:2003年 4月第20卷第4期 hin J Exp Surg,April 2003,Vol 20,No.4
组织工程心脏瓣膜研究进展
宋强 史嘉玮 董念 国 孙 宗全
临床治疗心脏瓣膜病常用瓣膜替代
物各有缺点:机械瓣需终身抗凝,易致出
血、栓塞及感 染;异种生物瓣 易退行性
变,10~15年需再次手术;同种生物瓣易
钙化,来源短缺。而非生长性是以上瓣
膜 共 有 缺 陷。组 织 工 程 心 脏 瓣 膜
(TEHV)按照组织工程学
,利用可降
解材料构建瓣膜支架,种植的 自体细胞
在 支 架 上 生 长 并 产 生 细 胞 外 基 质
(ECM),逐渐形成活的瓣膜组织。它有
良好的组织相容性,可避免血栓栓塞、钙
化等问
,有 自我修 复能力,随机体 生
长。因此被认为是较理 想的新型瓣膜替
代物。 自1995年 Shinoka等⋯首次将单
叶 TEHv羊肺动脉瓣 自体移植,TEHV
研究广受瞩 目,1999年被美国心脏病协
会评为全球 心脑血管领域十大进展之
一 【2]
,现将此方面研究作一概述。
一
、支架材料
理论上 TEHv支架材料,不仅生物
相容性好,表面利于种子细胞粘附增殖,
而且机械性能优 良,能承受高速血流造
成的张力和剪切力,有足够柔韧性供瓣
膜启闭。目前集中在以下几种类型:
1、合成高分子 降解材料:Zund等【3 J
最早 采 用聚 羟基 乙 酸 (PGA)、聚乳 酸
(PLA)及 二 者共 聚 物 (PLGA)等构 建
TEHv,此类材料组织相容性和可降解性
较好,但 质厚 而 硬,韧 性不 够。Sodian
等【4 J比较 PGA、聚羟基烷酯(PHA)和聚
4.羟基丁酯(P4邶 ),认为 PHA弹性和机
械强度超过以往所有材料。近来研发第
3代改良 PHA,如 3.羟基丁酸、3 羟基 已
酸无规嵌段共聚物[P(3HB co-3HH)],通
过调节 3HH 含量,获得有一定强度 、韧
性、降解快 、热 塑性 及相容性 好的共聚
物,应用前景 良好[51。高分子材料可人
为控制分子量、降解时间及表面处理等,
故研究很多,但它还远淡不上理想,潜在
免疫原性、降解物毒性 、致炎性、价格贵
作者单位:430022武汉,华中科技大学同
济医学院附属协和医院心血管外科
等弊病有待解决【6 J。
2.去细胞生物源性支架 :戊二醛固
定异种生物瓣免疫排斥性小,耐久性佳,
但不能生长更新,残留戊二醛毒性大;低
温保存 同种生物瓣基本保持组织 完整
性,但无活性,且不能使宿主细胞迁移。
于是想到在去细胞同种或异种瓣上种植
人体细胞以构建 TEHV,虽然这种支架
不能体内降解,但也应用了组织工程学
基本原理[ ,引。现 以猪主动脉瓣和牛心
包瓣研究最多。将新鲜猪瓣经去垢剂、
核酸酶或胰蛋 白酶/乙二胺四乙酸(ED—
TA)等处理,原有活细胞几乎都被除去,
余下 3.D结构既适 于种植种子细胞,也
为邻近细胞迁移、生长、分化提供较好的
微环境【8]。生物材料结构功能上和正常
瓣膜 ECM 相似,能促进或维持种子细胞
生长,经处理,力学强度优 良,但如何解
决完全去除细 胞、天然材料可控性差及
潜在免疫原性、安全性等问题有待摸索。
3.其他类型:Ye等I ]将纤维蛋 白原
和人成纤维细胞混合制成厚 1 mm细胞一
纤维蛋白胶结构,在抑肽酶控制下培育
出以成纤 维细 胞分 泌 ECM 作支 架 的
TEHv,不致免疫反应,降解无毒性,但力
学特性有待提高。赵东锷等【10J采用胶
原膜支架构建 TEHV,体内实验结果显
示 12周末胶原膜完全吸收,并被种子细
胞及其 ECM 取代,但强度仍需改进。
二、种子细胞来源
TEHV种子细胞应具有以 下特 点:
易培养,粘附性强;结构和功能与正常瓣
膜细胞接近 ;易获取,实用性强。目前一
般来 自瓣膜受体自身。
1.内皮:血管 内皮细胞被认为是最
理想的组织工程细胞,可使 TEHV有正
常内皮功能,但不同部位起源在表型、抗
原、代谢特征及对生长因子反应等方面
有明显差异。动脉内皮较静脉厚、形态
,其中主动脉内皮细胞与心脏瓣膜
一 样处于高压环境,较 心耳毛细血管和
主动脉滋养血 管更适合,但获取相对困
难【 。Gino等I 】单克隆抗体法鉴定大
· 381 ·
· 综 述 ·
隐静脉和主动脉 内皮,二者细胞骨架蛋
白和收缩蛋白结构相似,又表 浅静脉 内
皮易取 材,故 已被 广 泛采 用。Paranya
等【1 ]发现主动脉瓣 内皮细胞一 定条件
下转化为间充质细胞,表现为对血小板
生长因子(PDGF)有反应,生成 平滑肌
肌动蛋白 (a.SMA)等,提示种植的 内皮
细胞可转化为肌成纤维细胞。设想通过
基因工程改造 内皮细胞,使之不表达特
异性抗原,然后建立
细胞库以促进
TEHV产业 化。
2.成 纤维 或肌成纤维 细胞 :Taylor
等【1 ]认为瓣膜 问质主要由两 种状态肌
纤维母细胞组成,一种 胞质 内含大量张
力纤维且 a.SMA 阳性,即平滑肌细胞特
征 ;另一种含大量分泌细胞器且脯氨酸
羟化酶阳性,即成纤维细胞特征。成纤
维细胞对产生和维持 ECM 起重要作用,
持续应力下还可改变表型,表达肌成纤
维细胞特征。研究结果显示人体大动脉
肌成纤维细胞所制 TEHV,生物学特性
接近正常 瓣膜【 。Zund等【 ]证 明 自体
血管成纤维细胞制成 TEHV能与内皮细
胞产生协同作用,不仅加快生长速度,且
增强细胞粘 附性 和对外力的应 答及抵
抗。
3.干细胞及其他克隆技术使胚胎干
细胞用于组织工程成为可能,但伦理等
问题使其应用受限。而 自体源性 骨髓干
细胞,如骨髓基质细胞和外周血 来源的
CD3 细胞,一定条件下分化为间质细胞
和内皮细胞,且分离提取容易,体外扩增
迅速。在血管 内皮新生、心肌组织修复和
器官重建等方面显示 巨大潜能ItS]。Shi—
noka等【1 6J采用羊表皮与股动脉 内皮构
建 TEHv,两组瓣叶均存活,胶原含量和
物理特性相似,但表皮组瓣叶成分排列
杂乱,内皮组更接近 正常瓣膜结构。研
究认为改变生存环境,体表上皮及间质
细胞与大网膜间皮细胞都可成为较好的
种子细胞。
三、细胞的分离、培养和种植
TEHv细胞学技术主要分 3类 :(1)
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分别提取、分别培养、分层种植,即取得
新鲜 组织后对 内皮和 间质细胞 分别提
取,各 自培养,种植 顺序是先 间 质后 内
皮;(2)混合提取、分别培养、分 层种植,
即将内皮和 间质细胞一起提取,体外标
记乙酰低密度脂蛋白,再用流式细胞仪
分离,最后分别扩增、分层种植 ;(3)混合
提取、联合培养、混合种植,即一并提取
两种细胞,不分离培养,再无序种植到支
架表面。现在更倾 向于第 3种方式,因
为研究发现杂乱无序的种子细胞在体内
能 自动分层,内皮细胞分布到表面,成纤
维细胞分布到 内层,且细胞长轴与血流
方向平行,步骤简化,降低污染可能【"]。
细胞与支架的粘附取决于二者物理和化
学性质。前者呈非特异性,如材料表面形
态、粗糙程度、静电斥力、立体结构稳定
性等,后者呈特异性,钙粘素、整合素、免
疫球蛋白超家族粘附分子等 起重要作
用。Ye等[18]用同种 ECM 包埋 PGA,层
连蛋白、纤维粘连蛋白等 ECM 成分滞留
于支架,与种子细胞表面整合素特异性
结合,吸附细胞数量增 加 48%,且 间隔
24~36 h的多次接种较单次 吸附数量
多,可能因为前期接种细胞产生粘 附分
子提高后期接种细胞粘附率。培养皿静
态培养的组织较 活体有 明显不足,如种
植细胞易脱落,瓣膜性能远达不到正常
主动脉瓣要求等。故 Ralf等【l7]提 出体
外模拟体内血液流体力场,期望通过适
应仿真环境,构建能抵抗血流应力、支架
材料充分降解而免除宿主反应、功能完
整的 TEHV,即所谓“预调”。在此基础
上的生物反应器提供生理性压力和营养
介质及脉动流,适合较长时间 TEHV构
建过程,但体外如何尽量模拟体 内环境
还需深入探讨。
四、移植实验
目前 TEHV研究尚限于肺动脉瓣。
Hoerstrup等【1 9_将种植 自体肌纤维母细
胞和内皮细胞三叶TEHV植入羊肺动脉
瓣区,超声心动图提示瓣膜活动正常,无
狭窄、血栓或动脉瘤形成,术后 8周支架
完全降解,20周瓣叶表面均匀覆盖一层
内皮细胞。Stock等[ JPHA上种植内皮
和肌成纤维细胞体外构建右室流出道,
缝三Ⅱ卡TEHV组成带瓣 管道,植入实验
羊 24周未 见血 栓 形 成及 瓣 膜 反 流。
Goldstein等_2 将 3个匹配 的去细胞猪
中华实验外科杂志 2003年 4月第 2O卷第 4期 Chin JExp Su嚷,April 2003,Vol 20。No.4
无冠瓣缝制成无支架瓣,体外
瓣膜
开 口面积及压差接近正常主动脉瓣,植
入羊右室流出道 336 d,宿主细胞覆盖区
域达 60%~80%,且细胞密度和正常组
织 相 似,超 声 显 示 瓣 膜 功 能 良 好。
Dohmen等【 ]将种植自体大 隐静脉内皮
的去细胞猪瓣植入 6例 Ross术患者肺动
脉瓣区,临床效果满意。
五、相关研究
整合素家族是介导 ECM 与细胞相
互作用最主要的受体,参予成纤维细胞
增殖和 胶原合 成,而细 胞 间粘 附分子
(ICAM)、选 择素(E—selection)等参予 启
动免疫反应,诱导 炎性 因子激活和细胞
聚集,故粘附分子对 TEHv构建和植入
的影响,值得进一步研究【l8]。瓣膜组织
中胶原与纤维粘连蛋 白、层粘连蛋白、弹
性蛋白、蛋 白聚糖等共 同构成 ECM,胶
原纤维通过调整皱褶间距保证瓣膜正常
启闭,故胶原蛋白含量、比例和结构是决
定 TEHV力学强度重要因素。培养基中
加入 抗 坏 血 酸、血 管 内 皮 生 长 因 子
(VEGF)、碱性成纤维生长因子 (hFGF)
等能促进体外培养的胶原合成【 。
总之,TEHv研究是一项复杂 的系
统工程,虽取得令人鼓舞的成绩,但与应
用尚有距离,如现有支架材料强度不够
或过大,不能承受体循环压力,易损伤表
面细胞;如何选取合适支架,最佳种子细
胞数目,培养液成分;体外培养细胞生物
学性能的保存和表 达,与 ECM、支架相
互作用;TEHV的保存,如何建立“组织
工程银行”等等。
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(收稿 日期 :2002.05 22)
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