猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究——保护剂、溶膜剂和激活剂的选择

采集新鲜血块，加入 保护剂和溶膜剂，冷冻，胶体磨破碎，离心，收集上 清液，加入激活剂，热变，压滤收集液体，有机混合 溶剂除杂，离心，收集上清液，加入1．2倍冷丙酮， 冰箱过夜，离心收集沉淀(SOD)，冷冻干燥，称量 和活性分析。 万方数据 第7卷第3期 猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究(1)——保护弃j、溶膜弃j和激活弃j的选择 31 1．3．3保护剂、溶膜剂和激活剂的配比保护剂： 1．5％乳糖(a)、o．5％13一环糊精(b)、0．25％聚乙二醇 6000(c)。 溶膜剂：3％曲拉通X一100(d)、0．5％正丁醇 (e)、溶菌酶(f)、蛋清(g)。 激活剂：20％氯化铜(h)。 有机混合溶剂：y(乙醇)：y(氯仿)=5：3，一15℃ 冷冻。 2结果与讨论 2．1 保护剂和溶膜剂种类对SOD活性和产率的 影响 血块1000g，按其质量的20％力n入保护剂， 按其质量的15％力i人溶膜剂(其中f取0．2g，蛋 清2个)，按其质量的3％加入激活剂，保持温度 65℃，保温时间15rain做试验，结果见表1。方差 分析结果见表2。 表1 各种保护剂和溶膜剂对SOD活性【(U／mg蛋白)xl000】和产率(‰)的影响 Table1 neeffectofallkindsofprotectiveagentandmembranelytieagentonactivity[(U／ragpro)x1000] andproductiverates(％口)ofSOD 注：t显著，#极显著。 由表2的方差分析可知，A因素(即猪血与牛 护剂种类对SOD产率的影响也达到极显著水平 血)在SOD活性和产率上差异达到极显著水平(P<0．01)，而溶膜剂种类对SOD产率的影响未达 (P<0．01)。B因素(即保护剂和溶膜剂种类)对到显著水平，因此又对它们进行显著性检验，见 SOD活性的影响均达到极显著水平(P<0．01)。保表3。 万方数据 32 中国食品学报 2007年第3期 从显著性检验可知，在猪、牛血中加入组合保 护剂对其SOD活性和产率来说效果好于单用。综 合分析后认为组合剂a+b+c或a+b较好。其中以 a+b+c即：1．5％乳糖、0．5％B一环糊精和0．25％聚 乙二醇使用效果最好。溶膜剂则以d、f或d+e较 好，即：3％曲拉通X一100、溶菌酶或3％曲拉通 X一100+0．5％正丁醇效果较好。溶菌酶价格较高， 牛血以d+e为好，猪血以单独使用d为好。从表3 可知．按此工艺牛血SOD的活性和产率均高于猪 血。 2．2保护剂和溶膜剂用量对SOD活性和产率的 影响 保护剂选择a+b+c，溶膜剂选择d+e，激活剂 选择h加量为3％。保持温度65℃，保温时间15 min．按1．3．2节工艺做试验，结果见表4。数据分 析见表5。 表4保护剂和溶膜剂用量对SOD活性和产率的影响 Table4 Theeffectoftheamountofproductiveandsolventmembraneagentonactivity andproductiveratesofSOD 万方数据 第7卷第3期 猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究(1)——保护剂、溶膜剂和激活剂的选择 33 表5活性和产率的方差分析 Table5 Varianceanalysisofactivityandproductiverates 变异 。， SOD活性，(U·mg。1蛋白)xl(P SOD产率／‰ dr一一皋源 J ss 警 F ss 警 F R晒 R01 注：·显著，··极显著。 由表5的方差分析可知，对于SOD活性，A因 素达到了极显著水平，说明不同的保护剂和溶膜 剂对猪、牛SOD提取影响较大；B因素对SOD活 性影响未达到显著水平，而C因素达到极显著水 平，因此对C因素(即保护剂用量)进行显著性检 验。对于产率，只有B因素达了极显著水平，A因 素和C因素均不显著，因此对B因素(即溶膜剂 用量)进行显著性检验，结果见表6。 表6 活性和产率的显著性检验(SSR法) Table6 Distinctiontestsofactivityandproductiverates(SSRmethod) 保护荆用量 溶膜荆用量 牛血SOD活性／ (U·mg-1蛋白)x103 猪血SOD活性， (U·mg-1蛋白)x103 牛血SOD产率，％。 猪血SOD产率，‰ 处理x 0．05 0．01 处理 ；0．050．01处理x 0．05 0．Ol 处理 ；0．050．01 由表6可知。保护剂用量20％～25％。SOD活 性和产率都高。为节省成本，保护剂用量以20％为 佳，溶膜剂用量以15％～20％较好，产率高。 2．3激活剂用量对SOD活性和产率的影响 按1．3．2节工艺，1000g溶血分别按0．5％、 1．5％、2．5％、3．5％、4．5％加入激活剂(约5．9、17．6、 29．4、41．2和52．9mmol／L)，结果见表7。对数据的 方差分析结果见表8。 方差分析结果表明，尽管CuCl：用量不同， SOD活性和产率均达到显著或极显著水平。显著 性检验结果见表9。 表7 CuCl2用量对SOD活性和产率的影响 Table7’lheeffectoftheamountofCuCl2onactivityandproductiveratesofSOD 万方数据 34 中国食品学报 2007年第3期 牛血活性／(u·m矿蛋白)x103猪血活性，(u-mg-1蛋白)xltP —————————j=———————————————～——————————=■———————————————一 处理 茗0．050．01 处理 省0．050．01 年虹产聱／％0 处理 并0．050．0l 猪血产率1％o 处理 互r 0．05 0．01 41．2 6．364 a 29。4 6．335 a 52．9 5．910 a 17．6 2．385 b 5。9 1．363 c A 29．4 A 41．2 A 52．9 B 17．6 C 5．9 5．439 5．328 4．535 2．041 1。366 17．6 0．225 a 29．4 0。221 a 41．2 0．208 a 5．9 0．206 a 52．9 0．139 b A 41．2 0．209 A 29。4 0．203 A 17．6 0．197 A 5．9 0．159 A 52．9 0．130 从表9可知，对于SOD活性，牛血29．4～52．9 mmol／L、猪血29．4～41．2mmol／L之间差异不显著。 因此激活剂的加入量为2．5％～3．5％(29．4～41．2 mmol／L)。对于产率，5。9～41．2mmo]]L之间差异不 显著，综合分析后认为选择激活剂2．5％(29．4 mmoUL)为宜。 3结论 (1)保护剂的主要功能是防止SOD失活即延 长半衰期。SOD离开动物体内，便逐渐失活，因此 创造1个良好的环境是提取SOD的关键。本试验 选择的保护剂能够创造1个良好的缓冲环境。另 有资料表明，乳糖、B一环糊精还具有修饰作用[13～ 141，使SOD的衰期延长。猪、牛血保护剂以1． 5％乳糖(a)、0．5％13一环糊精(b)和0．25％聚乙二醇 6000(c)混合加入为好，其加量以血块质量的20％ 最佳。 (2)破膜、溶膜也是SOD提取的关键。使用溶 膜剂是因为SOD被红细胞膜包被，通过机械法难 以破膜。采用冻融交替法易使SOD失活。采用吸 水膨胀法效果较好。但加入2倍体积的去离水后 再用有机溶剂除杂和丙酮沉淀时所消耗的溶剂量 大，成本较高。本文采用溶膜剂结合机械法，30 rain细胞膜全部破裂(显微镜检结果)，效果好。使 用蛋清和溶菌酶虽然效果也较好．但因成本高而 不易推广。溶膜剂：牛血以3％曲拉通X一100(d)+ 0．5％正丁醇(e)、猪血以3％曲拉通X一100(d)为 好。其加量以血块质量的15％～20％为佳。 (3)当激活剂CuCl2用量在17。6-41．2mmol／L 时，SOD活性和产率都较高。这是由于在SOD构 象中，Cu“是活性中心，在热变过程中部分Cu2+从 SOD中脱落．因此适当补充Cuz+有助于保持SOD 活性的稳定。金属辅基Cu2+的存在对SOD的热稳 定性有保护作用，但Cu2+过多(大于52．9mmol／L) 时SOD的比活和收率均下降。这是因为Cu2+作为 重金属同样具有除杂作用，在形成“架桥”过程中， 导致部分SOD变性而被除去。激活剂加量以血块 质量的2．5％最佳。 (4)本工艺简便易行，省去了采血加入抗凝剂 和离心分离血球步骤，且采用溶膜剂溶血的方法 效果好、成本较低、简便易行，适合规模化生产。 (5)按此工艺生产的SOD产品，经检验其活 性在3000U／mg蛋白以上。从牛血提取的SOD活 性和产率均高于猪血。 A A A A A a a a a b A A B C C a a b C d 万方数据 第7卷第3期 猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究(1)——保护剂、溶膜剂和激活剂的选择 35 参考文献 1．JoeM．McCord，IrwinFridovich．Superoxidedismutase：Anenzymicfunctionfurerythrthrocuprein[J】．neJournalof BiologicalChemistry，1969，244(22)：6049-6065 2．FridovichI．Superoxideradical：anendogenoustoxicant[J】．AnnuRev．PharmacolToxiool，1983，23：239—257 3．TolmasoffJ M，OneT，CutierRG． SotIeroxideDismutasecorrelationwithlife—spanandspecificmetabolicratein primatespecies[J】．Proc．Natl．Acad．SciUSA，1980，77：l777—2781 4．汪立耀．超氧化物歧化酶的制备极其临床应用[J】．武汉化工学院学报，2003，25(4)：16～18 5．GartnerA，HaitmannHJ，WesesU．Asimple，rapidandefficientisolationoferythrocyteCu，Zn—supemxidedismu— tasefJ】．Biochem．J．，1984，221：549-551 6．杜秀敏，殷文璇，赵彦修等．超氧化物歧化酶(SOD)研究进展[J】．中国生物工程杂志，2003，23(1)；48—50，74 7．杨明琰，张晓猗，沈俭等．微生物超氧化物歧化酶研究进展[J】．微生物学杂志，2004，24(1)：49—51 8．张良，薛刚，黄开勋．利用牛血块分离提取铜锌超氧化物歧化酶的工艺研究叨．天然产物研究与开发，2004，16 (4)；334-337 9．袁勤生，金新银．超氧化物歧化酶的来源及制备工艺【J】．中国药学杂志，1989，24(7)：395～397 10．雷建都，李蓉，陈国亮等．用柱色谱纯化牛红血球超氧化物歧化酶『J1．西北大学学报，1999，29(2)，133-135 11．凌敏，蔡丹昭，苏上贵等．猪血超氧化物歧化酶、血红素和蛋白胨分离制备的研究[J】．广西医科大学学报，2005， 22(3)：363-364 12．张波，庞第，王全林．牛血中SOD的提取技术研究[J】．宁夏大学学报(自然科学版)，2002，23(1)：69—70 13．袁勤生，陈吉祥．B一环糊精修饰铜锌一超氧化物歧化酶的研究【J】．药物生物技术，1996，3(3)：87～90 14．铁翠娟，张怀，张博润等．修饰SOD与未修饰SOD的稳定性比较[J】．微生物学通报，1999，26(2)：96—98 15．刘利东，邹国林，朱汝潘．高纯度超氧化物歧化酶制备方法的改进[J】．沈阳药学院学报，1991，8(3)：196-197 16．饶欣欣，王惠嫒，吴小林等．免疫亲和层析分离、纯化重组人铜锌超氧化物歧化酶的纯化[J】．生化药物杂志， 1991，55(1)：24—26 17．刘建荣，静天玉．以自制铜螯合亲和层析柱纯化牛血铜锌超氧化物歧化酶【J】．河北大学学报(自然科学版)， 1994，14(1)：76-78 18．谢卫华，姚菊芳，袁勤生．连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的改进【J】．医药工业，1988，19(5)： 217-219 StudiesOiltheExtractionTechniqueofSuperoxideDismutasefromPigandBovineBloodBlock(1) ——’IheSelectionsofProtectiveAgent．MembranelyticLyricAgentandActivator GuoShuxianWangDongmeiXueGangLiuFengxiaGaoWeixia (SchoolofBiochemicalEngineering，Nanyanginstituteoftechnology，Nanyang473004) AbstractObjective：Tostudytheeffectofprotectiveagent，membranelyticagentandactivatoronSODextracted frompigandbovinebloodblock．Method：Doubleandthreefactortestdesignswereadopted．Results：Thegapofactive andproductiveratesofSODbetweenpigandbovinebloodblockreachedveryobviouslevel(P<0．01)；Themixturepro— tectiveagentwasbetterthansingle，thebestwas1．5％galactosylglucose(a)+0．5％15-cyclodextrin(b)+0．25％PEG (c)，andthebettermembranelyticagentwas3％TritonX-100(d)+0．5％n—butanol(e)forbovineblood，and3％ TritonX一100(d)forpigblood．TheoptimaldosageofprotectiveagentWas20％ofbloodblockweight，theoptimal dosageofmembranelyticagentwas15％一20％ofbloodblockweight．andthebestoptimaldosageofactivatorwas 2．5％．Conclusion：’rhistechniquenotonlyomiaedtheanticoagulantandcentrifugationforseparationofbloodcell，but alSOeffectivelyadoptsmembranelyticagentandmechanismmethodforhaemolysisatlowercostandconveniencetofit 万方数据 36 中国食品学报 2007年第3期 massproduction．Asaresult，thehigherpuritySODwasobtained，whoseactivityexceeded3000U／mgprotein，theac- tivityandproductiveratesofSODextractedfrombovinebloodblockwerehigherthanpigbloodblock． KeywordsPigandbovinebloodblockSODActiveandproductiveratesProtectiveagentMembranelyrica_ gentActivatorExtraction 市场动态 去年全球葡萄酒消费量继续增长 总部设在法国巴黎的国际葡萄与葡萄酒组织近日公布了一项调查结果：去年全球葡萄酒消费量继 续保持良好的上升势头，各国间葡萄酒贸易的增加也证明该行业已经适应全球化的发展。 数据显示，去年全球葡萄酒消费量达到了240．8亿升，比2005年增长1．4％，而2005年的同比增长 率仅为01％。 各国葡萄酒消费市场呈现出不同的特点。法国依然是最大的葡萄酒消费市场，去年法国人喝掉了 32．8亿升葡萄酒，平均每人年消费葡萄酒55升左右。紧随其后的是意大利、美国、德国和西班牙，中国和 印度这两个世界上人口最多的国家成为葡萄酒消费新的增长点，英国和北欧国家的葡萄酒消费量停滞 不前。 在葡萄酒产量方面，意大利以微弱的优势领先法国，西班牙和美国分列三、四位。葡萄酒产量较大的 国家还有阿根廷、澳大利亚、南非和德国。 在葡萄酒出口方面，意大利仍居世界第一，其次是法国和西班牙。美国、阿根廷、智利、南非、澳大利 亚和新西兰等国近年来葡萄酒出口增长迅速，其累计市场份额由25年前的1．6％迅速攀升至26％。 国际葡萄与葡萄酒组织是1924年成立于巴黎的政府间国际组织，由符合一定的优秀葡萄及葡 萄酒生产国组成。该组织是国际葡萄酒业的权威机构，主要任务是协调各成员国之间的葡萄酒贸易、组 织讨论科研成果以及制定符合国际葡萄酒发展潮流的技术标准等。 (消息来源：《中国食品报》) 万方数据 猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究(1)——保护剂、溶膜 剂和激活剂的选择 作者： 郭书贤， 王冬梅， 薛刚， 刘凤霞， 高伟霞， Guo Shuxian， Wang Dongmei， Xue Gang ， Liu Fengxia， Gao Weixia 作者单位： 南阳理工学院生物与化学工程学院,河南南阳,473004 刊名： 中国食品学报 英文刊名： JOURNAL OF CHINESE INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY 年，卷(期)： 2007,7(3) 被引用次数： 1次 参考文献(18条) 1.Joe M McCord.Irwin Fridovich Superoxide dismutase:An enzymic function for erythrthrocuprein 1969(22) 2.Fridovich I Superoxide radical:an endogenous toxicant 1983 3.Tolmasoff J M.One T.Cutier R G Superoxide Dismutase correlation with life-span and specific metabolic rate in primate species 1980 4.汪立耀 超氧化物歧化酶的制备极其临床应用[期刊论文]-武汉化工学院学报 2003(04) 5.Gartner A.Haitmann H J.Weses U A simple,rapid and efficient isolation of erythrocyte Cu,Zn- superoxide dismutase 1984 6.杜秀敏.殷文璇.赵彦修 超氧化物歧化酶(SOD)研究进展[期刊论文]-中国生物工程杂志 2003(01) 7.杨明琰.张晓猗.沈俭 微生物超氧化物歧化酶研究进展[期刊论文]-微生物学杂志 2004(01) 8.张良.薛刚.黄开勋 利用牛血块分离提取铜锌超氧化物歧化酶的工艺研究[期刊论文]-天然产物研究与开发 2004(04) 9.袁勤生.金新银 超氧化物歧化酶的来源及制备工艺 1989(07) 10.雷建都.李蓉.陈国亮 用柱色谱纯化牛红血球超氧化物歧化酶 1999(02) 11.凌敏.蔡丹昭.苏上贵 猪血超氧化物歧化酶、血红素和蛋白胨分离制备的研究[期刊论文]-广西医科大学学报 2005(03) 12.张波.庞第.王全林 牛血中SOD的提取技术研究[期刊论文]-宁夏大学学报（自然科学版） 2002(01) 13.袁勤生.陈吉祥 β-环糊精修饰铜锌-超氧化物歧化酶的研究 1996(03) 14.铁翠娟.张怀.张博润 修饰SOD与未修饰SOD的稳定性比较 1999(02) 15.刘利东.邹国林.朱汝潘 高纯度超氧化物歧化酶制备方法的改进[期刊论文]-沈阳药学院学报 1991(03) 16.饶欣欣.王惠媛.吴小林 免疫亲和层析分离、纯化重组人铜锌超氧化物歧化酶的纯化 1991(01) 17.刘建荣.静天玉 以自制铜螯合亲和层析柱纯化牛血铜锌超氧化物歧化酶[期刊论文]-河北大学学报(自然科学版) 1994(01) 18.谢卫华.姚菊芳.袁勤生 连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的改进 1988(05) 引证文献(1条) 1.王冬梅.郭书贤.薛刚.刘凤霞.高伟霞 猪牛血块超氧化物歧化酶提取工艺研究(2)——热变温度和时间对SOD提取 的影响及最佳工艺条件选择[期刊论文]-中国食品学报 2007(5) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgspxb200703005.aspx