蛋白质的分离与纯化

一，蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质 则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化 蛋白质及酶。 （一）水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常 用的溶剂，通常用量是原材料体积的 1-5 倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋 白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度 随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面， 温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采 用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解 酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。 下面着重讨论提取液的 pH 值和盐浓度的选择。 1、pH 值 蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的 pH 值应选择在偏离等电 点两侧的 pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可 解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质 用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。 2、盐浓度 稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质 部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量 NaCl 等 中性盐，一般以 0.15 摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用 0.02-0.05M 磷酸盐和碳 酸盐等渗盐溶液。 （二）有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于 水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一 定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下 操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为 丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围 内（度为 10%，40 度为 6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的 pH 及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。 二、蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： （一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1、蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高， 蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程 度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐 离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层， 使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等 电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的 盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段 沉淀。 影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操 作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如 血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0度时溶解度低，更 容易盐析。（2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。 （3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地 一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白 质含量在 2.5-3.0%。 蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸 钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱 和溶液为 4.1M，即 767 克/升；0度时饱和溶解度为 3.9M，即 676 克/升），在 这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果 也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当 用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析， 即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断 的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄 糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。 2、等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋 白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀， 但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。 3、低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低 并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 （二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1、透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而 蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。 2、凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有 效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖 凝胶（agarose gel）。 （三）根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 1、电泳法 各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移 率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为 载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定 电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分 析和制备各种蛋白质。 2、离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交 换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素）， 当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋 白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗 脱下来。（详见层析技术章） （四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的 方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混 合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体 (Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中 是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此 蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification） 和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或 一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往 往采取几种方法联合使用。 细胞的破碎 1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积，盖紧筒盖， 将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内 脏组织、植物肉质种子等。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移 动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和 动物脏器组织。 3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂， 此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用 50-100 毫克菌体/ 毫升浓度，在 1KG 至 10KG 频率下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会 产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4、反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内 冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、 去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。 无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到 溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP） 可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白 水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是 全部，还可通过选择 pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质 的提取。 浓缩、干燥及保存 一、样品的浓缩 生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的 目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的： 1、减压加温蒸发浓缩 通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低， 蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。 2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，面不 断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风， 使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶 液的浓缩。 3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相 中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与 溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此 法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液 中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。 4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需 与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚 乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分 子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于 4度下，袋内溶剂渗出即被聚 乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。 5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤 的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透 过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是 蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持 生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型 和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值） 等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性 质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值： 用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端 与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待 透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大 分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短 10 倍。 二、干燥 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常 用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干 燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因 素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华 为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低 温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天 然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。 三、贮存 生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在 低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏简单，只要将干燥的 样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持 0－4度冰箱即可，液态贮藏时 应注意以下几点。 1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分 子变性。 2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚 等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和 辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。 核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的缓冲液中。 3、贮藏温度要求低，大多数在 0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同 物质而定。 可依据蛋白质不同性质与之相对应的方法将蛋白质混合物分离： 1．分子大小 不同种类的蛋白质在分子大小方面有一定的差别，可用一些简便的方法，使 蛋白质混合物得到初步分离。 1．1 透析和超滤 透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低 分子量的抑制剂等。透析膜的截留分子量为 5000 左右，如分子量小于 10000 的 酶液就有泄露的危险，在纯化中极为常用，可除去盐类、有机溶剂、低分子量的 抑制剂等。超滤一般用于浓缩和脱色 1．2 离心分离置换缓冲液 许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集 10~20 倍，再对特定的酶进行纯化。差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓 缩。速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离 时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分 一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。等密度梯度离心常用的离主 介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等 1．3 凝胶过滤 这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白 质分子量落在凝胶的工作范围内。选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲 液及利用分子量的差异除去热源。 2．形状 蛋白质在离心通过溶液运动时，或通过膜、凝胶过滤填料颗粒或电泳凝胶中 的小孔运动时，都会受到形状的影响：对两种相同质量的蛋白质而言，球状蛋白 质具有较小的有效半径（斯托克半径），通过溶液沉降时遇到的摩擦力小，沉降 较快而显得比其它形状的蛋白质大；反之，在体积排阻色谱时，斯托克半径较小 的球状蛋白质更容易扩散进入凝胶过滤填料颗粒内部，较迟洗脱出来，因而显得 比其它形状的蛋白质要小。 3．溶解度 利用蛋白质的溶解度的差别来分别各种蛋白质常用的方法。影响蛋白质溶解 度的外界因素很多，其中主要有：溶液的 pH、离子强度、介电常数和温度，但 在同一的特定外界条件下，不同的蛋白质具有不同的溶解度。适当改变外界条件， 控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度 3．1pH 控制和等电点沉淀 蛋白质在其等电点一般较不易溶解。 3．2 蛋白质的盐溶和盐析 3．3 有机溶剂分级法 蛋白质在不同的溶剂中的溶解度有很大不同，从基本不溶（＜10μg/ml）直 至极易溶解（＞300mg/ml）不等。影响蛋白质溶解度的可变因素包括温度、pH、 溶剂的极性、离子性质和离子强度。引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同，故 控制有机溶剂的浓度可分离蛋白质。 水溶性非离子聚合物如聚乙二醇也能引起蛋白质的沉淀。 3．4 温度 不同的蛋白质在不同的温度具有不同的溶解度和活性。大多数蛋白质在低温 下比较稳定，故分离操作一般在 0℃或更低温度下进行。 4．电荷 蛋白质净电荷取决于氨基酸残基所带的正负电荷的总和，如中性溶液中带净 负电荷则称为酸性蛋白质， 4．1 电泳 不仅是分离蛋白质混合物和鉴定蛋白质纯度的重要手段，而且也是研究蛋白 质性质很有用的方法。 等电聚焦分辨率很高，pI 有 0.02pH 的差异就能分开。 2D-PAGE 分离蛋白质分辨率已经发展到 100000 个蛋白点。 4．2 离子交换层析 改变蛋白质混合物溶液中的盐离子强度、pH 和（阴、阳）离子交换填料， 不同蛋白质对不同的离子交换填料的吸附容量不同，蛋白质因吸附容量不同或不 被吸附而分离。 洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或 pH 的方法 洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别 是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。控制洗脱剂的 体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和 pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗 脱下来。 蛋白分子暴露在外表面的侧链基团的种类和数量不同，故在一定的 PH 值和 离子强度的缓冲液的所带的电荷不同 5．电荷分布 电荷的氨基酸残基可均匀地分布于蛋白质的表面，既可以适当的强度与阳离 子交换柱结合也能以适当强度与阴离子结合，因多数蛋白质都有不能在单一的溶 剂条件下同时与两种类型的离子交换柱结合，故可得用此性质纯化；电荷的氨基 酸残基亦可成簇分布，使某一区域带强正电荷而另一区域带强负电荷，呈强酸性 或强碱性，只能在极端 pH 与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂结合，如钙调蛋 白只能在 pH2 时与阳离子交换树脂结合。 6．疏水性 多数疏水性的氨基酸残基藏在蛋白质的内部，但也有一些在表面。蛋白质表 面的疏水性氨基酸残基的数目和空间分布决定了该蛋白质是否具有与疏水柱填 料结合从而利用它来进行分离的能力。 因其廉价和纯化后的蛋白质具有生物活性，是一种通用性的分离和纯化蛋白 质的工具。高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱 上被洗脱，故特别适用于浓硫酸铵溶液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后 的含有目标产品的溶液直接进样到柱上，当然也适用 7mol/盐酸胍或 8mol/L 脲 的大肠杆菌的治疗蛋白质提取液直接进样到柱上，在分离的同时也进行了复性。 7．密度 多数蛋白质的密度在 1.3~1.4g/cm3 之间，分级分离蛋白质时一般不常用此 性质，不过对含有大量磷酸盐或脂质的蛋白质与一般蛋白质在密度上明显不同， 可用密度梯度法离心与大部分蛋白质分离。 8．基因构建的纯化标记 通过改变 cDNA 在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基 酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。 8．1GST 融合载体 使要表达的蛋白质和谷胱甘肽 S转移酶一起表达，然后利用 Glutathione Sepharose 4B 作亲和纯化，再利用凝血酶或因子 Xa 切开。 8．2 蛋白 A融合载体 使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose 纯化。 8．3 含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose 最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上 6~10 个组氨酸，在一般或变 性条件（如 8M 尿素）下借助它能与 Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱， 或将 pH 降至 5.9 使组氨酸充分质子化，不再与结合 Ni2+使之得以纯化。 重组蛋白在、构建时已融入纯化构想。样品多夹杂了破碎细胞或可溶产 物，扩张床吸附技术 STREAMLINE 适合做粗分离。 9．亲和能力 结合效率高，分离速度快的特点。配基可是酶的底物、抑制剂、辅因子、特 异性的抗体、 吸附后可改变缓冲液的离子强度和 PH 的方法，洗耳恭听脱下来，也可用更 高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱 亲和层析固定相的配基与生物分子之间的特殊的生物大分子亲和能力不同来进 行相互分离的，依亲和选择性的高低分为：基团性亲和层析，固定相上的配基对 一类基团的极强的亲和力。如含有糖基的一类蛋白质或糖蛋白对三嗪染料显示特 别强的吸附能力；高选择性（专一性）亲和层析，配基仅对某一种蛋白质有特别 强的亲和性。如单克隆抗体对抗原的特异性的吸附。 亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的 作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体 系。 与超滤结合起来，将两者优点集中形成超滤亲和纯化，具有高分离效率和大 规模工业化的优点，适用于初分离。 按配基的不同可分为： （1）金属螯合介质 过渡金属离子 Cu2＋、Zn2＋和 Ni 2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相 上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形 成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱 的固定相吸附。螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而 亦受流动相的 pH 和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。 （2）小配体亲和介质 配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。 （3）抗体亲和介质 即免疫亲和层析，配体有重组蛋白 A和重组蛋白 G，但蛋白 A比蛋白 G专一， 蛋白 G能结合更多不同源的 IgG。 （4）颜料亲和介质 染料层析的效果除主要取决于染料配基与酶的亲和力大小外，还与洗脱缓冲 液的种类、离子强度、PH 值及待分离的样品的纯度有关。配体有 Cibacron Blue 和 Procion Red 两种。在一定的条件下，固定化的染料能起阳离子交换剂的作用， 为了避免此现象的发生，最好要离子强度小于 0。1和 PH 大于 7时操作。 （5）外源凝集素亲和介质 配体有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麦芽外源凝集素，固相外源凝集素能 和数种糖类残基发生可逆反应，适合纯化多糖、糖蛋白。 10．非极性基团之间作用力 溶质分子中的非极性基团与非极性固定相间的相互作用力（非选择性分散力 或伦敦力）大小与溶质分子极性基团与流动力相中极性分子在相反方向上相互作 用力的差异进行分离。因其流动相中的置换剂是极性小于水的有机溶剂（如甲醇、 乙腈、四氢呋喃等），这些有机溶剂可能使许多蛋白质分子产生不可逆的变性； 流动相中须有离子对试剂（如三氟乙酸、甲酸、磷酸等）存在才可使分离有效地 进行和获得高的质量回收率；分离须在酸性介质中进行（一般 pH 在 2~3 之间）， 又有一些蛋白质会在后两种条件下产生不可逆的分子构象变化，故在生物大分子 中人分离纯化中受到限制，但分子构象变化可逆的蛋白质而言是有效的方法。 正相色谱在生物大分子中的分离和纯化中应用相对较少，因所用的溶剂很 贵。 11．可逆性缔合 在某些溶液条件下，有一些酶能聚合成二聚体、四聚体等，而在另一种条件 下则形成单体，如相继在这两种不同的条件下按大小就可以进行分级分离。 12．稳定性 12．1 热稳定性 大多数蛋白质加热到 95℃时会解折叠或沉淀，利用这一性质，可容易地将 一种经这样加热后仍保持其可溶性活性的蛋白质从大部分其它细胞蛋白质中分 离开。 12．2 蛋白酶解稳定性 用蛋白酶处理上清液，消化杂蛋白，留下抗蛋白酶解抗性蛋白质。 13．分配系数 即利用双水相萃取分离，常用的生物物质分离体系有：聚乙二醇（PEG）/葡聚糖 （DEXTRAN）、PEG/磷酸盐、PEG/硫酸铵等。由于具有含水比例高、选用的聚合 物及盐对酶无毒性、分离设备与化学工业通用等优点，在工业上目益受重视。 分配行为受聚合物分子大小、成相浓度、PH、无机盐种类等因素影响， 发展：具有亲和双水相萃取及膜分离双水相萃取等新型双水相分离技术。 双向水溶液系统的蛋白质纯化 一些与水混合多聚物的不相溶性导致依赖于多聚物浓度的两相系统的液-液 分配技术，可以由两不同的高水溶性的多聚物或一种多聚物各一种盐，用于从微 生物匀浆中除支细胞碎片、后续分配步骤进一步纯化。分离的选择性一般随着分 离分子或颗粒大小面增加。 14．表面活性 14．1 泡沫分离 蛋白质溶液具有表面活性，气体在溶液中鼓泡，气泡与液相主体分离，在塔 顶富集，达到分离和浓缩的目的。 14．2 反胶团相转移法 反胶团相转移法是 80 年代兴起的一种新型分离技术，它利用表面活性剂分子 在有机溶剂中自发形成的反向胶团（反胶团），在一定条件下将水溶性蛋白质分 子增溶进反胶团的极性核（水池）中，再创造条件将蛋白质抽提至另一水相，实 现蛋白质的相转移，达到分离和提纯蛋白质的目的。反胶团中的蛋白质分子受到 周围水分子和表面活性剂极性头的保护，仍保持一定的活性，甚至表现出超活性。 由于蛋白质增溶于反胶团与蛋白质所带电荷及反胶团内表面电荷间的静电作用 及反胶团的大小有关，因而表面活性剂的种类、水溶液的 pH 值及离子强度等因 素均影响反胶团对蛋白质的相转移。据报道利用 AOT／异辛烷反胶团对酵母脂肪 酶进行相转移。 14．3 聚合物-盐-水液-固苯取体系是 90 年代在国内开发的种新的萃取体系，成 功地用于萃取金属离子及卞果酸脱氢酶等生物活性物质较强的吸附及乳化作用 等缺陷，成相容易成相后直接倾出液相即可使液固的相分离，勿需特殊技术处理， 不用有机溶剂，无毒性，成相聚合物及盐对生物活性物质有稳定和保护作用，萃 取分离选择性好消耗低、易于规模放大的分离生队物活件物质的新技术在聚乙二 醇修饰物的聚乙二醇／葡聚糖双水相萃取体系共价作用：主要用于含巯基酶的纯 化，通过共价键结合在层析介质上，偶联是可逆的，能还原二硫键的低分子化合 物洗脱，如空间位阻，可在含变性剂的缓冲液时吸附，如已含二硫键，则先用还 原剂打开。 （一）双缩脲测定法 1．原理 蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫 色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性 强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出 毫克水平。 2．试剂配制 硫酸铜（CuSO4·5H2O） 1.50g 酒石酸钾钠 5.00g H2O 500.0ml 10％氢氧化钠（不含硫酸钠） 300ml H2O 加至 1 000ml 此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。 3．标准曲线的制备 ⑴ 准确称取牛血清白蛋白 1.0g（必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血 清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算），以生理盐水配成 1％的浓度。 ⑶ 混匀后于室温放置 0.5h～1h，光电比色（540nm），顺序由低浓度至高浓度， 每管测 3次，求其平均值。 ⑷ 以 OD 值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。 4．样品测定 ⑴ 取样品 0.1ml，加生理盐水 1.4ml。也可将样品做 1﹕10 稀释加 1ml，再加生 理盐水 0.5ml。 ⑵ 加双缩脲试剂 4.0ml，混匀，至室温 0.5h～1h。 ⑶ 另以 1.5ml 生理盐水加 4.0ml 双缩脲试剂作为空白对照。 ⑷ 测 OD540 值。 ⑸ 根据 OD 值从标准曲线上查出蛋白含量。 注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制 定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。 （二）紫外光谱吸收法 1．原理 本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸 收特点而建立的。蛋白质在 280nm 波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基 酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试 剂，测完后，样品可回收。 2．标准曲线的制备 ⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白 50mg，溶于 50ml 生理盐水中。 ⑵ 以生理盐水再稀释成每 ml 含 0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg……0.9mg， 以盐水对照。 ⑶ 测各管 OD280 值。 ⑷ 以 OD280 值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。 3．样品测定 将待测样品以盐水适当稀释，在 0.10mg/ml~1.00mg/ml 之间，以生理盐水为对照， 测 OD280 值，从标准曲线上查出蛋白含量。 （三）Folin 酚法 1．原理 蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和 Folin 酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸 作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色 即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中 脂多糖的干扰。 2．试剂 试剂甲： A 液：Na2CO3 10.00g NaOH 2.00g 酒石酸钾钠（或钾盐钠盐）0.25g 混合、溶于 500ml 蒸馏水中。 B 液：CuSO4·5H2O 0.5g H2O 100.00ml 用前将 A液 50 份与 B液 1份混合即为试剂甲。 试剂乙： 于磨口回流瓶加入下列试剂 Na2WO4·2H2O 100.00g NaMoO4·2H2O 25.00g H2O 700.00ml 85％H3PO4 50.00ml 浓 HCl 100.00ml 按上回流冷凝管以小火回流 10h 后再加： 硫酸锂 150.00g H2O 50.00ml 溴水 数滴 开口继续沸腾 15min，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色， 须重复滴加液体溴步骤）。稀释至 1L，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用 标准 NaOH 液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约 1倍）使最终浓度 为 1mol/L。 3．标准曲线的制备 ⑴ 取标准牛血清白蛋白 2.50mg，溶于 10ml 蒸馏水中，使成 250μg/ml。 ⑵ 按表 8-2 稀释。 ⑶ 每管加试剂甲 5ml，混合后室温放置 10min，再加 0.50ml 试剂乙（即 Folin 酚试剂），立即摇匀（否则显色降低）。 ⑷ 30min 后测 OD650nm。 ⑸ 以 OD 为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。 4．样品测定 ⑴ 待测样品 1ml（适当稀释至约含 25μg－250μg/ml）。 ⑵ 加试剂甲、乙。 ⑶ 比色、测 OD650 值。 ⑷ 查标准曲线，求蛋白含量乘以稀释倍数，即为样品的蛋白含量。 （四）紫外分光测定法 A1%1cm＝13.8（IgG）(280nm) A1%1cm＝14.5(IgM)(280nm) 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45OD280－0.74OD260 （此为经验公式，即以不同浓度 的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的）。 蛋白质浓缩技术是免疫学中常用的手段，现介绍几种常用的浓缩技术。 （一）透析袋浓缩法 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋 （无透析袋可用玻璃纸代替），结扎，把高分子（6 000－12 000）聚合物如聚 乙二醇（碳蜡）、聚乙烯吡咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂 配成 30％－40％浓度的溶液，将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后， 可放入温箱中烘干或自然干燥后，仍可再用。 （二）冷冻干燥浓缩法 这是浓缩蛋白质的一种较好的办法，它既使蛋白质不易变性，又保持蛋白质中固 有的成分。它是在冰冻状态下直接升华去除水分。具体做法是将蛋白液在低温下 冰冻，然后移置干燥器内（干燥器内装有干燥剂，如 NaOH、CaCl2 和硅胶等）。 密闭，迅速抽空，并维持在抽空状态。数小时后即可获得含有蛋白的干燥粉末。 干燥后的蛋白质保存方便，应用时可配成任意浓度使用。也可采用冻干机进行冷 冻干燥。 （三）吹干浓缩法 将蛋白溶液装入透析袋内，放在电风扇下吹。此法简单，但速度慢，且温度不能 过高，最好不要超过 15℃。 （四）超滤膜浓缩法 此法是利用微孔纤维素膜通过高压将水分滤出，而蛋白质存留于膜上达到浓缩目 的。有两种方法进行浓缩：一种是用醋酸纤维素膜装入高压过滤器内，在不断搅 拌之下过滤；另一种是将蛋白液装入透析袋内置于真空干燥器的通风口上，负压 抽气，而使袋内液体渗出。 （五）凝胶浓缩法 选用孔径较小的凝胶，如 SephadexG25 或 G50，将凝胶直接加入蛋白溶液中。根 据干胶的吸水量和蛋白液需浓缩的倍数而称取所需的干胶量。放入冰箱内，凝胶 粒子吸水后，通过离心除去。 （六）浓缩胶浓缩法 浓缩胶是一种高分子网状结构的有机聚合物，具有很强的吸水性能。每克干胶可 吸水 120ml～150ml。它能吸收低分子量的物质，如水、葡萄糖、蔗糖、无机盐 等，适宜浓缩 10 000 分子量以上的生物大分子物质。浓缩后，蛋白质的回收率 可达 80％～90％。比浓缩胶应用方便，直接加入被浓缩的溶液中即可。必须注 意，浓缩溶液的 pH 值应大于被浓缩物质的等电点，否则在浓缩胶表面产生阳离 子交换，影响浓缩物质的回收率。