GB/T 18653-2002
前 言
本标准是依据加拿大国家动物疾病研究所的实验室操作规程,结合本国实际情况制定的,通过大量
试验,证实该方法准确可靠。
本标准的附录A是标准的附录,附录B是提示的附录。
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准由全国动物检疫标准化技术委员会归口。
本标准起草单位:天津动植物检疫局。
本标准主要起草人:秦贞奎、侯艳梅、张碧波。
中华人民共和国国家标准
胎JL弯曲杆菌的分离鉴定方法 GB/T 18653-2002
Methods for isolation and identification of campylobactor fetus
1 范围
本标准
了胎儿弯曲杆菌的分离鉴定方法
本标准适用于牛、绵羊、冷冻精液胎儿弯曲杆菌的检验,其他动物可参照使用
2 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定
2.1 设备和材料
2.1门 混合气体[质量比为3.5%氧(00,10%二氧化碳(C02),86.5%氮(N,)口。
2.1.2 厌氧培养罐。
2.1.3 采样棒及吸球
2.1.4 2 mL注射器,5号针头,20号针头。
2.1.5 灭菌青霉素瓶及生理盐水。
2.1.6 供常规细菌分离鉴定用的基本设备与材料。
2.2 培养基和试剂〔见附录A(标准的附录)〕。
2. 2, 1 增菌运输培养基(TEM) o
2.2.2 半胧氨酸牛心浸膏培养基((CH),
2.2. 3 琼脂培养基(MH),
2.2-4 疏基乙酸盐肉汤。
2.2.5 相关生化试剂。
2.3 胎儿弯曲杆菌的分离鉴定程序见附录B(提示的附录)示意图。
2.4 分离培养
2.4.1 样品采集
2.4-1-, 母牛站立或六柱栏保定,用5%来苏儿消毒牛的外阴部,将采样棒的采样端插人阴道,压扁另
一端的吸球,并来回抽动,吸取阴道粘液。取出采样棒后,插人盛有3 mI灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数
次,再将采样棒放人消毒液中。
2.4. 1.2 公牛六柱栏保定,用绳子固定采样侧的后肢,剪短阴筒外部的阴毛,用5%的来苏儿消毒公牛
的尿道口,将采样棒的采样端插人阴筒内,将另一端的吸球压扁并来回抽动,吸取包皮液。取出采样棒迅
速插人盛有3 ml灭菌生理盐水的小瓶中吹吸数次。
2.4.1.3 样品液静置1 min-2 min,用灭菌注射器吸取上清液2 mL,分别注人两瓶增菌运输培养基
(见附录A中A1)中,每瓶1 mL。振荡混匀,尽快送至实验室。
2.4- 1.4 取样品做革兰氏染色并做湿涂片镜检。也可用棉拭子荫取样品液直接涂布于含抗菌素的MH
(见附录A中A3)或CH(见附录A中A2)琼脂平板上。
2.4.2 已接种样品的增菌运输培养基置37'C培养72 h。用直径3 mm的接种环将增菌液分别划线于
两个MH或CH平板培养基上,将平板放置厌氧培养罐中,将雄内空气抽出,达到一5.5 kPa时停止,充
中华人民共和国国家质f监督检验检疫总局2002一02一19批准 2002-05一01实施
Gs/T 18653-2002
人经0. 22 pm滤膜过滤的混合气体至负压为零,再将气体抽出和充人反复两次。将培养罐在37 C培养
72 h。以后胎儿弯曲杆菌均需在混合气体条件下培养。
2.4. 3 观察MH,CH培养基上有无疑为胎儿弯曲杆菌的菌落,如无可弃之 如有,将典型或可疑菌落
划线于MH或CH琼脂平板培养基上培养72 he
胎儿弯曲杆菌在MH或CH平板培养基上的菌落特征为:不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直
径为1 mm左右。
2.5 鉴定
2.5,, 筛选试验
2.5.1., 取典型或可疑纯培养物做革兰氏染色、湿涂片动力观察、氧化酶试验及过氧化氢酶试验(试剂
配方见附录A中A5,A6) o
胎儿弯曲杆菌为革兰氏染色阴性,呈螺旋状或“S,,状,一些老龄培养物可出现球状或球杆状,不形
成芽胞和荚膜,在菌体的一端或两端有鞭毛,呈特征快速螺旋状穿梭运动。氧化酶试验为阳性
:5.1.25.2 纯培养平板用后尽快放回混合气体环境中,以备进一步做生化试验用。生化试验
2.5-2.1 将符合2.5.1.1条的培养物按表1进行生化试验。
表 1 胎儿弯曲杆菌生化反应
菌名
过氧化氢
酶试验
硫化氢
(H,S)
试验
生长试验 药敏试验 马尿酸
钠水解
试验
氧化酶
试验25 C 42C 1%甘
氨酸
1%胆
汁
3.5%抓
化钠(N.Cl)
蔡陡酮
酸30 0g/片
头抱称素
30 pg/片
胎儿弯曲杆
菌胎儿亚种
于 + + + + R S 十
胎儿弯曲杆
菌性病亚种
+ + + R S
2.5-2.2 所有生化试验管均于混合气体环境中培养3d。带胶盖或螺旋盖的试管,培养时应将试管盖
放松。
2.5.2.3 生长试验:纯培养后的菌接种到2管疏基乙酸肉汤(见附录A中A4)中,分别放43℃和25 C
温箱培养72 h观察结果,肉汤上层出现雾状混浊时,说明细菌已生长。
2. 5.2.4 硫化氢(H,S)试验:纯培养后的可疑菌种接种于琉基乙酸肉汤中,试管口悬吊一条长X宽为
20 mm X 6 mm的乙酸铅滤纸,观察3d-4d,如见滤纸变黑即为产生H多之证。
2.5.2.5 甘氨酸、抓化钠、胆汁生长试验:可疑菌种分别接种于含1%甘氨酸、3.50o抓化钠、1%胆汁生
长的琉基乙酸肉汤中,37 C培养72 h,培养基近表面有云雾状生长为阳性。
2. 5. 2.6 药物敏感试验:用铂金耳挑取可疑菌落放于1 mL灭菌生理盐水试管中,菌液浓度约为3X
10“个/ml,用灭菌1棉拭子馥取细菌稀释液涂于MH琼脂平板上,然后用镊子把含有30 t}g蔡吮酮酸
和头抱霉素的滤纸片贴在MH血平板上,在混合气体中37-C培养24 h-72 h,量溶菌区,0>-18
敏感,0镇14 mm为不敏感。
mm为
229
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2.5-2.7 马尿酸钠水解试验:取48 h--72 h培养物接种于。4 mLl%马尿酸钠液(见附录A中A7. 1)
中制成浓厚菌悬液35C-37C水浴2h,再加人。.2 mI苟三酮试剂(见附录A中A7.2),混匀后水浴
20 min观察结果,变深紫色为阳性,淡紫色或不变色为阴性。可用18 h-24 h变形杆菌培养物作阳性
对照
2.5. 3 结果判定
根据2.5.1和2.5.2的结果进行。
2.5.11 凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特性的菌,均判定为胎儿弯曲杆菌。
2.5-3.2 过氧化氢酶试验,H2S试验,1%胆汁生长试验,3.5Y.抓化钠生长试验和马尿酸水解试验,其
中任何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性,均判定为非胎儿弯曲杆菌。
2.6
结果的表示
2.6.1 阳性结果:“发现胎儿弯曲杆菌”、“发现胎儿弯曲杆菌胎儿亚种”或“发现胎儿弯曲杆菌性病
亚种”
2.6.2 阴性结果:“未发现胎儿弯曲杆菌”。
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附 录 A
(标准的附录)
培养基和试荆
A1 增菌运输培养墓(transport enrichment medium,TEM)
成牛血清 1 000 MI
5-氟尿啥咤 。·3g
放线菌酮 。,19
蔡吮酮酸 3 mg
多粘菌素B 100 000 IU
100煌绿 5 ml,
将各种成分无菌操作加人到成牛血清中,充分混合后分装于20 ml一带胶皮塞(能密闭)的玻璃瓶
中,每瓶8 MI,然后水浴或在蒸气中加热2 min--3 min(无压力),使血清凝固,冷却后用灭菌玻璃棒将
血清凝块捣碎。最后无菌操作充人混合气体[3.5%氧气(Oz),10%二氧化碳(C02),86.5%氮气(N,)]o
将制备好的TEM培养基保存在4'C冰箱中,可使用4个月。
A2 CH培养基(cysteine heart blood agar)(含抗菌索)
牛心浸液(或牛心粉30 g) 500 g
胰蛋白陈 10g
右旋糖 10g
抓化钠 59
L一半胧氨酸 19
琼脂 129
蒸馏水 1 000 ml_
pH6. 9-7. 0
加热溶解各成分后107. 9 kPa高压15 min,培养基冷却至50C-55℃时,无菌加人:
多粘菌素B 2 mg
新生霉素 2 mg
放线菌酮 20 mg
绵羊血 100 mL
混匀,倾注平板。放4C水箱备用。
A3 MH培养基(mueller hinton agar)(含抗菌寮)
牛肉浸膏
酪蛋白水解物
淀粉
琼脂
蒸馏水
pH7. 4士0.2
各成分加热溶解,107.9 kPa高压15
杆菌肤
5g
17. 5 g
1. 5 g
15 g
1 000 ml,
min,冷却至50 C ^-55 C时,无菌加人:
25 000 IU
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放线菌酮
多粘菌素B
新生霉素
绵羊血
混匀,倾注平板。4C冰箱保存。
50 mg
1万 lu
5 mg
50 m[一 100 mL
A4 疏基乙酸盐肉汤
1,胧氨酸 。.5 mg
氯化钠 2.smg
右旋糖 5.5g
酵母浸膏 5·。g
酪蛋自胰消化物(Pancreatic Digest of Casein) 15. 0 g
琉基乙酸钠 。·59
蒸馏水 1 000 ml
加热至溶解,调整pH7. 2士0. 2,5 mL试管分装,107. 9 kPa高压灭菌15 min,
新制备的培养基(Al-A4)均应做无菌检查,并用已知阳性菌和阴性菌进行测试,以保证培养基的
质量。
A5 氧化酶试剂
1写盐酸二甲苯对苯二胺水溶液,置棕色瓶中现用现配,-lo℃保存,有效期一周。用于氧化酶试验
A6 3%过妞化氮(H202)
30写H202 10 ml -
蒸馏水 90 ml,
装于棕色瓶中,有效期为一周。
用于触酶试验。
A了 马尿酸盐水解试验
A7.1 1%马尿酸钠
马尿酸钠 1g
蒸馏水 100 ml
A7.2 水合荀三酮
苟三酮 3.5 g
丙酮 50 mL
丁酮 50 ml,
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附 录 B
(提示的附录)
胎儿弯曲杆菌分离鉴定程序示意图
2sa