从宫内节育器的不良事件监测及研究看器械的风险管理（奚廷斐）

从宫内节育器的不良事件监测 及研究看器械的风险管理 奚廷斐 中国药品生物制品检定所 北京大学前沿交叉学科研究院 �宫内节育器（IUD)是我国育龄妇女使用的 最主要的避孕方法，在2.30亿采用各种避孕 措施的已婚育龄妇女中，有1.4亿妇女正在 采用宫内节育器，占49.79%。国内使用的 宫内节育器有22种，48个型号，其中含铜 宫内节育器占95%,含铜面积最低 110mm2，最高达480mm2。 � 1967年，智利的Zipper在动物实验中发现 铜，锌等金属盐有明显的抗生育作用， 1968年Tatum和Zipper合作，成功研制出惰 性IUD为载体的含铜宫内节育器（Cu-IUD)。 20世纪80年代世界卫生组织向我国推荐 TCu380A, 同时我国也开始研制Cu-IUD。 90年代在我国大规模使用Cu-IUD。目前在 临床使用的主要有TCu-IUD, VCu-IUD, OCu-IUD, 宫Cu-IUD等。 � 2006年2月26日国家人口计生委 科技司发布了“12万例宫内节育器 避孕效果调查”（中国计划生 育学杂志，2007年第3期132-136） � 1. 各种类型宫内节育器不良停用率，续用 率存在较大差异。五年累计不良停用率平 均为23.31%，其中元宫药铜宫内节育器 （含铜220mm2)为16.65%，TCu220C宫内 节育器为20.08%。 � 2. 20年来，虽然宫内节育避孕有效率明显 提高，品种大量增加，但副反应（出血， 感染，腹痛，腰痛）却没有下降。其中因 症取出是描述宫内节育器的一项重要指标。 五年累计因症取出率为9.45%，元宫药铜宫 节育器最低，为4.42%。 � 3. TCu380A宫内节育器是从国外引进，被 国外一些研究机构推荐使用，但在本次调 查结果显示：TCu380A宫内节育器避孕有 效性比较低，副反应发生率也较高。 风险管理 � 1. 风险分析 � 2. 风险评价 � 3. 风险控制 Cu-IUD的避孕机理 � Cu-IUD放置在子宫内后，铜在宫腔内腐 蚀而释放出铜离子，会引起子宫内膜局部 的炎症反应，能抑制或杀死精子。同时对 孕卵形成、卵泡着床等各环节起抗生育作 用，而大大提高避孕效果。 �由于铜离子可以杀死精子，抑制孕卵形成 和卵泡着床等作用，但同时也杀灭正常细 胞，引起炎症、出血等副作用。2002年ISO 发布的含铜宫内节育器标准（ISO7439）对 含Cu-IUD的铜面积作了规定,200-380mm2。 但是我国2006年发布的5个含Cu-IUD对铜 面积未作任何要求，造成国内含Cu-IUD用 铜量从110mm2到480mm2。 宫内节育器宫内节育器宫内节育器宫内节育器（（（（IUDIUDIUDIUD））））标准中的生物学评价标准中的生物学评价标准中的生物学评价标准中的生物学评价 � 1、GB/T 16886.1-ISO 10993.1中4.1.2明 确举例：宫内节育器为长期与面粘膜接 触的医疗器械。 � 2. GB/T 16886.3-ISO10993.3中6.1明确： 宫内节育器为可能与生殖组织、胚胎或胎 儿直接长期接触的器械，需进行生殖毒性 试验。 � 根据以上两点，宫内节育器进行生物学评价试验 应为: 细胞毒性试验、致敏试验、粘膜刺激试验、 亚慢性毒性试验、遗传毒性试验和生殖毒性试验。 � 但是在四个含铜宫内节育器国家标准中虽然说明 要按GB/T16886.1（即ISO10993.1）规定进行生物 学评价试验，但列出的试验为：细胞毒性试验、 致敏试验、刺激试验和植入试验。 一一一一、、、、含铜宫内节育器细胞毒性研究含铜宫内节育器细胞毒性研究含铜宫内节育器细胞毒性研究含铜宫内节育器细胞毒性研究 两种样品： TCu380ATCu380ATCu380ATCu380A与与与与TCu220cTCu220cTCu220cTCu220c 1.1.1.1.相同浸提条件不同浸提时间时的细胞毒性试验相同浸提条件不同浸提时间时的细胞毒性试验相同浸提条件不同浸提时间时的细胞毒性试验相同浸提条件不同浸提时间时的细胞毒性试验：：：： 温度温度温度温度：：：：37℃； 浸提液浸提液浸提液浸提液：：：： 10％FBS－DMEM 培养液与DPBS磷酸盐缓冲液； 浸提时间浸提时间浸提时间浸提时间：：：：1、3、7、15、21天后用10％FBS－DMEM 培养液 稀释50％作为样品； TCu380ATCu380ATCu380ATCu380A：：：： 44444444444444444444DPBSDPBSDPBSDPBS 44444444444444444444 10101010％％％％FBSFBSFBSFBS－－－－DMEMDMEMDMEMDMEM 21212121天天天天15151515天天天天7777天天天天3333天天天天1111天天天天 TCu220c:TCu220c:TCu220c:TCu220c: 22221111111111111111DPBSDPBSDPBSDPBS 44442222111100000000 10101010％％％％FBSFBSFBSFBS－－－－DMEMDMEMDMEMDMEM 21212121天天天天15151515天天天天7777天天天天3333天天天天1111天天天天 2.2.2.2.相同浸提时间不同浸提条件下细胞毒性试相同浸提时间不同浸提条件下细胞毒性试相同浸提时间不同浸提条件下细胞毒性试相同浸提时间不同浸提条件下细胞毒性试 验验验验 浸提液浸提液浸提液浸提液：：：： 10％FBS－DMEM 培养液浸提后直接作为样品进行细 胞毒性试验 条件1： （（（（37373737±±±±1111））））℃℃℃℃（（（（24242424±±±±2222））））hhhh；；；； 条件2： （（（（37373737±±±±1111））））℃℃℃℃（（（（72727272±±±±2222））））hhhh 条件3： （（（（50505050±±±±2222））））℃℃℃℃（（（（72727272±±±±2222））））hhhh 条件4： （（（（70707070±±±±2222））））℃℃℃℃（（（（24242424±±±±2222））））hhhh 条件5： （（（（121121121121±±±±2222））））℃℃℃℃（（（（1111±±±±0.10.10.10.1））））hhhh 条件条件条件条件5555条件条件条件条件4444条件条件条件条件3333条件条件条件条件2222条件条件条件条件1111 44444444444444442222 TCu220cTCu220cTCu220cTCu220c 44444444444444444444 TCu380ATCu380ATCu380ATCu380A 3. 系列浓度单元素铜离子的细胞毒性试验： 用模拟宫腔液制备铜离子系列浓度如下： 200、100、50、10、5、1μg/ml 000000000000444444444444毒性评级毒性评级毒性评级毒性评级 111155551010101050505050100100100100200200200200浓度浓度浓度浓度（（（（μμμμg/mLg/mLg/mLg/mL）））） 二二二二、、、、含铜宫内节育器在体外释放研究含铜宫内节育器在体外释放研究含铜宫内节育器在体外释放研究含铜宫内节育器在体外释放研究 � 1.两种样品： TCu380A与TCu220c � 2.释放条件： 模拟宫腔液模拟宫腔液模拟宫腔液模拟宫腔液：：：：NaCl 4.97g/l； KCl 0.224g/l； NaHCO 3 0.25g/l；Glucose 0.50g/l； NaH 2 PO 4 .2H 2 O 0.072g/l； CaCl 2 0.167g/l; 用1M NaOH或HCl调整pH为7.2； 方法方法方法方法：：：：将待测IUD放入10ml模拟宫腔液中（pH为7.2），温 度为37.0±0.1℃。分别于释放1、3、7、15、31、45、60天 后取IUD浸泡液进行检测。第一周每一天换一次模拟宫腔液， 以后为每两天换一次模拟宫腔液，用FAAS测定溶液标本的Cu 2+ 的含量； 释放曲线如下释放曲线如下释放曲线如下释放曲线如下：：：： 释放曲线 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 Time,days c o p p e r c o r r o s i o n ( μ g / d ) TCu220c TCu380A 由图可见由图可见由图可见由图可见：：：：两种宫内节育器第一天时铜离子释放量为最大两种宫内节育器第一天时铜离子释放量为最大两种宫内节育器第一天时铜离子释放量为最大两种宫内节育器第一天时铜离子释放量为最大，，，， 在在在在15151515天后浓度趋于稳定天后浓度趋于稳定天后浓度趋于稳定天后浓度趋于稳定。。。。 TCu380ATCu380ATCu380ATCu380A最大释放速率大约为最大释放速率大约为最大释放速率大约为最大释放速率大约为 TCu220cTCu220cTCu220cTCu220c最大释放速率的两倍最大释放速率的两倍最大释放速率的两倍最大释放速率的两倍。。。。 1.1 主要仪器、设备及试剂 BD FACS Calibur流式细胞仪； 10ul、20ul、200ul、1000ul精确移液器； 试剂盒：Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit； Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit。 1.实验材料 2.1 样品制备 不同浓度铜溶液：用细胞培养液调整铜离子的终浓度25，40， 50 μg/mL； TCu220C 试验组：浸提24h 和72h，浸提比例为0.2 g/mL； TCu380A试验组：浸提24h 和72h，浸提比例为0.2 g/mL。 三三三三、、、、 细胞凋亡及细胞周期细胞凋亡及细胞周期细胞凋亡及细胞周期细胞凋亡及细胞周期 2.试验步骤 细胞密度为 1×106个/mL 25cm2培养瓶 细胞凋亡测定- Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 阴性对照组加入新鲜培养液 TCu380A试验组接触12h TCu220C试验组接触24h 加入各组培养液 不同浓度铜溶液组接触24h 细胞周期测定- Cycle TESTTM PLUS DNA Reagent Kit (a) 阴性对照组 (b) 25μg/mL铜离子溶液 (c) 40μg/mL铜离子溶液 (d) 50μg/mL铜离子溶液 图3-1不同浓度铜离子溶液的细胞凋亡测定结果 (a)TCu220C浸提24h与细胞接触24h试验组 (b)TCu220C浸提72h与细胞接触24h试验组 (c)TCu380A浸提24h与细胞接触12h试验组 (d)TCu380A浸提72h与细胞接触12h试验组 图3-2不同TCu-IUD试验组细胞凋亡测定结果 (a) (b) (c) (d) 图3-3不同浓度铜离子溶液的细胞周期测定结果 (a) 阴性对照组；(b) 25μg/mL 铜离子溶液组； (c) 40μg/mL 铜离子溶液组；(d) 50μg/mL 铜离子溶液组. � 各组浓度的铜离子溶液与L929细胞接触24h后与阴性对 照相比，均出现了不同程度的细胞凋亡。随着铜离子溶液浓度 的增加，细胞凋亡百分比也明显增加。 小 结 � 在铜离子浓度为25-50μg/mL时，试验组G0/G1期细胞、 G2/M细胞、S期细胞与阴性对照组相对，无明显变化，说明 25-50μg/mL 时铜离子对细胞周期的变化没有特异性影响。 � 两组TCu-IUD试验组也检测到了不同程度的细胞凋亡。 随着样品浸提时间的增加，铜离子的释放量增多，细胞凋亡的 百分比增高，对细胞的损伤也更为严重。 四、遗传毒性试验遗传毒性试验遗传毒性试验遗传毒性试验 �依据GB/T 16886.3推荐的方法进行了如 下检测 � 1鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验 � 2小鼠骨髓细胞微核试验 � 3体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 试验总结 � 小鼠骨髓细胞微核试验、鼠伤寒沙门氏 菌回复突变试验均未出现阳性结果。 � 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验： 两样品染色体畸变率随剂量加大有增高 的趋势：高、中剂量组显示染色体内复 制细胞数目增多。 浸提液制备 �无菌操作取出节育器放置在宫内的部 分，置容器中。 �样品和浸提介质的比例为0.2g/ml �加入1640培养液37℃浸提72小时， 取上清液作为供试液。 TCu220c、TCu380A宫内节育器CHL细胞染色体畸变实验结果 0150 53100 205175TCu220 026.25 6412.5 18725TCu380 内复制 细胞率 畸变 细胞率% 剂量 mg/ml 样品 名称 结果 结论 � 两样品均可诱发核内复制细胞发生且有剂 量反应关系，提示受试物可能具有潜在抑 制细胞周期过程的作用。 � 随剂量升高畸变细胞百分率有上升趋势， 高剂量为可疑阳性反应。 � TCu380细胞毒性明显高于TCu220，是否 因铜表面积增大，铜离子释放浓度增高所 致有待进一步验证 � 以上结果建议参照其他检测项目和临床使 用情况综合分析其生物学意义 五五五五、、、、宫内节育器肌肉植入试验宫内节育器肌肉植入试验宫内节育器肌肉植入试验宫内节育器肌肉植入试验 1.材料材料材料材料：：：： 实验材料实验材料实验材料实验材料: 铜质宫内节育器铜质宫内节育器铜质宫内节育器铜质宫内节育器（（（（天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂）））） 对照对照对照对照：：：： 钛合金标准参照品钛合金标准参照品钛合金标准参照品钛合金标准参照品（（（（中检所中检所中检所中检所）））） 2.方法方法方法方法：：：： 动物动物动物动物：：：： Wistar大鼠大鼠大鼠大鼠，，，，体重体重体重体重200-250克克克克。。。。 植入部位植入部位植入部位植入部位：：：：背部肌肉背部肌肉背部肌肉背部肌肉，，，，左侧两个对照左侧两个对照左侧两个对照左侧两个对照，，，，右侧两个样品右侧两个样品右侧两个样品右侧两个样品 时间点时间点时间点时间点：：：： 1，，，，4，，，，12，，，，26周周周周 1周周周周；；；； A，，，，对照对照对照对照 X5，，，，B：：：：对照对照对照对照 X40。。。。C：：：：样品样品样品样品X5，，，，D：：：： 样品样品样品样品X40 ， 样品囊壁较对照厚样品囊壁较对照厚样品囊壁较对照厚样品囊壁较对照厚，，，，急性炎症细胞较多急性炎症细胞较多急性炎症细胞较多急性炎症细胞较多。。。。 A B C D 4周大体观察周大体观察周大体观察周大体观察；；；；A：：：：样品样品样品样品，，，， B：：：：对照对照对照对照 A B 4周样品大体观察周样品大体观察周样品大体观察周样品大体观察：：：：样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹，，，，切开包囊可见切开包囊可见切开包囊可见切开包囊可见 粘稠的白色脓液粘稠的白色脓液粘稠的白色脓液粘稠的白色脓液 4周周周周；；；； A，，，，对照对照对照对照 X5，，，，B：：：：对照对照对照对照 X40。。。。C：：：：样品样品样品样品X5，，，，D：：：：样品样品样品样品X40，，，，样品包囊样品包囊样品包囊样品包囊 腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞，，，， 囊壁可见巨噬细胞囊壁可见巨噬细胞囊壁可见巨噬细胞囊壁可见巨噬细胞，，，，淋巴细胞等淋巴细胞等淋巴细胞等淋巴细胞等。。。。 对照品囊比较薄对照品囊比较薄对照品囊比较薄对照品囊比较薄，，，，仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞，，，，未见炎症细胞未见炎症细胞未见炎症细胞未见炎症细胞。。。。 A B C D 12周大体观察周大体观察周大体观察周大体观察：：：：样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹样品被较厚的囊腔包裹，，，，对照品囊壁较薄对照品囊壁较薄对照品囊壁较薄对照品囊壁较薄 样 品 样 品 样 品 样 品 对 照 对 照 对 照 对 照 12周周周周；；；； A，，，，对照对照对照对照 X5，，，，B：：：：对照对照对照对照 X40。。。。C：：：：样品样品样品样品X5，，，，D：：：：样品样品样品样品X40，，，， 样品包囊腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞样品包囊腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞样品包囊腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞样品包囊腔内可见以坏死中性粒细胞为主的脓细胞，，，，囊壁可见巨噬囊壁可见巨噬囊壁可见巨噬囊壁可见巨噬 细胞细胞细胞细胞，，，，淋巴细胞等淋巴细胞等淋巴细胞等淋巴细胞等。。。。对照品囊比较薄对照品囊比较薄对照品囊比较薄对照品囊比较薄，，，，仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞仅见数层纤维细胞，，，，未见炎未见炎未见炎未见炎 症细胞症细胞症细胞症细胞。。。。 A B C D 六六六六、、、、子宫内植入试验子宫内植入试验子宫内植入试验子宫内植入试验 一一一一. 材料材料材料材料：：：： 实验材料实验材料实验材料实验材料: 铜质宫内节育器铜质宫内节育器铜质宫内节育器铜质宫内节育器（（（（天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂天津市医疗器械厂）））） 对照对照对照对照：：：： 钛合金标准参照品钛合金标准参照品钛合金标准参照品钛合金标准参照品（（（（中检所中检所中检所中检所）））） 二二二二. 方法方法方法方法：：：： 动物动物动物动物：：：： Wistar大鼠大鼠大鼠大鼠，，，，体重体重体重体重200-250克克克克。。。。 植入部位植入部位植入部位植入部位：：：： 子宫角子宫角子宫角子宫角。。。。 对照和样品分别植入不同大鼠对照和样品分别植入不同大鼠对照和样品分别植入不同大鼠对照和样品分别植入不同大鼠。。。。 （（（（与慢性全身毒相同与慢性全身毒相同与慢性全身毒相同与慢性全身毒相同）））） 时间点时间点时间点时间点：：：： 1，，，，4，，，，12，，，，26周周周周 正常大鼠子宫角正常大鼠子宫角正常大鼠子宫角正常大鼠子宫角 A：：：：X5，，，， B：：：：X40 A B A B C D 1周周周周: 可见节育器植入炎症反应较重可见节育器植入炎症反应较重可见节育器植入炎症反应较重可见节育器植入炎症反应较重，，，，以中性粒细胞为主以中性粒细胞为主以中性粒细胞为主以中性粒细胞为主 A B C D 4周周周周：：：：节育器植入物较对照炎症反应重节育器植入物较对照炎症反应重节育器植入物较对照炎症反应重节育器植入物较对照炎症反应重，，，，对照未见急性炎症反应细胞对照未见急性炎症反应细胞对照未见急性炎症反应细胞对照未见急性炎症反应细胞，，，，样样样样 本则仍以急性炎症为主本则仍以急性炎症为主本则仍以急性炎症为主本则仍以急性炎症为主 A C B D 12周周周周：：：：对照和节育器植入物均以慢性炎症反应为主对照和节育器植入物均以慢性炎症反应为主对照和节育器植入物均以慢性炎症反应为主对照和节育器植入物均以慢性炎症反应为主，，，，但以节育器植入物但以节育器植入物但以节育器植入物但以节育器植入物 炎症反应较重炎症反应较重炎症反应较重炎症反应较重，，，，子宫壁增厚子宫壁增厚子宫壁增厚子宫壁增厚，，，，子宫腺破坏较重子宫腺破坏较重子宫腺破坏较重子宫腺破坏较重。。。。 �七、毒代动力学(正在做) 从以上试验和不良事件分析： 含铜面积380还是太大,可能在300以下比较 合适 谢 谢！