ⑵在pH8.0～8.3时，碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。 ⑶ 不同大小和构象的核酸分子电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁移率区别很小，难以分开。但采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，发挥分子筛的功能，使得分子大小和构象不同的核 酸分子泳动率产生较大的差别，则可达到分离的目的。 ⑷ DNA片段在凝胶上移动的距离在一定范围内是分子质量的函数，分子质量越大，移动越缓慢。因此，利用琼脂糖凝胶电泳相对于标准DNA的移动度，可测定DNA片段的相对分子质量。 琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围 胶浓度（％） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 二、仪器设备及材料 1、电泳装置：包括电泳槽（多采用水平方式）、 胶床和梳子三部分组成。 2、稳压电泳仪：电压可变范围0～300～600V，电流可变范围0～250～500mA。 3、紫外线检测仪：可产生254、302、366nm 3个波段紫外线，并配备防护眼镜和5mm厚的黑色有机玻璃防护板。 4、照相机： 5、微波炉： 6、其它：三角烧瓶、量筒、胶带纸、一次性手套等。 2、​ 主要试剂 1、琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。 本实验配制 2％ Agrose： 2g Agrose 100ml 0.5×TBE EB少许（终浓度0.5μg/ml） 2、电泳缓冲液： 常用的缓冲液有TBE、TAE和TPE三种。 本实验选用TBE，先配制5×TBE 贮存液： 54g Tris碱 27.5g 硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) （或4.65g EDTA） 加dd H2O至1000ml。用时稀释为0.5×TBE。 3、6×上样缓冲液： 4℃贮存 0.25% 溴酚蓝 0.25% 二甲苯青FF 30％ 甘油水溶液 4、10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液 在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时确保其完全溶解，棕色瓶室温保存。 溴化乙锭（EB）染色原理： 溴化乙锭是一种荧光染料，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。这是因为： ①在紫外线照射时，核酸吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭； ②同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色可见荧光。  溴化乙锭用于核酸染色的优点： ⑴染色操作简单，一般在凝胶中加入终浓度0.5μg/ml的EB即可，在电泳过程中随时可以观察核酸的泳动。也可在电泳结束后，将凝胶浸泡在EB里30分钟即可。 ⑵EB染色不会引起核酸的断裂，其它染料做不到这一点。 ⑶EB染色灵敏度较高，可以检测出10ng的DNA样品。 溴化乙锭缺点： EB是一种强诱变剂，并有中度毒性。 注意：①操作中务必带上防护用手套。 ②如不慎皮肤与溶液接触，应立即用清水彻底冲洗。 ③含溴化乙锭的溶液使用后应进行净化处理，使其致诱变活性下降为原来的1/200左右，方可丢弃。 四、电泳操作步骤 1、凝胶准备：用0.5×TBE配制2％琼脂糖凝胶。 ① 称2g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB 0.5μg/ml，并轻轻混匀。 2、胶床准备： ①取出洗净并晒干的胶床和梳子，在胶床未封闭的两端贴上胶布或胶带纸，形成约5～8mm的挡墙。 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。 3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。撕去胶床两端的胶带纸，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极。 5、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。 6、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。 原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。 7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀。 8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～30μl。 9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。 开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：电压1～5v/cm；时间1小时左右。 10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 11、电泳结果分析： ①紫外检测仪直接观察电源条带； ②摄影； ③凝胶成像分析系统处理 五、注意事项： 1、凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 2、用胶带纸封闭胶床两端时，要确保严密，以免灌胶时有胶液漏出。 3、用微波炉熔化琼脂糖时，应控制好时间，以免突然产生气泡，使琼脂糖溢出来。 4、凝胶冷却至60℃左右，立即铺胶，以防凝固。 5、上样前检查样品孔内是否有气泡，并设法排除。 6、上样时，加样器吸头要轻贴样品孔壁，但不要碰坏孔壁，否则电泳条带不整齐。 7、电泳前，确认样品孔位于电场负极。 8、因EB存在，全部操作过程要带防护手套。含EB的溶液应做净化处理。 注意事项： 1.  加热时, 一定要煮沸, 以保证琼脂糖的完全溶解. 2.  待溶液冷却至不烫手, 感觉温暖舒适时加EB. 一定要在通风柜里. 3.  倒胶时, 可用干净的纸巾拭去气泡. 4.  胶凝固后先倒入些电泳缓冲液以方便取梳子. 5.  保证缓冲液淹过胶的边沿, 边沿部分常高出1-2mm. 6.  有时需要大的上样孔, 可用胶带把几个相邻的梳齿粘在一起, 这种情况下, 尽量让胶液冷一些再倒胶. 7.  如果只是为了看一下结果(不需要照相), 同一块胶可重复用1-3次. 有一次我跑了4遍, 条带很弱, 用加了EB的缓冲液(约10ul EB in 50ml 缓冲液)泡半小时后就如正常了. 8.  要保存胶到第二天用, 可以保鲜膜包裹后放入4 度冰箱. 9.  TAE 电泳缓冲液也可重复使用, 至少10次没有问题. 10.  为了防止电泳时两极缓冲液槽内pH和离子强度的改变，可在每次电泳后合并两极槽内 的缓冲液，混匀后再用。 溴酚兰的作用 1：结合沉淀核酸 2：标记泳道中核酸所跑的位置 凝胶制备的注意事项 1、配胶和电泳需要使用同一批次的缓冲液（一些限制酶缓冲液含有高浓度盐，能减慢DNA的迁移，并可使临近孔泳带变斜） 2、琼脂糖要彻底熔化，时间不宜过长 3、EB含量要适当 4、凝胶应存放在阴凉处，再次用时加入少量电泳液，再熔化 5、检查梳子 6、拔取梳子时应均匀用力，检查凝胶孔的整齐度 7、凝胶稍厚些，避免样品溢出 电泳时间 PCR产物，应该在24h之内电泳 电泳时间不易过长，对于长片断影响不大，但对小片断DNA影响明显 电泳期间，EB向阴极迁移，与DNA迁移方向相反，长时间电泳将导致凝胶中EB含量显著较少，小片断DNA检测发生困难 电泳上样量 *​ 中号梳子：8—10ul *​ 小号梳子：6—8ul *​ 上样注意事项： 1、加样时应悬空 2、加样尽可能快 3、不必每一个样品用一个吸头 4、上样量中DNA含量过高，容易产生“弯月亮” 凝胶拍照 *​ 曝光时间：6--10s *​ 拍照尺寸的选取：选用大的尺寸拍摄可获得清晰的电泳图片 *​ 一般拍摄两次才可以得到清晰的照片 小结 *​ 电泳图片的影响因素： 凝胶，电泳液，EB，上样操作，拍照 *​ 好的电泳图片不一定一次就可以获得 琼脂糖凝胶中DNA的检测 *​ 凝胶中核酸染色方法： 溴化乙锭(EB)染色法和SYBR Gold染色法 前者检测灵敏度低10ng，但价格便宜，常用 后者检测灵敏度高20pg，但价格昂贵，不常用 *​ 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％ *​ 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色 *​ 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(<10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min 电压 *​ 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 *​ 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 3、​  4、​