大豆苷元与人血清白蛋白的相互作用研究

第29卷，第7期 2009年7月 光谱学与光谱分析 V01．29，No．7，ppl911—1914 SpectroscopyandSpectralAnalysis July，2009 大豆苷元与人血清白蛋白的相互作用研究 吴秋华，王东跃，周 欣，张志恒，刘伟华，王 志。 河北农业大学理学院，河北保定071001 摘要采用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱和紫外一可见吸收光谱，研究了大豆苷元与人血清白蛋白(HSA) 之间的结合反应。大豆苷元对人血清白蛋白有较强的荧光猝灭作用，猝灭机制属于静态猝灭，并发生了分子 内非辐射能量转移。利用Stern-Volmer方程处理实验数据，得到大豆苷元与HSA之间的结合常数／G为 0．34×104(23℃)，1．10×104(30℃)和4．36×104L·mol一1(40℃)。根据F6rster非辐射能量转移理论，求 出了大豆苷元与HSA之间的结合距离为1．50rim(23℃)，1．46rim(30℃)和1．42rim(40℃)。通过计算相 应的热力学参数，可知大豆苷元与人血清白蛋白的相瓦作用是一个吉布斯自由能降低的自发过程，且二者 之间的主要作用力类型为疏水作用力，同时用同步荧光光谱考察了大豆苷元对HSA构象的影响。 关键词大豆苷元；HsA；相互作用；荧光光谱 中图分类号：0641．3文献标识码：A DOl：10．3964／j．issn．1000-0593{2009}07—1911-04 引 言 药物进入人体后，首先与血清白蛋白结合，然后通过运 输和转运，才能产生药效或毒副作用，因此药物与血清白蛋 白相互作用的研究对于从分子水平上了解药物的作用机理、 毒理和代谢情况，从而对选择最佳用药量、用药周期以及多 种药物联用的最佳配比等具有重要指导意义。人血清白蛋白 是血液中主要的蛋白之一，担负着药物的贮存、运输等重要 作用，常常作为研究药物与蛋白质相互作用的模型蛋白[1{]。 大豆异黄酮是大豆生长过程中形成的一类次生代谢产物，是 大豆中重要的功能活性成分之一，具有抗癌、抗肿瘤、降血 脂、抗动脉粥样硬化、预防骨质疏松症、较强的抗氧化和抗 真菌等生物活性，目前大豆异黄酮已经成为市售的重要保健 食品L6J。大豆苷元(Daidzein)是大豆异黄酮中的一种。本实 验采用荧光光谱和紫外光谱研究了大豆苷元与人血清白蛋白 的相互作用机理，得出了大豆苷元与血清白蛋白之间的表观 结合常数K一，结合位点数，z及结合距离r，根据热力学参数 确定了其相互作用力类型，并用同步荧光光谱研究了大豆苷 元对血清白蛋白构象的影响。这些研究为阐明药物在体内的 输送和代谢过程，了解药物分子在生物体中的作用机理提供 了实验数据和理论基础。 1实验部分 1．1仪器与试剂 Uv-2501PC紫外一可见分光光度计(日本岛津公司)，F- 4500型荧光分光光度计(日本日立公司)，TB--85恒温水浴装 置(日本岛津公司)；大豆苷元(Daidzin，中国药品生物制品 检定所)，人血清白蛋白(HSA，Sigma)，Tris(Serva)，其他 试剂均为分析纯，实验用水为二次去离子水。以Tris-HCl缓 冲溶液(pH7．4，含0．1tool·L-1NaCI维持溶液的离子强 度)为溶剂配制成1．0×10-5mol·L-1的HSA溶液备 用。大豆苷元用乙醇配成2．0X10-3tool·L-1的标准溶液备 用。 1．2实验方法 准确移取一定量的大豆苷元乙醇标准溶液于10mL比 色管中，待乙醇挥发完全后，加入HSA标准溶液5mL，超 声分散5min，一定温度下恒温2h后，激发和发射光栅狭缝 均为5nnl，激发波长为283lll'n，恒温扫描在一定波长范围 内HSA的荧光发射光谱、HSA在大豆苷元作用下的荧光猝 灭光谱、同步荧光光谱#以T矗s-Hcl缓冲溶液为溶剂配制 1．0×10_5tool·L-1的大豆苷元溶液，恒温测定其300～500 Ills的UV吸收光谱。 收稿日期：2008-03-09，修订日期：2008-06—12 基金项目：人事部留学人员科技择优资助项目。河北省自然科学基金项目(B2006000413)和河北农业大学科研发展基金项目资助 作者简介：吴秋华．1969年生，河北农业大学理学院副教授e-mail：wqh69{园yahoo．com．∞ *通讯联系人 e-mail：wangzhi@hebau．edu∞ 万方数据 1912 光谱学与光谱分析 第29卷 2结果与讨论 2．1大豆苷元对liSA荧光的猝灭光谱及猝灭机镧 2．1．1荧光猝灭光谱 HSA分子中因含有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙 氨酸(Phe)等残基而发射一定强度的内源荧光。图1是按照 实验方法在人血清白蛋白中加入不同量的大豆苷元的荧光光 谱．HSA在336帆处有较强的荧光，它应该主要产生于 Trp残基。随着大豆苷元浓度的增加，336胁附近的荧光强 度被有规律地猝灭，这说明大豆苷元与HSA发生了相互作 用。大豆苷元与HSA的结合位点接近于HSA中的Trp残 基。 300 360 400 450 500 Wavelength／nm Fir,．1Flucomom艘quenchingspectraofdaidzein-HSA cHSA；1．0×10—5mol·L一1I f山甜-eh／10一5mol·L一1， from1to8l0，0．25，0．5t0．75，1．25，1．5，2．0and2．25 2．1．2荧光猝灭机制 荧光猝灭的原因主要有动态猝灭、静态猝灭和非辐射能 量转移[7]。一般情况下，动态和静态猝灭可以通过以下几个 方面来确定：(1)荧光猝灭实验数据与SterrrVoliner方程吻 合，可能是动态猝灭；(2)双分子动态猝灭速率常数K。>2．0 ×1010L-mol_1·S-1时，可以推断动态猝灭不是主要原因 (猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭常数约为2．0×1010L ·mol叫·S-1)#(3)由于动态猝灭依赖于扩散运动，温度升 高扩散加快，则动态猝灭常数将随着温度的升高而增大，故 可依据不同温度下的实验结果加以区别；(4)动态猝灭只影 响到荧光体分子的激发态，不改变荧光体的吸收光谱，而静 态猝灭中，基态配合物的生成会导致荧光体的吸收光谱的改 变，所以可以观察含与不含药物时蛋白质的吸收光谱有无改 变来判别猝灭类型。此外，还有其它判别方式。值得说明的 是仅凭其中某一个方面的结论，往往得不出正确结论，需要 综合考虑。 为了证实大豆苷元对HSA的荧光猝灭机制，先将此过 程按动态猝灭即SterwVolmer猝灭方程(1)处理[9] Fo／F=1+K。ro[Q-一1+Ksv[Q](1) 其中F和Fo分别是加入和不加入药物时HSA溶液的荧光 强度，[Q]是药物的总浓度，Ksv是Stem-Volmer猝灭常数， K。为双分子猝灭过程的速率常数，ro为猝灭剂不存在时荧 光分子的平均寿命，生物大分子的平均寿命约为loqs[9|。 图2为不同温度时大豆苷元对HSA猝灭的Stern-Voliner曲 线，由曲线求得K．w分别为2．9X104L·mol_1(23℃)，2．4 ×104L·mol_1(30℃)，2．0×10‘L·mol_1(40℃)，结果 表明随着温度的升高，动态猝灭常数K．w降低，故可初步证 明药物与HSA的结合过程为静态猝灭过程，并且由Kw得 出相应的K。分别为2．9×1012，2．4X1012和2．0×1012L· mol-1·S-1，此值远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动 态猝灭速率常数(2．0×1010L·raol一1·S-1)，又进一步证明 此过程是由于药物和蛋白形成了复合物，从而引起静态猝 灭。 嚣℃ ∞℃ 40℃ O．4 o．8 1．2 1．6 IQWlo-6mol·L-1) lng．2Stern-Volmercnrv嚣offlucrmomee quenchingoflISAbydaidzein 2．2大豆苷元与lISA的裹观结合常数甄以及结合位点 数一 静态猝灭是指荧光体分子与猝灭剂分子彼此结合形成了 具有一定结构的复合物。从而导致荧光体荧光强度减弱的现 象，可用双对数方程进行描述[11] lg(Fo—F)／F=IgK+．IgECt](2) 以lg(Fo--F)／F对lgEQ]作图可得一直线，由直线斜率和截 距求出大豆苷元与蛋白质分子的结合常数K^及结合位点数 行(如表1所示)． 鼬1mnd自mgeomtan忸(J【^)，岫帕崦nmntz瞒(一)，bindingdistance(r) andthetIIen疆—”_anIicparametershetwomDaidzeinandHSA ∞ ∞ ∞ ∞ ∞ 加 l l l l l l ：l，舢 ∞ ∞ m 0 §8l三‰ 万方数据 第7期 光谱学与光谱分析 1913 由所得数据可以看出，大豆苷元与HSA的结合受温度影响 较大。在实验温度范围内，其结合常数和结合位点数均随温 度升高而升高，说明在该温度范围内，升温利于二者结合。 2．3大豆苷元在HSA上结合位置的求取 由大豆苷元的紫外吸收光谱和HSA的荧光光谱的重叠 光谱图，根据FOrster偶极-l禺极非辐射能量转移理论[11’12]， 可以求出23℃时大豆苷元与HSA摩尔浓度比为1：1时的 重叠积分J=1．10X10_15(cm3·L·t001．1)，相应温度下的 ，．值见表1。r值小于7nrfl说明大豆苷元可以能量转移的方 式与HSA发生作用，导致HSA的荧光猝灭。 2．4大豆苷元与HSA之间作用力类型的判断 据热力学公式，在温度变化不大时，反应的焓变AH可 以看作一个常数，由反应的平衡常数可以求出反应的自由能 变△IG △G=一舸lnK (3) 然后根据下式分别求出△H和△S InK2／K1=I-IIT1—1／T2]△H／R (4) △G=AH一心 (5) 根据反应前后热力学焓变△H和熵变△s的相对大小， 可以判断大豆苷元与蛋白质之间的主要作用力类型[13]。由 上述公式求得大豆苷元与HSA结合反应的热力学参数，结 果见表1。 由表中数据可以看出：△H>O，AS>0，所以大豆苷元 与HSA之间的作用力主要为疏水作用力，且△|GKo说明大 豆苷元与HSA之间的结合是自发进行的。 2．5大豆苷元对HSA构象的影响 同步荧光光谱可以反映蛋白质构象的变化。由At=15 nnl所作同步荧光光谱只显示Tyr残基的光谱特征，而出= 60啪的同步荧光光谱仅显示Trp残基的光谱特征[N-lz]。如 图3中(a)和(b)分别为越=15sln和At=60nrnHSA和大 豆苷元作用下HSA的同步荧光光谱图，图中显示，在HSA 浓度固定时，随大豆苷元浓度的增加，T”残基的最大发射 波长基本保持不变，而Trp残基的最大发射波长发生了红 移，说明Trp残基所处的微环境疏水性降低，引起HSA构 象发生变化‘；5-19]。 270 280 290 300 310 320 Wavelength／rim 250260270280290,300310320 Wavelengtll，nm 脚3SynchrmmmtimspectraofKSA-daidzdn (a)：△l=15nn'l；(b)：Ah=60nm!cdB池由／lO一5mol·L～， fromlto9：0，0．25．0．5，0．75，1，1．25。1．50，2．0，2．25 3结论 实验表明，大豆苷元对HSA的荧光猝灭属于静态猝灭 机制，且分子内发生了非辐射能量转移；二者主要靠疏水作 用力相结合，结合位点接近于HSA中的Trp残基，且结合 后使Trp残基所处的微环境极性略有降低，引起HSA的构 象发生变化。 参 考 文 献 WANGChun，WUQiuhua，LICairui，etaLAnal．Sci．，2007，23(4)：429． WANGChun，WUQiu-hua，WANGZhi，etal(王春，吴秋华，王志。等)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)t 2007，27(12)：2498． SUzho眶，QINChuan，XIEMeng-xia(苏忠，秦川。谢孟峡，等)．ActaChi札Sinica(化学学报)，2007，65(4)：329． HUYan-jun，LIUYi，PIZhen-pang，elaLBicoranicandMedicalChemistry，2005，13l6609． ， WANG(：hun。WUQiu-hua．WANGZhi，etal(王春，吴秋华，王志，等)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)， 2007，27(4)：754． JiangsuNewMedicalCollege(江苏新医学院编)．DictionaryofChineseMateriaMedica(中药大辞典)．Shanghai．．ShanghaiScientificand TechnologicalPublishers(上海：上海科学技术出版社)，1985． GUOYan-jun(郭尧君)．FluorescenceExperimentTechnologyandItsAppli髓ti∞inMolecularBiology(荧光实验技术及其在分子生物学 中的应用)．BdiinglScieBcePressCIB京：科学出版社)，1983． CHENGuo-zhen。HUANGXian-zhi，ZHENGZhu-zi，etal(陈国珍，黄贤智，郑朱梓，等)．FluorescenceAnalysisMethod(荧光分析 法)．Beijing,SciencePressClE京：科学出版社)，1990． YANCheng-nong，TONGJin--qiang，XIONGD弧，etal(颜乘农，童金强，熊丹，等)．ChineseJ．AnalChem．(分析化学)．2006，34 (6)：796． 6 2 8 4 O l譬l匠 ∞ ∞ m O 02la箔￡o=L!I ]] ]]] ] ] ] ] l 2 3 4 5 6 7 8 9 [[ [[[ [ [ [ [ 万方数据 1914 光谱学与光谱分析 第29卷 YANGMan-man，YANGPin，ZHANGLi-wei(杨曼曼，杨频，张立伟)．Chin．Sci．Bull．(科学通报)。1994，39(1)：374． YANGPin，GAOFei(杨频，高飞)．T-IIePrinciplesofBioinorganicChemistry(生物无机化学原理)．Beijing：SciencePressCIP．京：科 学出版社)，2002． F6rsterT，Sinanogluo．ModemQuantumChemistry．NewYork：AcademicPress，1996． RossPD，SubramanianSBiochemistry，1981，20：3096． SHAOShuang，MA80-妒ng，WANGXue-jie，etal(邵爽，马博英，王学杰，等)．AetaPhys．-Chim．Sin．(物理化学学报)，2005。21 (7)：792． TANFei，GU0Ming。YUQin-sen．Spectrochim．AetaPartA。2005，61：3006． WUQiu-hua，WANGChun，WANGZhi，etal(哭秋华，王春，王志，等)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)， 2007，27(11)：2317． WANGChun。WUQiu-hua，WANGZK，eta1．Anal．Sd．，2006，22(3)：435． WANGChun，wUQitrhua，WANGZhi，etal(王春，吴秋华，王志，等)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)， 2006，26(9)：1672． WUGen-hua，WANGChun-hua(吴根华，汪春华)．SpectroscopyandSpectralAnalysis(光谱学与光谱分析)，2005，25(2)：246． StudyontheInteractionbetweenDaidzeinandHumanSerumAlbumin WUQitrhua，WANGDong-yue，ZHOUXin，ZHANGZhi-heng，LIUWei-hua，WANGZhi。 CollegeofScience，AgriculturalUniversityofHebei，Baoding071001，China AbstractThebindingreactionbetweendaidzeinandhumanserulTlalbumin(HAS)wasstudiedbyfluorescencequenchingspec- tra．synchronousfluorescencespectraandultravioletspectra．Theresultsindicatedthatdaidzeinledtothequenchingofthein— trinsicfluorescenceofHS八ThefluorescencequenchingmechanismbetweendaidzeinandHSAwasmainlystaticquenching， withnon-radiationenergytransferoccurringwithinsinglemolecule．Thebindingconstants(KA)betweendaidzeinandHSA were0．34×104(23℃)，1．10X104(30℃)and4．36×104(40℃)，respectively．AccordingtotheFOrstertheoryofnon—radia- tionenergytransfer，thebindingdistances(r)were1．50R1TI(23℃)，1．46nrn(30℃)and1．42IlIIl(40℃)，respectively．The thermodynamicparameterswerecalculated，whichindicatedthatthehydrophobicforceplayedmajorrolesbetweendaidzeinand human8erl／nlalbumin．TheeffectofdaidzeinontheconformationofHASwasinvestigatedusingsynchronousspectrum． KeywordsDaidzein；Humanserumalbumin；Interaction；Fluorescencespectroscopy *Correspondingauthor (ReceivedMar．9，2008；acceptedJurL12，2008) 叼I=I 幻胡钉 习明 力鲫 叼 I=I n n n I=I 口I=I n口 {=l 万方数据 大豆苷元与人血清白蛋白的相互作用研究 作者： 吴秋华， 王东跃， 周欣， 张志恒， 刘伟华， 王志， WU Qiu-hua， WANG Dong-yue， ZHOU Xin， ZHANG Zhi-heng， LIU Wei-hua， WANG Zhi 作者单位： 河北农业大学理学院,河北,保定,071001 刊名： 光谱学与光谱分析 英文刊名： SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS 年，卷(期)： 2009,29(7) 被引用次数： 4次 参考文献(19条) 1.WANG Chun.WU Qiuhua.LI Cairui 查看详情 2007(04) 2.王春.吴秋华.王志 查看详情 2007(12) 3.苏忠.秦川.谢孟峡 查看详情 2007(04) 4.HU Yan-jun.LIU Yi.PI Zhen-pang 查看详情 2005 5.王春.吴秋华.王志 查看详情[期刊论文]-Spectroscopy and Spectral Analysis 2007(04) 6.江苏新医学院 中药大辞典 1985 7.郭尧君 荧光实验技术及其在分子生物学中的应用 1983 8.陈国珍.黄贤智.郑朱梓 荧光分析法 1990 9.颜乘农.童金强.熊丹 查看详情 2006(06) 10.杨曼曼.杨频.张立伟 查看详情 1994(01) 11.杨频.高飞 生物无机化学原理 2002 12.F(o)rster T.Sinanoglu O Modern Quantum Chemistry 1996 13.Ross P D.Subramanian S 查看详情 1981 14.邵爽.马博英.王学杰 查看详情[期刊论文]-物理化学学报 2005(07) 15.TAN Fei.GUO Ming.YU Qin-sen 查看详情 2005 16.吴秋华.王春.王志 查看详情[期刊论文]-Spectroscopy and Spectral Analysis 2007(11) 17.WANG Chun.WU Qiu-hua.WANG Zhi 查看详情 2006(03) 18.王春.吴秋华.王志 查看详情[期刊论文]-Spectroscopy and Spectral Analysis 2006(09) 19.吴根华.汪春华 查看详情[期刊论文]-Spectroscopy and Spectral Analysis 2005(02) 引证文献(4条) 1.裴明砚.郑学仿.曹洪玉.唐乾 3-溴丙酮酸与人血清白蛋白相互作用的光谱学研究[期刊论文]-分析化学 2010(7) 2.蔡雪梅.刘冷.李建晴 金属离子对一种ICT荧光探针与人血清白蛋白作用的影响[期刊论文]-晋中学院学报 2010(3) 3.罗娅君.杨葵华.李辉容.雷雨 大豆黄素磷脂复合物的制备及光谱学分析[期刊论文]-分析化学 2009(z1) 4.谢显传.王晓蓉.张幼宽.郑建中.吴颖欣.薛银刚 十溴联苯醚与牛血清白蛋白相互作用的荧光光谱研究[期刊论文] -分析化学 2010(10) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_gpxygpfx200907044.aspx