食品微生物学实验综合性实验指导-细菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定

补充实验一、大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定 实验一、大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定 （综合性实验） (一)目的 1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。 2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。 3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 4.比较不同培养基的生长曲线 (二)原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数生长期、稳定期和衰亡期。这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。 (三) 1. 菌种： 大肠杆菌（Escherichia coli） 2. 营养琼脂培养基：根据产品说明配制 3. 生理盐水（0.9%NaCl）100mL，分装入10支试管（每支9mL） 4．培养基：本实验采取正交实验确定大肠杆菌最优的生长条件，采取L934正交表，正交如下： 表头（L934）： 实验设计： 培养基经121℃灭菌20min。 5 仪器及其他用品 721型分光光度计、比色杯、恒温摇床、培养箱、高压灭菌器、电子天平、pH计、酒精灯、电炉、接种环、试管架、培养皿10个、无菌吸管（1mL）10支、烧杯、试管、锥形瓶12个（250mL）、胶头、牛皮纸、硅胶塞等。 (四) 种子液 标记 接种 培养 测定 (五)步骤 1.标记编号 按要求配制培养基，将无菌培养基装于10个250ml锥形瓶，分别编号为0h，4h，6h，8h，11h，14h，16h，18h，19h，21h。 2.接种培养 (1)种子液制备： 取大肠杆菌（Escherichia coli）斜面菌种一支，用接种环刮取少量细菌于生理盐水（或无菌水）中，用胶头滴管震荡均匀。 (2)摇床培养： 用1mL无菌吸管分别准确吸取1mL种子液加入已编号的9个三角瓶中，于37℃下在恒温摇床上培养（180r.min-1）（以上步骤均需在无菌操作台上操作）。然后分别按对应时间将三角瓶取出，立即放冰箱中（2-4℃）贮存，待培养结束时一同测定OD值。 3.生长量的测定 将未接种的培养基倒入比色杯中，选用640nm分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 4.对第16h的培养液进行倒平板。 (六)生长曲线的比较 对所得数据进行生长曲线的绘制，比较各组培养基生长曲线上最大吸光度， (七)思考题 1.刚买来的菌种一般是冻干菌，应如何接种到斜面？ 2.在培养基调pH时应选用什么试剂？ 3.在接种培养时，对应时间取出三角瓶后，为什么要立即放到冰箱中贮存？ 4.正交试验设计中，应如何进行数据处理分析？正交试验是如何确定最佳生长条件？ 实验七 多聚磷酸盐与大豆蛋白的保水性研究 （一）实验目的 1.了解提高保水率的原理和方法。 2.掌握多聚磷酸盐和大豆蛋白提高保水率的机理。 3.掌握正交实验的方法。 （二）实验原理 1. 磷酸盐对肉制品保水性的影响 磷酸盐肉制品中应用的磷酸盐结构基本相似,是由一个或多个磷酸盐单元连接成的，常用的几种磷酸盐有三聚磷酸盐，焦磷酸盐，六偏磷酸盐，正磷酸盐等。除了焦磷酸盐外,其他的磷酸盐都是中性或中性偏碱的，磷酸三钠不能在肉制品中应用,磷酸钾价格较高且易吸潮,也较少使用。磷酸盐的加入一般是先配制成溶液,根据不同需要采取直接加入或注射加入,其最大添加量为0.5% 。不同磷酸盐改善制品的效果不同,其改善效果为:焦磷酸盐>三聚磷酸盐>六偏磷酸盐=正磷酸盐,磷酸盐的效果普遍优于其他盐类,但两者并用时,效果具有协同性，磷酸盐可以改善肉制品的功能特性。减少颜色风味的败坏，它改善肉制品功能特性的机制和其他盐类相似,从肉中提取肌原纤维蛋白,加热时蛋白质相互作用,形成一个强而有序的三维立体网状热固定结构,这种纤维蛋白晶格结构把小肉块粘结在一起,中间的缝隙束缚水分,从而提高了肉制品的保水性。许多学者认为磷酸盐作用效果好于其他盐类是因为磷酸盐能提高肉制品的pH值,促进肌原纤维蛋白的提取,增强了热固定结构的强度，焦磷酸盐能离解肌动球蛋白(一种主要的肌原纤维蛋白),增加了肌原纤维蛋白的提取。另外,磷酸盐还能延长肉制品的货架期,主要是因为磷酸盐能减少色素和脂类的氧化,研究人员认为磷酸盐能螯合自由离子(一种氧化强化剂),这样就降低了肌球蛋白的氧化,从而减少颜色和风味的败坏。虽然磷酸盐是一种很有用的添加剂,但添加量不应超过0.5%,磷酸钠处理的肉有甜味，偏磷酸钠处理的肉有涩味等，且当其用量大于0.3%时,就会有金属味。而且经常使用磷酸盐含量高的肉制品,体内磷酸盐的不断积聚会影响钙的吸收,容易导致骨质疏松症。目前,大多数肉制品中磷酸盐的含量控制在0.2%-0.3%,既安全,又能改善肉制品的各项功能特性。 磷酸盐是肉制品的一种有效的保水剂。生产中大多使用碱性磷酸类.其中以焦磷酸钠、三聚磷酸钠和六偏磷酸钠为最好。其保水机理可从以下几方面考虑: 提高肉pH。磷酸盐呈碱性，可使肉的pH向碱性偏移.远离蛋白质等电点.从而提高肉的保水性。 与肌肉中金属离鳌合。加入磷酸盐后.原来与肌肉中结构蛋白结合的Ca2+、Mg2+ 可被聚磷酸盐鳌合，蛋自质释放出羧基。由于羧基同性电荷相斥作用，使蛋白质结构松驰，可吸收更多的水分。 增加肉离子强度。磷酸盐溶液中的高价阴离子可增加肌肉的离子强度.有利于肌球蛋白B转变为溶胶状态.亲水性增强。 解离肌动球蛋白。磷酸盐将肌动球蛋白解离为肌球蛋白和肌动蛋白.肌球蛋白的增加也可使肉的保水性提高。 抑制蛋白质变性。肌球蛋白是决定肉保水性的重要因素.但对热不稳定.在盐溶液中30℃就开始变性.保水能力降低.而焦磷酸盐对肌球蛋白的变性有一定抑制作用.可使肌肉蛋白质的保水能力稳定。 偏磷酸盐在煮制时能加速蛋白质的胶凝作用。表面的蛋白质一经凝固.肉制品内部的水不易渗透出来而被包裹在网络中。 日前我国允许使用的磷酸盐主要有三聚磷酸钠、六偏磷酸钠和焦磷酸钠三种。磷酸盐混合使用效果比单独使用要好.其配比一般为21%六偏磷酸钠.37%三聚磷酸钠. 42%焦磷酸钠(也有报道二者依次为30% , 22% , 48%时效果好)，使用量一般在0.1-0.4%。 2.大豆蛋白对肉制品保水性的影响 大豆蛋白含有丰富的蛋白质(70%)和可食性纤维素(22%),具有较高的营养价值。大豆蛋白不仅能够提高肉制品的保水性、乳化性和风味,而且还供给人体必须的全部氨基酸,从而提高肉制品的营养价值。大豆蛋白提高肉制品持水性的原因之一是大豆蛋白吸水后(吸水比为1∶3),颗粒分散得更小,再配以滚揉、挤压、搅拌等工艺,则颗粒更接近分子化,在一定pH条件下,带电的蛋白质分子被极性水分子包裹起来,形成稳定的结构,并能和其他添加料、浸出物形成凝胶。另一个原因是大豆蛋白分子遇水后,起膨润作用,使其网状结构松驰,较多的水分和脂肪被包裹在网络中,使肉制品的保水力提高。 肉制品生产中一般在滚揉的最后阶段(如盐水火腿在滚揉结束前15分钟加入)或拌馅(如灌肠)时加入大豆蛋白。如果距离煮制或烘炜的时间太短,大豆产品蛋白粉难以达到最大膨润度。如果条件允许,则可在冷库内存放一夜,以给予足够的膨润时间,次日稍加滚揉、搅拌即可。大豆蛋白质的添加量一般为原料肉的1.5%-2.5%。 （三）实验材料、仪器与试剂 1.材料：新鲜精猪瘦肉、肥肉、淀粉、盐、味精、胡椒粉。 2.试剂：     SPP/焦磷酸钠(分析纯)、STP/三聚磷酸钠(分析纯)、SHMP/六偏磷酸钠(分析纯).大豆蛋白（食用级） 3.主要器材仪器：绞肉机 ，恒温水浴箱，电子天平，电子分析天平，恒温干燥箱，称量瓶，冰箱 （四）配方与工艺流程 1.配方 所有配料按瘦肉100%比例算。瘦肉100%、肥膘10%、食盐2. 5 %、生粉7%、胡椒粉0. 95 %、味精0. 5% 、冰（冰屑）15%。 2.工艺流程 5%冰水， 复合磷酸盐 ，生粉 肥膘 ，味精 ↓ 瘦肉 → 绞肉（加食盐，，10%冰水）→ 斩拌40-60(min)→ 成型（80℃）→ 冷切→ 切块→称量→干燥→称至恒重 3.制作猪肉丸的工艺说明： 配比 绞肉前应称好所需的材料和试剂，按瘦肉100%比例算。 绞肉，瘦肉应先用食盐腌十分钟，然后放入绞肉机里绞碎，一边绞肉一边加冰屑（10%）以维持低温，瘦肉绞两次，肥肉绞一次. 斩拌 绞肉完毕，加如味精，胡椒粉等调味料。搅拌十分钟（混匀），加入淀粉搅拌30-45分钟，在此期间一边搅一边加入剩余的冰水（5%）。斩拌过程须严格控制斩拌温度，防止肉温升高。因此，在实践过程中，通常以加冰屑代替水，以维持低温（8℃以下）。开始掺水时，应慢而少，再分次加入，逐步增加。搅拌时，速度应由慢到快，用力由轻到重，让肉糜逐步上劲。最后加入肥肉搅拌15分钟。挞拌至起胶。 成型条件 可用肉丸成型机成型，此实验用手捏成型，成型后放入80℃的恒温水浴中维持15-20分钟，使肉丸中心温度达到70-72℃是较理想温度，此时蛋白质既不会急剧收缩而严重脱水，又可达到熟制的目的。 冷却 成型后的肉丸应静置20-30分钟冷却，使其表面的热水蒸汽蒸发干。 切块 将肉丸的表面切去，取其中间一小块2×2CM（以放得下称量瓶为准），放入称量瓶中。 称量 称量过程使用电子分析天平，事先应称好称量瓶的重量，然后称出肉丸片与称量瓶的重量。 干燥，放入80℃恒温干燥箱，干燥6个小时。 恒重 从恒温干燥箱取出肉丸片与称量瓶，称其重量，放回恒温干燥箱干燥半小时，前后重量差小于2mg,即为恒重。 4.注意事项： （1 ）如不用机制，用手工搅拌必须顺着同一方向，先慢后快，切忌倒顺不一，快慢不均，要先搅拌，后挞拌至起胶。 （2）绞肉过程应注意安全，绞肉时应使用用绞肉机配置的塑料棒将肉捅入绞肉口而勿使用药勺等其他器具，以免被绞肉机打断伤人。绞肉机工作时千万勿将手伸入绞肉口。用完应及时断电，保证安全。 （五）保水率的测定方法 干燥前称量瓶与肉丸片总重—干燥后称量瓶与肉丸片总重 保水率WHC（%）= ——————————————————————————×100% 干燥前称量瓶与肉丸片总重—称量瓶重 （六 ）操作方法及计算 表1大豆蛋白最佳用量的确定 蛋白量 数据 0.5％ 1.0％ 1.5％ 2.0％ 2.5％ 3.0％ 1 2 3 （2）复合磷酸盐最佳配比的确定 选用L9 (34)正交表，进行正交组合试验。各单因素水平见表2 表2. 各单因素水平表 水平因素 A（%）STP B（%）SPP C（%）SHMP 1 0.5 1.5 0.5 2 1.0 2.0 1.0 3 1.5 2.5 1.5 表3.正交试验表 试验号 A（%）STP B（%）SPP C（%）SHMP 指标持水率（%） 1 1 1 1 2 1 2 2 3 1 3 3 4 2 1 2 5 2 2 3 6 2 3 1 7 3 1 3 8 3 2 1 9 3 3 2 Kˉ1 Kˉ2 Kˉ3 R 由正交实验结果确定最佳的配比组合，注意计算结果确定是否需要进行验证试验，从而确定复合磷酸盐在肉丸中的最佳配比关系。 （七）思考题： 1.提高保水性的方法有哪些？ 2.多聚磷酸盐的作用机理是什么？ 3.大豆蛋白的作用机理是什么？ 4.正交实验应如何设计？