康莱特注射液对Lewis肺癌小鼠VEGF—C蛋白及mRNA表达的影响

实用中西医结合临床 2008年 2月第 8卷第 1期 · 5 · 康莱特注射液对 Lewis肺癌小鼠VEGF—C蛋白及 mRNA 表达的影响 冰 张爱琴 t 孙在典 马胜林 包素珍。 (1浙江省肿瘤医院 杭州310022；2浙江省中医药大学附属东方医院 杭州 310012； 3浙江省中医药大学 杭州 310000) 摘要：目的：基于对Lewis肺癌组织中VEGF．C蛋白及 mRNA表达的影响，探讨康莱特注射液抗肿瘤转移的分子机制，为其临 床应用提供理论疗效证据。方法：5O只C57小鼠接种 Lewis肺癌瘤株后，随机分为5组：模型组、CTX组、康莱特低剂量组、康莱特 中剂量组、康莱特高剂量组。分别腹腔注射相应药物 15d后处死，免疫组化法检测各组小鼠肺癌组织中VEGF-C蛋白的阳性表达， 用RT—PCR检测VEGF—CmRNA的表达。结果：模型组、CTX组、康莱特低剂量组、康莱特中剂量组、康莱特高剂量组各组中 VEGF—C蛋 白的阳性表达率分别 为：(9，02+0．63)、(3，85±0．27)、(5．23±0，l9)、(3，22±0，08)、(2，02±0．06)，各组 VEGF—C mRN rGAPDH比值分男Ij为 (2．42：1：0，08)、(2．17：1：0，06)、(1_75：1：0,02)、(0．67：1：0．05)、(0．46：1：0．03)。结论：抑制VEGF—C蛋白及 mRNA的表达可能是康莱特 注射液抗肿瘤转移的分子机制之 一。 关键词 ：康 莱特注射液；VEGF—C：肿瘤转移 ；RT—PCR Abstract：Objective：To study the mol—mechanisms of KLT injection anti—tulnor metabasis，according to the effection that the KLT affect Oll the VEGF-C proteinum and mRNA ofLewi s lung can cer tissue．Methods：The 50 C57 mice were randomly divided into 5 groups after copiedLewislun g can cermodeltothem：themodelgroup，the chemotherapygroup，theLD KLTgroup，theMD KLTgroupandthe HD l(I group，Sacririce the mice after inject the diif-medicine to abdominal cavity for l5 days，the immunohistochemistry technique used todetectthe expressionofVEGF—C proteinum oflun g cancertissue，RT—PCR techniquetodetectthe expressionofVEGF—CmRNA， Results：the mssc·expression rate of VEGF—C in every group is(9．02+0．63)、(3，85±0，27)、(5．23±0．19)、(3．22+0．O8)、(2，02+0，06) corresponding，the proportionality ofgray scale ofNF—kB／GAPDH in all grows separately is(2，42+O．08)、(2．17+O，06)、(1,75+O．02)、 (O．67：1：0，05)、(O．46+0．03)．Conclusion：It’s maybe the one ofthe mol—mechanisms ofKLT to restrain tumor’s mctabasis by inhibiting the mssc．．expression ofVEGF—C and mRNA， Kev wolds：KLT；VEGF-C；Tumor metabasis；RT-PCR 中图分类号：R734．2 文献标识码：B 文献编号：l671-4040(2008)01—0005．02 康莱特注射液是从传统中药薏苡仁中提取的抗癌活性 成分，主要组分为中性油脂甘油三酯(含量>85％)，其次为甘 油单酯、甘油二酯和脂肪酸烃酯；其中中性油脂甘油三酯是 抗肿瘤活性的主要组分。近年来其在国内临床已广泛应用， 在美国业已完成 了II期临床试验，在俄罗斯已得到批准上 市，得到 FDA认可，显示出了良好的治疗效果和美好前景。 本实验通过对康莱特注射液影响VEGF．C的表达，阐明其抑 制肿瘤转移的分子机制。 1 材料与方法 1．1 实验动物及瘤株 C57BL／6小鼠5O只，体重(2O±2)g， 雌雄各半，购于上海医学科学院实验动物中心。饲养于浙江 中医药大学实验动物中心清洁级动物房。小鼠Lewis肺癌瘤 株，购于上海医学科学院实验动物中心。 1．2 药物 (1)康菜特注射液：1O g／100mL，国药准字 Z10970091，批号 0406281．2。小鼠低、中、高用量分别为： O．007g／10g (每 10g体重用药 O．007 g，下 同)、O．013g／10g、 O．025 10g。(2)环磷 酰胺 (CTX)：O．2g／瓶 ， 国药 准字 H32024654，批号 04041421；小鼠用量为 50mg／kg，生理盐水 配制成5medmL稀释液。 1-3 主要试剂及仪器 Rabbit anti-VEGF．C (RAB．0243)稀 释度为 1：50，迈新生物技术有限公司；Trizol、Ribonuclease、 Ribonuelease Inhibitor、Oligo (dT)18 primer、dNTP mix、10x PCR Buffer、Taq DNA polymerase等试剂购于上海生物 技术有限公司。实验仪器由所在实验室提供。 ·浙江省中医药管理局基金资助课 (No．2004~065) 2 实验方法 2．1 造模、分组及给药 取传代后 14d的Lewis肺癌瘤株小 鼠，无菌条件下剥取其肿瘤组织，匀浆，制成 1×10VmL瘤细 胞悬液，台盼蓝染色，光镜下瘤细胞计数，活细胞 >9O％。 O．2mL／只种植于 C57BL／6小鼠右腋皮下，复制小鼠Lewis肺 癌转移模型，从取出肿瘤到移植完最后一只小鼠时间控制在 2h之内。24h后，将小鼠随机分为 5组 (每组 1O只)：模型组； CTX组；康莱特高、中、低剂量治疗组。康莱特组(高、中、低三 剂量组)：每只剂量分别为 O．5、0．25、0．125mL，CTX组和模型 组：每只分别注射 0．2mL的CTX和生理盐水，每 日1次，各 组均腹腔给药，连用 14d。 2．2 检测指标 采用免疫组化 SABC染色法检测 VEGF．C 在 Lewis肺癌小鼠瘤组织中的表达。VEGF．C蛋白表达阳性 判断：A：按细胞染色强度记分，不显色为0分，浅黄色为 1分，棕黄色为 2分，棕褐色为3分。B：按显色细胞比例记 分，13以下为 1分，13~23为 2分，23以上为 3分。积分数 = Ax B，Ax B=0为阴性(--)；Ax B=l--4为弱阳性，低表达 (+)；Ax B>4为强阳性，高表达(++)Ill。 RT．PCR法 ：VEGF．C上游引物序列为 5’-tag ggt ttt ttt cagtattet-3’，下游引物序列为 5’-ttttcttgtttt gttttt acat-3’， 扩增片段长度为 412bp。其 PCR预变性 (5min，95"C)；变性 (30s，95~C)，退火 (30s，55℃)，聚合 (30s，72"C)；延伸 (10 rain， 72℃)。其中变性、退火、聚合共进行 36个循环。然后将扩增 产物分别注入 40／0的琼脂糖凝胶上电泳，GIS．2008凝胶成像 系统分析电泳产物。 维普资讯 http://www.cqvip.com 。 6 。 2．3 统计学处理 采用统计软件包 SPSSI1．0统计，数值用 均数±标准差 ±s)表示，两组间比较用 t检验，多组间比 较用方差分析，然后用 q检验，均以P<0．05为差异有显著 性，P<0．01为差异有非常显著性。 3 结果 3．1 康莱特对VEGF。C蛋白表达的影响 与模型组比较， CTX组及康莱特低、中、高剂量组中 VEGF．C蛋白阳性表达 率显著降低(P<0．05)。见表 l。 注 ：与模型组比较 ， P