GB 18653-2002-T 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法

GB/T 18653-2002 前 言 本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程，结合本国实际情况制定的，通过大量 试验，证实该方法准确可靠。 本标准的附录A是标准的附录，附录B是提示的附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:天津动植物检疫局。 本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波。 中华人民共和国国家标准 胎JL弯曲杆菌的分离鉴定方法 GB/T 18653-2002 Methods for isolation and identification of campylobactor fetus 1 范围 本标准了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法 本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验，其他动物可参照使用 2 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定 2.1 设备和材料 2.1门 混合气体[质量比为3.5%氧(00,10%二氧化碳(C02),86.5%氮(N,)口。 2.1.2 厌氧培养罐。 2.1.3 采样棒及吸球 2.1.4 2 mL注射器，5号针头，20号针头。 2.1.5 灭菌青霉素瓶及生理盐水。 2.1.6 供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。 2.2 培养基和试剂〔见附录A(标准的附录)〕。 2. 2, 1 增菌运输培养基(TEM) o 2.2.2 半胧氨酸牛心浸膏培养基((CH), 2.2. 3 琼脂培养基(MH), 2.2-4 疏基乙酸盐肉汤。 2.2.5 相关生化试剂。 2.3 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图。 2.4 分离培养 2.4.1 样品采集 2.4-1-， 母牛站立或六柱栏保定，用5%来苏儿消毒牛的外阴部，将采样棒的采样端插人阴道，压扁另 一端的吸球，并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样棒后，插人盛有3 mI灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数 次，再将采样棒放人消毒液中。 2.4. 1.2 公牛六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外部的阴毛，用5%的来苏儿消毒公牛 的尿道口，将采样棒的采样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包皮液。取出采样棒迅 速插人盛有3 ml灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。 2.4.1.3 样品液静置1 min-2 min，用灭菌注射器吸取上清液2 mL，分别注人两瓶增菌运输培养基 (见附录A中A1)中，每瓶1 mL。振荡混匀，尽快送至实验室。 2.4- 1.4 取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子荫取样品液直接涂布于含抗菌素的MH (见附录A中A3)或CH(见附录A中A2)琼脂平板上。 2.4.2 已接种样品的增菌运输培养基置37'C培养72 h。用直径3 mm的接种环将增菌液分别划线于 两个MH或CH平板培养基上，将平板放置厌氧培养罐中，将雄内空气抽出，达到一5.5 kPa时停止，充 中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002一02一19批准 2002-05一01实施 Gs/T 18653-2002 人经0. 22 pm滤膜过滤的混合气体至负压为零，再将气体抽出和充人反复两次。将培养罐在37 C培养 72 h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。 2.4. 3 观察MH,CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落，如无可弃之 如有，将典型或可疑菌落 划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72 he 胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直 径为1 mm左右。 2.5 鉴定 2.5，， 筛选试验 2.5.1.， 取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂 配方见附录A中A5,A6) o 胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性，呈螺旋状或“S,，状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形 成芽胞和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性 :5.1.25.2 纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中，以备进一步做生化试验用。生化试验 2.5-2.1 将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验。 表 1 胎儿弯曲杆菌生化反应 菌名 过氧化氢 酶试验 硫化氢 (H,S) 试验 生长试验 药敏试验 马尿酸 钠水解 试验 氧化酶 试验25 C 42C 1%甘 氨酸 1%胆 汁 3.5%抓 化钠(N.Cl) 蔡陡酮 酸30 0g/片 头抱称素 30 pg/片 胎儿弯曲杆 菌胎儿亚种 于 + + + + R S 十 胎儿弯曲杆 菌性病亚种 + + + R S 2.5-2.2 所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管，培养时应将试管盖 放松。 2.5.2.3 生长试验:纯培养后的菌接种到2管疏基乙酸肉汤(见附录A中A4)中，分别放43℃和25 C 温箱培养72 h观察结果，肉汤上层出现雾状混浊时，说明细菌已生长。 2. 5.2.4 硫化氢(H,S)试验:纯培养后的可疑菌种接种于琉基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条长X宽为 20 mm X 6 mm的乙酸铅滤纸，观察3d-4d，如见滤纸变黑即为产生H多之证。 2.5.2.5 甘氨酸、抓化钠、胆汁生长试验:可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.50o抓化钠、1%胆汁生 长的琉基乙酸肉汤中，37 C培养72 h,培养基近表面有云雾状生长为阳性。 2. 5. 2.6 药物敏感试验:用铂金耳挑取可疑菌落放于1 mL灭菌生理盐水试管中，菌液浓度约为3X 10“个/ml，用灭菌1棉拭子馥取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上，然后用镊子把含有30 t}g蔡吮酮酸 和头抱霉素的滤纸片贴在MH血平板上，在混合气体中37-C培养24 h-72 h，量溶菌区，0>-18 敏感,0镇14 mm为不敏感。 mm为 229 GB/T 18653-2002 2.5-2.7 马尿酸钠水解试验:取48 h--72 h培养物接种于。4 mLl%马尿酸钠液(见附录A中A7. 1) 中制成浓厚菌悬液35C-37C水浴2h，再加人。.2 mI苟三酮试剂(见附录A中A7.2),混匀后水浴 20 min观察结果，变深紫色为阳性，淡紫色或不变色为阴性。可用18 h-24 h变形杆菌培养物作阳性 对照 2.5. 3 结果判定 根据2.5.1和2.5.2的结果进行。 2.5.11 凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌。 2.5-3.2 过氧化氢酶试验,H2S试验,1%胆汁生长试验,3.5Y.抓化钠生长试验和马尿酸水解试验，其 中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性，均判定为非胎儿弯曲杆菌。 2.6 结果的表示 2.6.1 阳性结果:“发现胎儿弯曲杆菌”、“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病 亚种” 2.6.2 阴性结果:“未发现胎儿弯曲杆菌”。 GB/T 18653-2002 附 录 A (标准的附录) 培养基和试荆 A1 增菌运输培养墓(transport enrichment medium,TEM) 成牛血清 1 000 MI 5-氟尿啥咤 。·3g 放线菌酮 。，19 蔡吮酮酸 3 mg 多粘菌素B 100 000 IU 100煌绿 5 ml, 将各种成分无菌操作加人到成牛血清中，充分混合后分装于20 ml一带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶 中，每瓶8 MI，然后水浴或在蒸气中加热2 min--3 min(无压力)，使血清凝固，冷却后用灭菌玻璃棒将 血清凝块捣碎。最后无菌操作充人混合气体[3.5%氧气(Oz),10%二氧化碳(C02),86.5%氮气(N,)]o 将制备好的TEM培养基保存在4'C冰箱中，可使用4个月。 A2 CH培养基(cysteine heart blood agar)(含抗菌索) 牛心浸液(或牛心粉30 g) 500 g 胰蛋白陈 10g 右旋糖 10g 抓化钠 59 L一半胧氨酸 19 琼脂 129 蒸馏水 1 000 ml_ pH6. 9-7. 0 加热溶解各成分后107. 9 kPa高压15 min，培养基冷却至50C-55℃时，无菌加人: 多粘菌素B 2 mg 新生霉素 2 mg 放线菌酮 20 mg 绵羊血 100 mL 混匀，倾注平板。放4C水箱备用。 A3 MH培养基(mueller hinton agar)(含抗菌寮) 牛肉浸膏 酪蛋白水解物 淀粉 琼脂 蒸馏水 pH7. 4士0.2 各成分加热溶解，107.9 kPa高压15 杆菌肤 5g 17. 5 g 1. 5 g 15 g 1 000 ml, min，冷却至50 C ^-55 C时，无菌加人: 25 000 IU GB/T 18653--2002 放线菌酮 多粘菌素B 新生霉素 绵羊血 混匀，倾注平板。4C冰箱保存。 50 mg 1万 lu 5 mg 50 m[一 100 mL A4 疏基乙酸盐肉汤 1,胧氨酸 。.5 mg 氯化钠 2.smg 右旋糖 5.5g 酵母浸膏 5·。g 酪蛋自胰消化物(Pancreatic Digest of Casein) 15. 0 g 琉基乙酸钠 。·59 蒸馏水 1 000 ml 加热至溶解，调整pH7. 2士0. 2,5 mL试管分装，107. 9 kPa高压灭菌15 min, 新制备的培养基(Al-A4)均应做无菌检查，并用已知阳性菌和阴性菌进行测试，以保证培养基的 质量。 A5 氧化酶试剂 1写盐酸二甲苯对苯二胺水溶液，置棕色瓶中现用现配，-lo℃保存，有效期一周。用于氧化酶试验 A6 3%过妞化氮(H202) 30写H202 10 ml - 蒸馏水 90 ml, 装于棕色瓶中，有效期为一周。 用于触酶试验。 A了 马尿酸盐水解试验 A7.1 1%马尿酸钠 马尿酸钠 1g 蒸馏水 100 ml A7.2 水合荀三酮 苟三酮 3.5 g 丙酮 50 mL 丁酮 50 ml, GB/'r 18653--2002 附 录 B (提示的附录) 胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图 2sa