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组织心脏心脏瓣膜的研究进展

2011-04-11 2页 pdf 148KB 36阅读

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组织心脏心脏瓣膜的研究进展 :2003年 4月第20卷第4期 hin J Exp Surg,April 2003,Vol 20,No.4 组织工程心脏瓣膜研究进展 宋强 史嘉玮 董念 国 孙 宗全 临床治疗心脏瓣膜病常用瓣膜替代 物各有缺点:机械瓣需终身抗凝,易致出 血、栓塞及感 染;异种生物瓣 易退行性 变,10~15年需再次手术;同种生物瓣易 钙化,来源短缺。而非生长性是以上瓣 膜 共 有 缺 陷。组 织 工 程 心 脏 瓣 膜 (TEHV)按照组织工程学方法,利用可降 解材料构建瓣膜支架,种植的 自体细胞 在 支...
组织心脏心脏瓣膜的研究进展
:2003年 4月第20卷第4期 hin J Exp Surg,April 2003,Vol 20,No.4 组织工程心脏瓣膜研究进展 宋强 史嘉玮 董念 国 孙 宗全 临床治疗心脏瓣膜病常用瓣膜替代 物各有缺点:机械瓣需终身抗凝,易致出 血、栓塞及感 染;异种生物瓣 易退行性 变,10~15年需再次手术;同种生物瓣易 钙化,来源短缺。而非生长性是以上瓣 膜 共 有 缺 陷。组 织 工 程 心 脏 瓣 膜 (TEHV)按照组织工程学,利用可降 解材料构建瓣膜支架,种植的 自体细胞 在 支 架 上 生 长 并 产 生 细 胞 外 基 质 (ECM),逐渐形成活的瓣膜组织。它有 良好的组织相容性,可避免血栓栓塞、钙 化等问,有 自我修 复能力,随机体 生 长。因此被认为是较理 想的新型瓣膜替 代物。 自1995年 Shinoka等⋯首次将单 叶 TEHv羊肺动脉瓣 自体移植,TEHV 研究广受瞩 目,1999年被美国心脏病协 会评为全球 心脑血管领域十大进展之 一 【2] ,现将此方面研究作一概述。 一 、支架材料 理论上 TEHv支架材料,不仅生物 相容性好,表面利于种子细胞粘附增殖, 而且机械性能优 良,能承受高速血流造 成的张力和剪切力,有足够柔韧性供瓣 膜启闭。目前集中在以下几种类型: 1、合成高分子 降解材料:Zund等【3 J 最早 采 用聚 羟基 乙 酸 (PGA)、聚乳 酸 (PLA)及 二 者共 聚 物 (PLGA)等构 建 TEHv,此类材料组织相容性和可降解性 较好,但 质厚 而 硬,韧 性不 够。Sodian 等【4 J比较 PGA、聚羟基烷酯(PHA)和聚 4.羟基丁酯(P4邶 ),认为 PHA弹性和机 械强度超过以往所有材料。近来研发第 3代改良 PHA,如 3.羟基丁酸、3 羟基 已 酸无规嵌段共聚物[P(3HB co-3HH)],通 过调节 3HH 含量,获得有一定强度 、韧 性、降解快 、热 塑性 及相容性 好的共聚 物,应用前景 良好[51。高分子材料可人 为控制分子量、降解时间及表面处理等, 故研究很多,但它还远淡不上理想,潜在 免疫原性、降解物毒性 、致炎性、价格贵 作者单位:430022武汉,华中科技大学同 济医学院附属协和医院心血管外科 等弊病有待解决【6 J。 2.去细胞生物源性支架 :戊二醛固 定异种生物瓣免疫排斥性小,耐久性佳, 但不能生长更新,残留戊二醛毒性大;低 温保存 同种生物瓣基本保持组织 完整 性,但无活性,且不能使宿主细胞迁移。 于是想到在去细胞同种或异种瓣上种植 人体细胞以构建 TEHV,虽然这种支架 不能体内降解,但也应用了组织工程学 基本原理[ ,引。现 以猪主动脉瓣和牛心 包瓣研究最多。将新鲜猪瓣经去垢剂、 核酸酶或胰蛋 白酶/乙二胺四乙酸(ED— TA)等处理,原有活细胞几乎都被除去, 余下 3.D结构既适 于种植种子细胞,也 为邻近细胞迁移、生长、分化提供较好的 微环境【8]。生物材料结构功能上和正常 瓣膜 ECM 相似,能促进或维持种子细胞 生长,经处理,力学强度优 良,但如何解 决完全去除细 胞、天然材料可控性差及 潜在免疫原性、安全性等问题有待摸索。 3.其他类型:Ye等I ]将纤维蛋 白原 和人成纤维细胞混合制成厚 1 mm细胞一 纤维蛋白胶结构,在抑肽酶控制下培育 出以成纤 维细 胞分 泌 ECM 作支 架 的 TEHv,不致免疫反应,降解无毒性,但力 学特性有待提高。赵东锷等【10J采用胶 原膜支架构建 TEHV,体内实验结果显 示 12周末胶原膜完全吸收,并被种子细 胞及其 ECM 取代,但强度仍需改进。 二、种子细胞来源 TEHV种子细胞应具有以 下特 点: 易培养,粘附性强;结构和功能与正常瓣 膜细胞接近 ;易获取,实用性强。目前一 般来 自瓣膜受体自身。 1.内皮:血管 内皮细胞被认为是最 理想的组织工程细胞,可使 TEHV有正 常内皮功能,但不同部位起源在表型、抗 原、代谢特征及对生长因子反应等方面 有明显差异。动脉内皮较静脉厚、形态 ,其中主动脉内皮细胞与心脏瓣膜 一 样处于高压环境,较 心耳毛细血管和 主动脉滋养血 管更适合,但获取相对困 难【 。Gino等I 】单克隆抗体法鉴定大 · 381 · · 综 述 · 隐静脉和主动脉 内皮,二者细胞骨架蛋 白和收缩蛋白结构相似,又表 浅静脉 内 皮易取 材,故 已被 广 泛采 用。Paranya 等【1 ]发现主动脉瓣 内皮细胞一 定条件 下转化为间充质细胞,表现为对血小板 生长因子(PDGF)有反应,生成 平滑肌 肌动蛋白 (a.SMA)等,提示种植的 内皮 细胞可转化为肌成纤维细胞。设想通过 基因工程改造 内皮细胞,使之不表达特 异性抗原,然后建立细胞库以促进 TEHV产业 化。 2.成 纤维 或肌成纤维 细胞 :Taylor 等【1 ]认为瓣膜 问质主要由两 种状态肌 纤维母细胞组成,一种 胞质 内含大量张 力纤维且 a.SMA 阳性,即平滑肌细胞特 征 ;另一种含大量分泌细胞器且脯氨酸 羟化酶阳性,即成纤维细胞特征。成纤 维细胞对产生和维持 ECM 起重要作用, 持续应力下还可改变表型,表达肌成纤 维细胞特征。研究结果显示人体大动脉 肌成纤维细胞所制 TEHV,生物学特性 接近正常 瓣膜【 。Zund等【 ]证 明 自体 血管成纤维细胞制成 TEHV能与内皮细 胞产生协同作用,不仅加快生长速度,且 增强细胞粘 附性 和对外力的应 答及抵 抗。 3.干细胞及其他克隆技术使胚胎干 细胞用于组织工程成为可能,但伦理等 问题使其应用受限。而 自体源性 骨髓干 细胞,如骨髓基质细胞和外周血 来源的 CD3 细胞,一定条件下分化为间质细胞 和内皮细胞,且分离提取容易,体外扩增 迅速。在血管 内皮新生、心肌组织修复和 器官重建等方面显示 巨大潜能ItS]。Shi— noka等【1 6J采用羊表皮与股动脉 内皮构 建 TEHv,两组瓣叶均存活,胶原含量和 物理特性相似,但表皮组瓣叶成分排列 杂乱,内皮组更接近 正常瓣膜结构。研 究认为改变生存环境,体表上皮及间质 细胞与大网膜间皮细胞都可成为较好的 种子细胞。 三、细胞的分离、培养和种植 TEHv细胞学技术主要分 3类 :(1) 可 网疆 颤T 维普资讯 http://www.cqvip.com - 382 · 分别提取、分别培养、分层种植,即取得 新鲜 组织后对 内皮和 间质细胞 分别提 取,各 自培养,种植 顺序是先 间 质后 内 皮;(2)混合提取、分别培养、分 层种植, 即将内皮和 间质细胞一起提取,体外标 记乙酰低密度脂蛋白,再用流式细胞仪 分离,最后分别扩增、分层种植 ;(3)混合 提取、联合培养、混合种植,即一并提取 两种细胞,不分离培养,再无序种植到支 架表面。现在更倾 向于第 3种方式,因 为研究发现杂乱无序的种子细胞在体内 能 自动分层,内皮细胞分布到表面,成纤 维细胞分布到 内层,且细胞长轴与血流 方向平行,步骤简化,降低污染可能【"]。 细胞与支架的粘附取决于二者物理和化 学性质。前者呈非特异性,如材料表面形 态、粗糙程度、静电斥力、立体结构稳定 性等,后者呈特异性,钙粘素、整合素、免 疫球蛋白超家族粘附分子等 起重要作 用。Ye等[18]用同种 ECM 包埋 PGA,层 连蛋白、纤维粘连蛋白等 ECM 成分滞留 于支架,与种子细胞表面整合素特异性 结合,吸附细胞数量增 加 48%,且 间隔 24~36 h的多次接种较单次 吸附数量 多,可能因为前期接种细胞产生粘 附分 子提高后期接种细胞粘附率。培养皿静 态培养的组织较 活体有 明显不足,如种 植细胞易脱落,瓣膜性能远达不到正常 主动脉瓣要求等。故 Ralf等【l7]提 出体 外模拟体内血液流体力场,期望通过适 应仿真环境,构建能抵抗血流应力、支架 材料充分降解而免除宿主反应、功能完 整的 TEHV,即所谓“预调”。在此基础 上的生物反应器提供生理性压力和营养 介质及脉动流,适合较长时间 TEHV构 建过程,但体外如何尽量模拟体 内环境 还需深入探讨。 四、移植实验 目前 TEHV研究尚限于肺动脉瓣。 Hoerstrup等【1 9_将种植 自体肌纤维母细 胞和内皮细胞三叶TEHV植入羊肺动脉 瓣区,超声心动图提示瓣膜活动正常,无 狭窄、血栓或动脉瘤形成,术后 8周支架 完全降解,20周瓣叶表面均匀覆盖一层 内皮细胞。Stock等[ JPHA上种植内皮 和肌成纤维细胞体外构建右室流出道, 缝三Ⅱ卡TEHV组成带瓣 管道,植入实验 羊 24周未 见血 栓 形 成及 瓣 膜 反 流。 Goldstein等_2 将 3个匹配 的去细胞猪 中华实验外科杂志 2003年 4月第 2O卷第 4期 Chin JExp Su嚷,April 2003,Vol 20。No.4 无冠瓣缝制成无支架瓣,体外瓣膜 开 口面积及压差接近正常主动脉瓣,植 入羊右室流出道 336 d,宿主细胞覆盖区 域达 60%~80%,且细胞密度和正常组 织 相 似,超 声 显 示 瓣 膜 功 能 良 好。 Dohmen等【 ]将种植自体大 隐静脉内皮 的去细胞猪瓣植入 6例 Ross术患者肺动 脉瓣区,临床效果满意。 五、相关研究 整合素家族是介导 ECM 与细胞相 互作用最主要的受体,参予成纤维细胞 增殖和 胶原合 成,而细 胞 间粘 附分子 (ICAM)、选 择素(E—selection)等参予 启 动免疫反应,诱导 炎性 因子激活和细胞 聚集,故粘附分子对 TEHv构建和植入 的影响,值得进一步研究【l8]。瓣膜组织 中胶原与纤维粘连蛋 白、层粘连蛋白、弹 性蛋白、蛋 白聚糖等共 同构成 ECM,胶 原纤维通过调整皱褶间距保证瓣膜正常 启闭,故胶原蛋白含量、比例和结构是决 定 TEHV力学强度重要因素。培养基中 加入 抗 坏 血 酸、血 管 内 皮 生 长 因 子 (VEGF)、碱性成纤维生长因子 (hFGF) 等能促进体外培养的胶原合成【 。 总之,TEHv研究是一项复杂 的系 统工程,虽取得令人鼓舞的成绩,但与应 用尚有距离,如现有支架材料强度不够 或过大,不能承受体循环压力,易损伤表 面细胞;如何选取合适支架,最佳种子细 胞数目,培养液成分;体外培养细胞生物 学性能的保存和表 达,与 ECM、支架相 互作用;TEHV的保存,如何建立“组织 工程银行”等等。 参 考 文 献 1 Shinoka T。Breuer CK.Tissue engineering heart valve.1eaflet replacement study in a lamb mode1.Ann Thora Surg,1995。60: 513.516. 2 董念国。孙宗全。付平。等.组织工程心脏 瓣膜构建的研 究.中华 实验外科 杂志。 2002。19:88.90. 3 Zund G。Breuer CK。Shinoka T.The in vitro construction of a tissue engineered biopros. thetic heart valve.Eur J Cardiothorac Surg。 1997,11:493.497. 4 Sodian R,Sperling JS,Martin DP。et a1. Fabfication of trileaflet heart valve scaffold from a polyhydroxyalkanoate biopolyester for use in tissue engineering.Tissue Eng, 2000.6:183.188. 5 胡平,陈江睿。高峰.组织工程心脏瓣膜 PHA类支架材料研究进展.组织工程人 工心脏瓣膜研讨会汇编。2001。26.27. 6 Ye Q。Zund G。Jockenhoevel S。et a1.Tissue engineering in cardiovascular surgery:new approach to develop tompJetely human au- tologous tissue.Eur J Cardio thorac Surg, 2000,17:449.459. 7 BaderA,Steinbo ffG,StrohlK,eta1.Engi. neering of human vascular aortic tissue based on a xenogenic starter matrix.Trails. plantation,2o00。70:7.14. 8 SteinfoffG,StockU,Karim N,et a1.Tissue engineering ofpulmonary heart valves onal- logenic acellulal-matrix con duits:in vivo restoration of valve tissue. Circulation, 2000。102:50.55. 9 Ye Q,Zund G,Benedikt P。et a1.Fibrin gel as a three dimensional matrix in e~rdlovBs. cular tissue engineering .Eur J Cardiothorac Surg。20oo,17:587-591. 1O 赵东锷,汪钢。俞世强,等 .应用胶原膜支 架构建组织工程心脏瓣膜的初步研究.中 华胸心血管外科杂志,2002,5:257.260. 11 M uneretto C,Alessandri G,Caruso A,et a1. 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(收稿 日期 :2002.05 22) 维普资讯 http://www.cqvip.com
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