外周血T细胞淋巴瘤的TCR基因分析

·论著摘要· 外周血 T 细胞淋巴瘤的 TCR 基因分析 唐恩洁　E. Hodges　John L. Sm ith 　　外周血 T 细胞淋巴瘤 (peripheral T 2cell lym 2 phom a, PTCL )是高度异质性的免疫系统恶性肿瘤。因 其组织学特征多样性和免疫型易变性, 故难于用形 态学和免疫学方法准确地进行分类和诊断 [1, 2 ]。已知每 个 T 细胞克隆都必须发生独特的 T 细胞受体 (TCR ) 基因重排, 才能产生功能性抗原受体分子, 而 PTCL 常 为单克隆增殖, 故近年国内外一些学者已采用多种分 子生物学技术研究 TCR 基因重排与确定 PTCL 诊断, 复发及分型等的关系[3～ 5 ]。为进一步分析 TCR 基因重 排在 PTCL 基础和临床研究中的意义, 我们采用DNA 杂交和聚合酶链反应 (PCR ) 技术分析了 PTCL 的 TCR 2Β和 TCR 2Χ基因重排。 1　材料和方法 111　探针和引物　32P 标记的 TCR 2Β和 TCR 2Χ探针 由英国南安普敦大学 T enovus 实验室分子免疫组提 供。按文献[6, 7 ]选择, 由O sw el DNA Service 合成的引 物见表 1。 表 1　用于扩增 TCR 重排基因的引物 引物　　　　 核苷酸序列 V Β T GTA CCTCT GT GCCA GCA G D Β1 CAAA GCT GTAA CA T T GT GGGGA C D Β2 TCA T GGT GTAA CA T T GT GGGGA C JΒ1 GGAA CCA GGCTCA CT GT JΒ2 GGCA CCA GGCTCA CA CA GT GCT V Χ9 GA GAAA CA GGA CA TA GCTA C V Χ11 TCT GGA GTCTA T TA CT GT GC V Χ101 CTCA CA CTCTCA CT T JΧ11 CAA GT GT T GT TCCA CT GCC JΧp11 GT TA CTA T GA GCT TA GTCC 112　标本及模板DNA 提取　用蛋白酶 K 消化, 酚ö 氯仿抽提法从分子免疫组提供的, 已经临床、组织学和 免疫学确诊的 19 份 PTCL 和 4 份反应性 T 细胞增殖 症的外周血和 1 份 T 细胞白血病细胞系 (Ju rkat)的培 作者单位: 637007 四川省南充市, 川北医学院 (唐恩洁) ; 英国南安普敦大学 (E. Hodges, John L. Sm ith) 养细胞中提取DNA , 经定量后, 置- 20℃保存备用。 113　DNA 杂交技术检测 TCR 基因重排　10Λg DNA 分别用BamH I, EcoR I, 和H indË 消化, 115% 琼脂糖凝 胶电泳分离后, 真空法转移至尼龙膜 (BM ) 上, 再与 TCR 2Β或 TCR 2Χ探针杂交, - 70℃放射自显影, 最后 从用同一凝胶分离的 ΚDNA öH indË 分子大小参照物 (m arker) 及相应的迁移距离绘制的标准曲线上测出特 异性杂交带的分子大小。如检出的杂交带数量及大小 与已知的未重排胚系DNA 酶切片段不同, 则示受检标 本已发生 TCR 重排。 114　PCR 扩增重排基因　100Λl PCR 反应体系中含 50Λmo löL KC l, 10mmo löL T ris2HC l (pH 8. 4) , 1. 5m mo löL (TCR 2Χ) 或 3m mo löL (TCR 2Β)M gC l2, 125Λmo l (TCR 2Χ) 或 500Λ mo l (TCR 2Β) dN T P s, 50～ 100pmo l 上、下游引物, 815Λg BSA , 0. 5～ 1Λg 模板DNA 和 1～ 2U T aq 酶。在 Perk in E lm er PCR 仪中进行扩增反应 的程序是: 93℃ 5 分钟变性后, 经 35 周期循环[ 93℃ 1 分钟变性, 55℃ (TCR 2Β) 或 62℃ (TCR 2Χ) 1 分钟复性, 73℃ 1 分钟延伸 ]; 再经 73℃10 分钟延伸后, 以 PBR 322öH ae Ë 为 m arker, 用 6% 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PA GE)分析 PCR 产物。以呈现预期分子大小的可见 带为 TCR 基因重排的依据。不同组合引物扩增的 TCR 重排基因片段预期的分子大小为: TCR 2Β为 50～ 100bp; TCR 2Χ为: (1) V r11, V r101 + J r11 75～ 95bp; (2) V r11, V r101 + J rp11 80～ 110bp; (3) V r9 + J r11 64～ 100bp; (4)V r9+ J rp11 60～ 124bp。 2　结果 211　DNA 杂交结果　经DNA 杂交检出的 3 份 PT 2 CL 和 Jurkat 细胞的特异性酶切片段不同于胚系DNA (见表 2) , 表明其已发生 TCR 2Β和 TCR 2Χ两种基因重 排。 212　PCR 扩增结果 21211　PCR 产物的 PA GE 图谱　用不同组合引物对 TCR 基因的扩增和检测结果表明 PTCL 的 TCR 2Β基 ·25· Ch in J M ed Genet, February. 1997, V o l. 14, N o. 1 表 2　DNA 杂交技术分析 PTCL 的 TCR 基因重排结果 探针 标本号 与 TCR 探针杂交的限制性酶切片段 (kb) BamH I　　　 EcoR I　　　 H indË 　　　 TCR 2Β 1 28, 1814 8, 314 10, 719, 3. 3, 3 2 28, 21 1115, 318 719, 511, 313, 3 Jurkat 33, 28 1115, 10, 318 712, 419, 313, 3 3 1516, 10 318 511 胚系DNA 3 24 11, 4. 2 315, 715 TCR 2Χ 1 28, 21 3, 1135 414, 313, 218, 119, 114 2 24, 21 312, 1135 414, 313, 3, 1195 Jurkat 34, 20 10, 4, 1135 412, 115 3 22 5 315 胚系DNA 3 20, 13 113, 312 211, 5 　　3 未重排的 TCR 基因 基因很少呈现VDJ 重排, 主要为DJ 重排, 而且D 1öD 2 引物与 J 1 引物组合几乎不出现阳性扩增带, 与 J 2 组合 则可在片状或多条模糊带的背景上呈现 1～ 2 条分子 大小为 64～ 89bp 的强阳性带; 3 种V r 引物分别或同时 与 J r 引物组合, 均可在胶上呈现一条分子大小为 50～ 100bp 的强阳性带。而反应性多克隆增殖标本的 PA GE 图谱则为片状或多条模糊带。 21212　不同标本的 PCR 检测结果　19 份经 PCR 检 测的 PTCL 标本中, 17 份 (8915% ) 检出单克隆 TCR 基因重排, 其中 8 份 (4711% ) 仅为 TCR 2Β重排, 3 份 (1716% ) 仅为 TCR 2Χ重排, 6 份 (3513% ) 为两种 TCR 基因重排。经DNA 杂交证实为两种基因重排的 Jurkat 细胞仅扩增出 TCR 2Χ重排基因片段。检出 TCR 2Β基因 重排的标本中, 有 3 份呈现两条强阳性带, 可能为两种 克隆异常增殖。 3　讨论 免疫应答产生于成熟的 T 细胞的 TCR 可变区识 别特性抗原的基础之上。TCR 可变区由存在于胚系染 色体上, 呈线性不连续排列的若干V (D )J 基因片段选 择性重排, 形成紧密连接的基因功能单位编码合成。由 于不同克隆的重排基因中的V (D )J 基因不同, 连接这 些片段的N 区长度及序列不同, 以及重组酶的剪切作 用, 故重排的 TCR 基因不仅不同于未重排的胚系基 因, 而且不同克隆的重排基因亦不相同 [7 ]。这即是经 DNA 杂交检出的重排 TCR 基因酶切片段不同于胚系 DNA , 恶性单克隆增殖的 PTCL 与反应性多克隆增殖 的 T 细胞 PCR 产物的 PA GE 图像不同和用 PCR 技术 能更特异, 敏感地检出 TCR 重排的原因。我们及M c2 carthy [6, 7 ] 的实验结果均证实 90% 的 PTCL 均可用 PCR 技术检出 TCR 基因重排, 且无假阳性结果的事实 表明尽管 TCR 重排基因不是 PTCL 的疾病相关基因, 但的确可作为 PTCL 的克隆基因标志。采用较DNA 杂 交技术更敏感、特异、简便、快速的 PCR 技术检测 TCR 基因重排, 可用于 PTCL 的 (1)诊断和与反应性 T 细胞 增殖的鉴别诊断, 后者是目前病理学诊断中尚未解决 的难题; (2) 查见少量残留的 PTCL 细胞, 以监测疗效 和复发, 亦可作为判断 PTCL 治愈的指标或确定待移 植的自身骨髓中是否仍残留肿瘤细胞的标志; (3) 用于 PTCL 的基因分型, 肿瘤克隆起源及 PTCL 的病因研 究。 已有研究证实 TCR 2Β和 Χ基因重排和转录始于 T 细胞发育早期[8 ] , 因此这两种基因重排可作为更多不 同分化阶段 T 细胞克隆损伤的基因标志。而且我们和 其他学者均表明只需将D 1öD 2 和 J 2 引物组合, 或将 3 种V r 和 J r11引物加入同一反应体系中, 即可检出 PT 2 CL 的两种基因重排。因此 PCR 是检出 PTCL 克隆基 因标志的简便而经济有效的手段。PCR 检出的 PTCL TCR 2Χ基因重排率不高 (4219% ) , 可能与外周 T 细胞 中 Χ∆+ T 细胞比例较低有关[9 ]; 亦可能与现用V r 引物 不能覆盖所有V r 基因有关。因此如能进一步提高引物 的特异性和敏感性, 并同时扩增 IgH 和其它特异性基 因标志, 并结合免疫学分型鉴别各型淋巴瘤和白血病, 将更加有助于 PTCL 的基础和临床应用研究, 特别是 为 PTCL 的诊治提供新的研究思路和手段 [10～ 12 ]。 我们的实验结果还证实 3513% 的 PTCL 呈现两种 TCR 基因重排, 与M cCarthy 的实验结果 (40% ) 基本 一致。文献 7 指出 TCR 2ΑΒ+ 和 TCR Χ∆+ T 细胞均来源 于CD 44- CD 25- TN 细胞, 许多 ΑΒ+ T 细胞有 TCR 2Χ基 因重排, 而 Χ∆+ T 细胞亦有 TCR 2Β基因重排。因此上述 ·35·中华医学遗传学杂志 1997 年 2 月第 14 卷第 1 期 现象是因多克隆或单克隆 PTCL 增殖所致, 尚待确定。 进一步研究此现象产生的原因, 或许有助于理解不同 T 细胞群体间的相互关系。 参　考　文　献 1　Sm ith L J , Hodges E, How ell WM , et al. 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