细胞色素P450的电化学研究进展

　　　 　 第 18卷第 6期 2006年 6月 化 学 研 究 与 应 用 Chem ical Research and App lication Vol. 18, No. 6 Jun. , 2006 　 收稿日期 : 2005 - 05 - 18;修回日期 : 2005 - 10 - 13 基金项目 :山西省回国留学基金资助 联系人简介 :田燕妮 (19532) ,女 ,教授 ,主要从事生物电化学方面科研工作。Email: tianyann@ sxu. edu. cnn 文章编号 : 1004 - 1656 (2006) 06 - 0593 - 06 细胞色素 P450的电化学研究进展 田燕妮 (山西大学分子科学研究所 ,化学生物学与分子工程教育部重点实验室 ,山西 　太原 　030006) 摘要 :细胞色素 P450的电化学研究从一个侧面反映了为使细胞色素 P450达到工业催化剂的最终目的人们所 作的不懈努力。本文从细胞色素 P450在电极上的电子转移研究 ,隧道扫描显微镜的微观成像研究和使用电 极作为细胞色素 P450的电子给体从而实现细胞色素 P450底物转化三方面 ,评述了近年来细胞色素 P450的 电化学研究进展。 关键词 :细胞色素 P450;生物电化学 中图分类号 : O646. 5　　　文献标识码 : A 　　细胞色素 P450是包含一个血红素蛋白的超 大家族。它被发现存在于所有的生物有机体中 , 从细菌 ,酵母 ,真菌 ,植物 ,动物以至于人体。这个 酶引人注目的特点是能够催化广泛的有机化合物 的反应 [ 1 ] ,能使有害物质转变成为可溶物从体内 排出 [ 2 ]。细胞色素 P450 的种类已经超过 3000 种 [ 3 ] ,对它的研究也已经有 30年的历史 [ 4 ]。它的 最基本的催化反应是使用氧分子作为电子接受 体 ,有效地插入一个氧原子到不活泼的碳氢键中 , 被称之为单加氧酶。 R - H +O2 P450, 2e - + 2H + R - OH + H2 O (1) 这个羟基化反应除了需要活性氧外还需要电子 , 在生物体内提供电子的还原剂是 NADPH 或 NADH。 R - CH3 +O2 +NAD ( P) H + H + P450 R - CH2 - OH +NAD ( P) + + H2 O (2) 细胞色素 P450有一个庞大的家族 ,到目前为 止研究最广泛的是樟脑细胞色素 P450cam。它来 源于细菌 Pseudomonas putida,由 414个氨基酸组 成 ,分子量约 45kDa。X射线晶体研究结果表明它 具有一个不对称的三角棱柱结构 [ 5, 6 ]。它对樟脑 的 5位羟基化有独特的空间和立体专一化。 细胞色素 P450BM - 3也是细胞色素 P450家族 的一员 ,它来源于 Bacillus megaterium。与其他成 员不同的是它的单磷酸核黄素 ( FMN )和黄素腺嘌 呤二核甘酸 ( FAD )的还原酶是作为整个酶的一部 分与包含血红素的另一部分连接为一个整体 ,而 每一部分也能被独立的表达和纯化。因此它是一 个研究电子转移机理的理想体系。 除了单加氧的功能以外 ,细胞色素 P450也具 有环氧化作用、C - C键断裂以及烷基位移等作 用。因此它在各种生物合成和生物降解中起着重 要的作用。它的这个独一无二的反应也在许多领 域有着潜在的应用 ,如中间体的立体选择性合成 和化学、药物工业的终产品 ,以及环境污染物的生 物修饰。最近赵博 [ 7 ]等对细胞色素 P450在生物 化学方面的进展作了综述 ,本文仅就近年来细胞 色素 P450的电化学方面的进展进一综述。 1　细胞色素 P450的电化学研究 1977年 Eddowes & H ill[ 8 ]和 Yeh & Kuwana[ 9 ] 在蛋白的电化学领域里进行了开拓性的工作 ,他 们发现蛋白与电极之间缓慢的电子转移能够被克 服。第一个细胞色素 P450在电极上的直接的电 子转移的报道于 1996年 [ 10 ]。H ill研究组的工作 　　 化 学 研 究 与 应 用 第 18卷 表明一个可逆的从石墨电极到蛋白的血红素活性 中心的电子转移是可以实现的。它也提示细胞色 素 P450与电子给予体结合的正电荷表面也能与 电极的负电荷表面有效地结合。H ill等人继续的 研究说明电子从电极到蛋白的转移也可发生在裸 露的金电极上 [ 11, 12 ]。蛋白表面的突变也帮助它更 容易地固定在金电极的表面 [ 13 ] ,增加电子转移的 速率。像大多数酶一样 ,细胞色素 P450在未修饰 电极上的电子转移是相当困难的 ,这是由于血红 素活性中心深埋在蛋白的中心 ,缺乏最佳的与电 极转移电子的方向。只有新鲜的纯度高的蛋白可 以得到可靠的、可重复的结果。这也可能是一些 杂质和变性的蛋白迅速地占据了可利用的电极表 面的结果。因此含有血红素蛋白包括细胞色素 P450的大量研究工作旨在探索电极表面的修饰。 这些工作包括类似生物膜样的表面 [ 14 ] ;交换的层 与层的堆积膜表面 [ 15 ] ; 粘土类或凝胶类的表 面 [ 16 ]。这些方法给蛋白酶提供了一个非常合适 的环境 ,不仅保持了蛋白的活性 ,而且有利于它与 电极间迅速的电子转移。这些修饰的表面也有效 的阻止了微量杂质对电极表面的污染。Rusling等 首先成功的投放像生物膜样的物质在电极表 面 [ 17, 18 ] ,这个方法也被其它的研究组用来研究细 胞色素 P450和其它的蛋白 [ 19, 20 ] ,以及生物传感器 的制备 [ 21, 22, 23 ]。这些膜制备简单 ,通常是将有机 溶剂或者水溶解的表面活性剂 DDAB ( didode2 cyldimethylammoniumbrom ide,二 12烷基二甲基溴 化胺 )或 DMPC ( dimyristoylphosphatidyl choline, 二 14 - 酰磷脂酰胆碱 )的溶液投放在石墨或金电极 表面形成稳定的晶体膜。有时候 ,也加入另外的 一些物质如戊二醛、牛血清白蛋白或者熔胶凝胶 帮助固定。在生物膜中蛋白被浓缩在电极表面 , 直接、迅速、可逆的电子转移就被观察到。虽然在 薄膜里电子转移速率常数的测量上有一定的难 度 ,但细胞色素 P450在膜中的电子转移速率 ( Ks ～26S- 1 )与在溶液中比较 ,电子转移的效率提高 了 [ 17 ]。一个成功的细胞色素 P450的电子转移发 生在与细胞色素 P450相反电荷的聚合物离子的 多层膜上 [ 14, 24 ]。在这项研究中 ,MPS (3 - mercap to - 1 - p ropanesulfonic acid, 3 - 巯基 - 1 - 丙烷磺 酸 )修饰的金电极上首先被投放了一层正电荷的 PE I/PSS ( Polyethyleneim ine /polystyrenesulfonate,聚 乙烯亚胺 /聚苯乙烯磺酸或 PDDA (polydimethyldi2 allylammonium chloride 聚二甲基二烯丙基氯化 胺 ) ,好像提供了一层“静电胶 ”使细胞色素 P450 以单层的方式“粘 ”在膜上 ,继续增加正电荷聚合 物离子和负电荷的细胞色素 P450,直到七层。在 多层膜中不仅细胞色素 P450的电活性增加了 ,而 且改善了稳定性 (电极在缓冲溶液中储存两周后 , 信号保持不变 ) [ 25 ]。另一个成功的修饰电极的方 法是粘土蒙脱土修饰的玻碳电极 [ 16 ] ,在这样一个 环境中 ,可以观察到迅速、可逆的电子传递。 表 1列出了用各种修饰方法测定的无底物时 细胞色素 P450cam 的氧化还原电位。电极的种 类、不同的修饰膜都对氧化还原电势有一定的影 响。例如在 DDAB中的电极电势比氧化还原滴定 所测定的电势正移了 180 - 320 mV [ 17 ]。这个现象 可以用电极双电层的影响以及修饰物质和蛋白之 间的相互作用来解释。 表 1　细胞色素 P450cam血红素中心的 氧化还原电势 (电势升高的顺序 ) Table 1　Electrochem ically measured haem rodox potential ( Em ) of P450cam in substrate - free buffered (pH 7) solution using modified and unmodified electrodes ( in order of ascending potential). electrode Em V . v. SCE reference P450cam solution 3 - 544 [ 26 ] EPG# - 526 [ 10 ] Clay - GC - 405 [ 16 ] Sol - Gel/DDAB - GC^ - 400 [ 21 ] DMPC - PG - 357 [ 17 ] ( P450cam /PE I) 6 - PG - 320 [ 25 ] DDAB - GC^ - 260 [ 23 ] PSS/PE I/MPS - Au - 250 [ 15 ] DDAB - PG - 238 [ 17 ]3 Measured in solution by redox titration, # pH 714, ^ pH 715 笔者在英国牛津大学皇家院士 H ill教授实验 室有幸参加了细胞色素 P450BM - 3 的电化学研 究 [ 27 ]。细胞色素 P450BM - 3的循环伏安是在修饰 于电极表面的 DDAB膜中得到的 (图 1)。一个典 型的 P450BM - 3循环伏安给出两对氧化还原可逆电 对。当将蛋白分解为只包含 FAN /FMN和只包含 血 红 素 两 部 分 后 , 可 以 证 明 中 点 电 位 - 01388 V ( vs. SCE)来源於 FAD /FMN,而中点电 位 - 01250 V来自 Fe ( Ⅲ) - Fe ( Ⅱ)氧化还原电 对。有趣的是细胞色素 P450BM - 3在 DDAB膜中的 电子转移经历了一个动态平衡过程 ,如图 2所示。 当取出浸在 P450BM - 3溶液中一小时的 DDAB修饰 495 第 6期 田燕妮等 :细胞色素 P450的电化学研究进展　　 电极在缓冲溶液中测定时 ,第一次扫描几乎只得 到 FAD /FMN 的电子转移 , 30分钟后 , FAD /FMN 的电子转移电流降低而 Fe (Ⅲ) - Fe (Ⅱ)的电子 转移电流升高。这种趋势持续地保持在一小时的 测定过程中 ,然后趋于平稳。我们可以把这种现 象解释为在施加电场的条件下 ,吸附在 DDAB膜 中的蛋白调整了它的取向 ,有利于血红素中心与 电极之间的电子交换。 图 1　细胞色素 P450BM3 ( a)和它的血红素部分 ( b)在 DDAB修饰的热解石墨电极上的循环伏安 Fig. 1　Cyclic voltammetry of wild - type P450BM3 holoenzyme (a) and heme domainim (b) immobilized at a didodecyldimethylammonium bromide (DDAB) - modified edge p lane pyrolytic graphite (EPG) electrode. The cycilc voltammograms were recorded in deoxygenated phosphate - buffer solution, pH 714, at a scan rate of 011 V s- 1. 2　细胞色素 P450的 STM研究 1986年 , STM可以在溶液状态下操作的发现 给在生理条件下测定生物分子的结构创造了机 会 [ 28, 29 ] ,可以假设在溶液的状态下 ,酶的结构和功 能没有显著的变化。1989年 , DNA在水溶液中在 金表面得到的图像再一次证实了 STM 的成 功 [ 30, 31 ]。自那时起 ,大量的生物样品 :范围从小分 子 ,如 DNA碱基和它们的衍生物、氨基酸和聚核 苷 酸 , 到 完 整 的 细 胞 都 试 图 用 STM 测 定了 [ 32, 33, 34, 35 ]。 在 STM的研究中 ,生物分子在表面的固定是 一个关键的问。简单的物理吸附可能不是一个 理想的方法 ,因为这将导致蛋白失去原有的结构。 化学吸附 ,蛋白共价地键合到基底的固体表面 ,已 经成为控制蛋白保持原有结构的可行的方法 ,克 图 2　细胞色素 P450BM3在 DDAB修饰的热解石墨电极 上起始 ( a)、30分钟和 60分钟时测定的循环伏安 Fig. 2　Cyclic voltammetry of wild - type P450BM3 holoenzyme immobilized at a DDAB - modified EPG electrode. Cyclic voltammograms were recorded in deoxygenated phosphate - buffer solution (pH 714) , at a scan rate of 011 V s- 1 , for wild - type P450BM3 holoenzyme immobilized at a DDAB - modified EPG electrode after being initially immersed (a) and then 30 min (b) and 60 min (c) later. 服了生物分子本身的和探头诱导的移动 [ 36 ]。有 两种固定蛋白的方法 ,一种是作为电极的基质表 面的修饰 ,另一种是蛋白表面的突变。在细胞色 素 P450的研究中 ,蛋白被直接的位点突变后通过 S - Au的共价键结合固定到金电极为基质的表 面 [ 37 ]。这是固定蛋白的一种新颖的方法。 细胞色素 P450晶体结构的研究说明它具有 一个三角棱柱的形状 ,边长为 615纳米 ,厚度为 315纳米。继天然的樟脑细胞色素 P450cam 的 STM的研究之后 ,一个通过基因工程在蛋白表面 半光氨酸取代赖氨酸的突变 ( K344C) P450cam也 被研究 [ 13 ]。这是通过蛋白表面突变的半胱氨酸 的硫与金的共价键合 ,使蛋白固定在金基质的表 面。基因工程方法的应用命名蛋白表面引入了一 个特殊的位点 ,使活性的蛋白以一种人为的取向 有规则的固定的电极的表面。研究表明半胱氨酸 突变的蛋白较天然的蛋白有更高的覆盖率和更有 序的吸附。在低分辨率下 ,细胞色素 P450似乎是 有规则的圆形 ,然而在高分辨率下 ,吸附的分子具 有可分辨的三角形的形状。参考蛋白结构的计算 机模型 (B rookhaven Protein Database) ,当假设突变 的半胱氨酸那一面是面对金的基质 ,可以预料确 实是这样的结构。在溶液状态下的金基质上得到 的细胞色素 P450cam ( K344C)的隧道扫描图像具 595 　　 化 学 研 究 与 应 用 第 18卷 有平均 4 - 5纳米宽和 5 - 6纳米长 ,与晶体报道 的数据基本相符。 电化学的研究表明 ,突变蛋白的电子跃迁比 天然蛋白的电子跃迁增加了 ,这里最大的可能是 由于固定在金电极表面的突变的位点使电活性中 心离表面更近了。 H ill研究小组进一步对 K344C突变的细胞色 素 P450cam和它的给电子氧化还原前体假单孢氧 还蛋白 ( putidaredoxin)的混合体系做了 STM 试 验 [ 38 ]。尤其是寻找和创造了形成两者结合的条 件 ,进一步试图研究蛋白在这种条件下的电化学 , 为生物传感器的制备创造条件。研究表明假单孢 氧还蛋白与细胞色素 P450cam有强的结合 ,且有 一定的结合方向。在没有这样一个体系的晶体数 据的情况下 , STM的研究结果对两个蛋白间电子 传递的取向做了最好的描述 [ 38 ]。 3　细胞色素 P450作为催化剂的研究 鉴于细胞色素 P450的单加氧酶的特殊功能 , 近来正在致力于将它作为化学反应乃至化学工业 的催化剂 [ 39 ]。研究的关键之一在于用什么样的 物质代替提供电子并在反应中不断消耗的昂贵的 NADPH。由于电化学可以由电极直接提供电子 , 因而成为这项研究的一个重要分支。 由于细胞色素 P450催化反应的相对复杂性 , 直接的电子传递远远不能达到催化的目的。几个 报道发现可以用具有氧化还原的分子 (氧化还原 媒介体 )传递电子给细胞色素 P450。在每一种情 况下 ,媒介体在适当的电极上被还原 ,还原的媒介 体作为氧化还原的给予体将电子转移到细胞色素 P450。Estabrook和他的合作者报道了这种方法的 最初的尝试 [ 40 ] ,他们使用 P450 - 4A1和 NADPH - P450还原酶的体系 ,表明 Co ( sepulchrate) 3 +能 作为一个媒介体 ,代替 NADPH给电子的作用 ,有 效地从电极上传递电子给细胞色素 P450使 ω - 月桂酸羟基化为 12 -羟基月桂酸。即在一个包含 媒介体和 P450 - 4A1和 NADPH - P450还原酶的 体系的电解池中 ,实现了对底物ω - 月桂酸的羟 基化。并比较了使用 Co ( sep ) 3 +和使用生物电子 给予 NAD ( P) H所生成产物的速率。这个工作强 调了用电极提供电子 ,利用媒介体 ,代替 NDAD ( P) H的可能性 ,从而提供了电化学技术在合成具 有独特的空间和立体专一性化合物中的应用 [ 41 ]。其它的媒介体还有 methylviologen[ 42 ] 等。 V ilker研究小组则采用传递电子给细胞色素 P450cam的氧化还原前体假单孢氧还蛋白 (putid2 aredoxin)代替媒介体 ,从氧化锡锑半导体电极上 接受电子 ,然后传递电子给细胞色素 P450cam,从 而实现了对底物樟脑的转化 [ 43 ]。这项研究的优 势在于体现了假单孢氧化还蛋白在天然氧化还原 链中所起的作用 ,证实了应用电化学反应 ,使用酶 作为催化剂 ,实现特殊化学物质合成的可行性。 在利用细胞色素 P450作为生物催化剂的研 究中发现 ,这些酶在本质上不是非常活泼 ,催化效 率差 ;在隔离条件下很不稳定 [ 44 ]。但基因工程的 迅猛发展 ,不仅能更深入地探讨结构对功能的作 用、催化机理 ,更重要的是能改善酶的敏感性、稳 定性和复杂性。例如 O liver 发现细胞色素 P450BM - 3 87位的苯丙氨酸在饱和脂肪酸羟基化的 空间选择性上起了重要的作用 [ 45 ] , Schwaneberg等 的研究表明由 87位苯丙氨酸到丙氨酸的突变增 加了对饱和脂肪酸羟基化的灵敏度 [ 46 ]。突变也 改变了对底物的选择性 , Schm id和他的研究小组 发现对细胞色素 P450突变了也能接受短链的底 物 [ 47 ] ,加快吲哚的羟基化、辛烷和萘的氧化 [ 48 ] ,使 细胞色素 P450能催化更多物质的化学反应。Ap2 pel等也报道了细胞色素 P450BM - 3的 A la74Gly/ Phe87Val/Leu188Gln三位点的突变使底物的范围 大大增加 [ 49 ] ,适用于化合物的合成和环境污染物 的降解。 围绕着细胞色素 P450的各项研究的进展推 动着细胞色素 P450作为工业催化剂的实现 ,人们 将拭目以待新的重大突破问世。 参考文献 : [ 1 ] Guengerich F P. 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Study in electrochem istry of cytochrome P450 TIAN Yan - ni ( Institute ofMolecular Science, Chemical B iology and Molecular Engineering Laboratory of Education M inistry, Shanxi University, Taiyuan　030006, China) Abstract: Study in Electrochemistry of Cytochrome P450 is a Profile of the effort in order to use Cytochrome P450 as catalyst in industry. Recent advances in electrochemistry of Cytochrome P450 are reviewed, including the electron transfer from electrode to Cytochrome P450, Scan TunnelM icroscopy study of Cytochrome P450 and the substrate’s conversion of Cytochrome P450 in the electrochemical system. Key words:Cytochrome P450; bioelectrochemistry (责任编辑　张文华 ) 895