肾细胞癌组织与正常组织中VEGF165b的差异表达及其意义

重庆医科大学学报 2009年第 34卷第 3期 (Journal of Chongqing Medical University 2009．Vo1．34 No 3) 一 281一 基础研究 文章编号：0253—3626(2009)03—028 1—04 肾细胞癌组织与正常组织中VEGF165b的差异表达及其意义 姜翠苹，王德林，彭 波 (重庆医科大学附属第一医院泌尿外科，重庆 400016) 【摘 要】目的：研究血管内皮生长因子 165b(Vascular endotheliM growth factor 165b，VEGF165b)在肾细胞癌(Renal cell carcino— ma，RCC)组织和正常组织中的表达情况，初步探讨其与肾细胞癌发生发展的关系。方法：(1)用 S-P免疫组化法检测 30例肾细 胞癌组织和 29例正常肾组织中 VEGF165b蛋白的表达情况；(2)用 RT—PCR法分别检测 32例肾细胞癌组织和 30例正常肾组 织 中 VEGF165b mRNA的表达情况。结果 ：(1)正常肾组织 中 VEGF165b蛋 白表达率为 96．55％(28／29)，肾细胞癌组织 中 VEGF165b蛋白的表达率为 20．00％(6／30)，表达差异有统计学意义(尸<0．05)。(2)正常 肾组织中 VEGF165b mRNA阳性表达率 为 93．33％(28／30)，肾细胞癌组织中VEGF165b mRNA的阳性表达率为 18．75％(6／32)，具有统计学意义(，)<0．05)。结论：VEGF165b 在肾细胞癌组织中的表达低于正常肾组织的表达 ，这种表达差异可能与肾癌发生、发展的机制有关。 【关键词】肾肿瘤；VEGF165b；免疫组织化学；逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR) 【中国图书馆分类法分类号】R737．11 【文献标识码】A 【收稿日期】2008—10—09 The differentiaI expression of VEG F1 65b in the renal celI carcinoma and nOrmal renal tissues and its clinicaI significance JIANG Cui-ping，et al (Department ofUrology，the FirstAffiliatedHospital，Chongqing Medical University) 【Abstract]Objective：To investigate the differential expression ofVEGF165b in the renal cell carcinoma(RCC)and normal renal tissues and its role in the development of RCC．Methods：S-P immunohistochemistry was used to detect the expression of VEGF165b protein in 30 specimens of paraffin-embedded RCC tissues and 29 specimens of paraffin-embedded normal renal tissues．RT—PCR was performed to detect the expression of VEGF165b mRNA in 32 specimens of ffesh RCC tissues and 30 specimens of ffesh normal renal tissues．Results： Among 29 of normal renal tissues，28 specimens had positive expression of VEGF1 65b protein，with the positive rate of 96．55％ (28／29) that was significantly higher than 20．00％ (6／30)in RCC tissues(P<0．05)．The positive rate of VEGF165b mRNA in normal renal tissues was 93．33％(28／30)，while that ofRCC tissues was only 18．75％(6／32)．The positive expression rate ofVEGFI65b mRNA in RCC tissues was significantly lower than that in normal renal tissues(P 5％为阳性 ，PI<5％为阴性 ；PI在 5％～24％之问为弱阳性 ； P1≥25％为阳性。 1．4 RT—PCR法检测 1．4．1 引物合成 引物设计参照文献f5，6]。VEGF b上游引物： 5’一GAGATGAGCTTCCTACAG—CAC一3’，下游弓l物 ：5’一 FCAG TC I ITrCCTGGTGAGAGATCTGCA一3’，222bp；B—aetin上二游弓l 物：5’一GAC I CCTCATGAAGATCCT一3’，下游弓l物：5’一GCG— GATGTCCACGTCACACT一3’，3l3 bp。引物由大连宝生物公司 合成。 1．4．2 组 织总 RNA提 取 以总 RNA提取试 剂 RNAiso Reagent提取总RNA，按试剂说明书操作。所提取总RNA完 整性经 1．5％琼脂糖凝胶电泳，可见明显 18 s和 28 s条带。用 紫外分光光度计定量并检测其纯度，A A 比值为 1．8—2．0 者可用于逆转录反应，一80％保存备用。 1．4．3 RT—PCR方法 RT—PCR按照 TaKaRa公司 RT—PCR 试剂盒操作步骤进行。冰浴中在反应管内依次加入 2 1 MgC 【25 mmol／L)、1 1 10×RT Bufier、2．75 l RNase Free dH2O、1 1 dNTP Mixture、0．25 l RNase Inhibitor、0．5 l AMV Reverse Transcriptase，0．5 l Random 9 mers(50 pmol／ 1)，2 IX l总 RNA，反应体系共 10 l，混匀 ，RT反应条件为：30'12 10 min， 45℃3O min，99℃5 nfin，5℃5 min，1个循环。PCR反应体系 为：5 l 5×PCR Buffer、TakaraExtaqHs0．125恤l、5 l cD- NA、0．25 l上游引物(20 pmol／ix】)、O．25 l下游引物(2O pmol／ 1)，用灭菌蒸馏水补足 25 l，混匀，PCR反应条件为： 94oC 2 min；94℃ 30 S，64％ 30 S，72~C 1 min，40个循环；72oC 10 rain。取 PCR扩增产物 5 1在 1．5％琼脂凝胶(GoldView 染色)电泳，电泳结束后置于紫外光灯下观察结果，条带位于 222bp为VEGF 65bmRNA表达阳性，条带位于313bp为 p—aetin mRNA表达阳性。 1．5 统计学处理 运用 SPSS13．0统计分析软件对资料进行统计学分析， 根据资料类型采用 Fisher确切概率法 ，P<0．05为差异有统 计学意义。 2 结 果 2．1 VEGF b的免疫组织化学检测结果 VEGF b阳性表达为细胞质内均匀分布棕褐 色颗粒。VEGF b蛋白在绝大多数正常肾组织中表 达(图 1)，而在肿瘤组织 中表达降低或者无表达(图 2，图 3)。29例肾正常组织中 28例 VEGF b阳性表 达，阳性率为96．55％；30例 RCC组织中VEGF。65b多 为阴性表达 ，仅 6例为弱 阳性表达(2O．OO％)。两者 间差异有统计学意义 (P<0．05，表 1)，提示 VEGF 65b 蛋白在RCC组织中表达下调。 表 1 VEGF b蛋白在 RCC组织与正常肾组织中的表达 2．2 VEGFl65b的 RT—PCR检测结果 VEGF。 b及内参 -actin PCR产物琼脂糖凝胶 重 庆 医科 大 学学 报 2009 年 第 34 卷 第 3 期 (J oum al0 fC hongqing M edicaI U niversity2009 ． V oI． 34 N o ． 3 ) 一 283 一 电泳 ， 其 大 小 与 预 先 设 计 引物 大 小 一 致 (图 3 )。 30 例正 常 肾组 织 中 28 例 表 达 V E G F 。曲 m R N A ， 阳 性 率 为 93-33％ ；32 例 R C C 组 织 中 6 例 为 阳 性 表 达 ， 阳性率为 18． 75％ 。 两 者差别具有统计学意义 (P < 0．05 ， 表 2)， 提示 R C C 组 织 中 V E C F 。65bm R N A 表达下 调 。 表 2 vE G F 。曲 m R N A 在 R C c 组 织 与 正 常 肾组 织 中的表达 图 l vE G F ，小 在正 常 肾组 织 中阳性表达 (sP ， ×4 0(】) ～ 彳 孵 鬻 ▲ 。 岔 、| 图 2 V E G F ，抽 在 R C C 组 织 中弱 阳性表达 (卵 ， ×4 00 ) 一 ‘ 。 ． 觏 一 图 4 vE G F 。。，bm R N A R cc 组 织及 正 常肾组 织 中的表达 3 讨 论 V E C F 。曲 是 V E G F — A 的 剪 接 变 构 体 ， 因 它 与 V E G F ．岱 具 有 相 同 的 氨 基 酸 数 目而 结 构 不 同 ， 故将 它命名 为 V E C F 。曲 ‘⋯ 。 研 究 发 现 ， V E C F 。曲 是 一 种循 环 蛋 白 ， 具 有 以 下 功 能 及 生 物 特性 l5I8_9】：(1 )V E C F ．65b 可 抑 制 V E G F ，晒 介 导 的 人 脐 静 脉 内皮 细 胞 (H u m an um bi】icalvein en dothelialcelJ s ， H U V E C )增 殖 和迁 移 ； (2)V E G F 。曲 可 抑 制 V E G F 。砧 介 导 的血 管 扩 张 ；(3 ) V E G F 。曲 抑 制 V E C F 。岱 介 导 的 血 管 生 成 ：V E G F 。曲 羧 基 末 端 的改 变 并 不 影 响其 与 受 体结 合 ， V E G F ，曲 与 V E G F ，岱 具 有 相 同 的 血 管 内 皮 生 长 因 子 受 体 2 (V ascular endothelialgrow th factor receptor 2 ， V E C — F R 一 2) 结 合 亲 和 力 ；V E G F 。∞ 通 过 激 活 内皮 细 胞 内 V E G F R 一 2 ， 使细 胞通 过 细胞 外基 质 迁 移 、 凋 亡 、 内皮 细 胞 增 殖 及 体 内毛 细 血 管 的顺 应 性 所 必 需 的p4 2／ p4 4 丝 裂 原 活 化 蛋 白激 酶 (M itogen — activatedprotein kin ase ， M A P K )和 丝 氨 酸 ／苏 氨 酸 激 酶 (S erin e／thre0 一 nin e — protein kin ase ， A K T )磷 酸 化 ；而 V E G F l65b竞 争 性结合 V E G F R 一 2 ， 抑制 V E G F R 一 2 激 活 ， 抑制 M A P K 和 A K T 磷酸化 ， 从 而 抑制血 管生 成 的信号途 径 ， 达 到 抑 制 V E C F 。舒 介 导 的血 管 生 成 ；(4 )在体 内 V E G F 。65 通 过 vE C F R 一 2 信号 传导 途 径 慢性 持续性 增 加 微 血 管 的通 透 性 ， 而 V E G F 。曲 通 过 V E G F R 一 1 信 号 途 径 短 暂增 加 血 管通 透 性 ， 而 且 V E G F 。曲 增 加 血 管通 透 性 的作用 强 于 V E C F ．晒 ；(5 )V E C F 。65}】抑 制裸 鼠体 内 A 375 黑 色素瘤 的生 长 。 上 述 发 现 表 明 V E G F 。曲 可 能 具 有 抑 制 肿 瘤 增 殖 、 迁 移 及 肿 瘤 血 管 形 成 的 作 用 。 最 新 研 究 发 现 V E C F 。曲 过 量 表 达 可 以 抑 制 体 内结肠 直 肠 癌㈣ 、 肾癌 、 前列 腺 癌 、 尤 文 肉瘤生 长⋯ 】， 抑制乳腺血 管生 成 [12】。 人 V E G F ，曲 重组 体能抑制裸 ≮ 0 弋 吖 —文 鹾≮ 疋』 人 、苓 0℃ ? 重庆医科大学学报 2009年第34卷第 3期 (Journal of Chongqing Medical University 2009．VOI．34 No．3) 鼠体内结肠癌的生长并降低肿瘤血管密度，但对肝 功能及血液动力学方面无不 良影响 ，这为 VEGF b 通过抗血管生成作用治疗肿瘤提供 了理论依据 1。 另有研究提示 VEGF b表达下调可能成 为判断肿 瘤预后不 良的标志ll4]。上述研究结果进一步证实 VEGF b可能具有抗血管生成从而抑制肿瘤生长 的作用，有希望成为治疗肿瘤的有效药物，成为判 断肿瘤预后的指标。 本研究为探讨 VEGF b在 。野癌发生 、发展中的 作用，分别以石蜡组织以及新鲜肾组织为研究对 象，采用免疫组织化学技术和 RT—PCR技术 ，从蛋 白水平及 mRNA水平检测 VEGF。岱b在肾癌组织及 正常肾组织中的表达情况。免疫组织化学结果显 示 ，29例 肾正常组织 中 VEGF 岱b蛋 白阳性表 达率 为 96．55％；30例 RCC组织中 VEGF， b蛋 白多为阴 性表达 ，少数为弱 阳性表达 (20．00％)。肾癌组织 VEGF b蛋 白表达的阳性率 明显低于 肾正常组织 (P<0．05)，与 Woolard等【7_研究结果相同。RT—PCR 结果显示，30例正常肾组织中有 28例表达 VEGF b mRNA，阳性表达率为 93．33％；32例肾癌组织中 仅有6例 为阳性表达 ，阳性率为 18．75％。RCC中 VEGF b mRNA表达明显低于肾正常组织中的表达 (P<0．05)，与 Bates等嘲研究肾癌中 VEGF1 b mRNA 表 达 的结 果相 同 。上述 结 果 表 明 ，RCC组 织 中 VEGF 岱b mRNA和 VEGF 65b蛋白表达明显降低，可 能是肾癌发生发展的重要因素之一。 综上所述 ，在 肾癌组织中，VEGF。 b无论是在蛋 白水平 还是在 mRNA水 平 表达都 有 所下 降 ， VEGF 65b在 RCC 组 织 中 的 异 常 低 表 达 表 明 VEGF b可能具有抑制肾肿瘤发生 、发展 的作用 ， VEGF b表达水平可能成为判断肾癌预后的标志。 参 考 文 献 [1] 昊小候，罗春丽，蔡晓钟．膀胱移行细胞癌尿脱落细胞 VEGF表 达的研究【JJ．重庆医科大学学报，2002，27(1)：45—47． [2] 张 尧，吴小俊，陈矢禹，等．肾细胞癌 MMR9，VEGF的表达及 其临床意义l J1．重庆医学，2007，36(13)：1298—1300． [3] Canneliet P．Angiogenesis in life，disease and medicine[J]．Nature， 2005．438(7070)：932—936． [4] Siemann D W，Chaplin D J，Horsman M R．Vascular-targeting the卜 apies for treatment of malignant disease[J1．Cancer，2004，100(12)： 2491-2499． 【5] Bates D O，Cui T G，Doughty J M，et a1．VEGF165b，all inhibitory splice variant of vascular endothelial growth factor，is downregulated in re— nal cell carcinoma[J]．Cancer Res，2002，62：4123—4131． [6] Ohnami S，Matsumoto N，Nakano M，et a1．Identification of genes showing diferential expression in antisense k-ras-tran sdueed pancreatic cancer cells with suppressed tumorigenicity[J]．Cancer Res，1999，59： 5565-5571． [7] Konopatskaya O，Churchill A J，Harper S J，et a1．VEGF165b，all en— dogenous C-terminal splice variant of VEGF inhibits retinal neovaseular— izationinmice[J]．MolecularVision，2006，12：626—632． [8] Woolard J，Wang W Y，Bevan H S，et a1．VEGF165b，an inhibitory vascular endothelial growth factor splice variant：mechanism of action，in vivoeffectonangiogenesisandendogenousproteinexpression[J]．CancerRes， 2004，64：7822—7835． [9】 Glass C A，Harper S J，Bates D O．The anti-angiogenic VEGF iso— form VEGF165b transiently increases hydraulic conductivity，probably through VEGF receptor 1 in vivo[J]．J Physiol，2006，572：243—257． 【101 Varey A H R，Rennel E S，Qiu Y，et a1．VEGF165b，an antiangio— genic VEGF—A isoform，binds and inhibits bevacizumab treatment in ex— perimental colorectal carcinoma： balance of pro-an d an tiangiogenie VEGF—A isoforms has implications for therapy[J]．Br J Cancer，2008，98： l366—1379． [1 1] Rennel E，Waine E，Guan H，et a1．The endogenous anti—an~ogenic VEGF isoform，VEGF1 65h inhibits human tumour growth in mice[J]．Br J Cancer，2008．98(7)：1250—1257． 【12] Qiu Y，Bevan H，Weeraperuma S，et a1．Mammary alveolar develop— ment during lactation is inhibited by the endogenous antiangiogenic growth factorisoform，VEGF165h[J]．FASEB J，2008，22(4)：1104—1112． [1 3] Rennel E S，Hamdollah—Zadeh M A，Wheatley E R，et a1．Recom— hinant human VEGF165h protein is an effective an ti—can cer agent in mice [J1．Eur JCancer，2008，44(13)：1883—1894． [14] D i azR，PefiaC，SilvaJ，eta1．p73IsoformsaffectVEGF。VEGF165b and PEDF expression in human eolorectal tumors：VEGF165b downregu— lation as a marker of poor prognosis[J]．Int J Cancer，2008，123(5)： 1060-1067． (责任编辑 ：冉 明会 )