第二章56 目的基因连接及导入

第五节 目的基因与载体连接 第五节 目的基因与载体连接 基因之 二、 目的基因与载体的连接（接） 质粒 DNA分子 一个切口 两个黏性末端 两个切口 获得目的基因 DNA 连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。 （主要有以下4种连接方式） 1) 粘性末端连接 2） 平头末端连接 3） 人工接头法 4） 同源多聚尾连接法 工具酶：基因工程中的工具酶主要包括用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、逆转录等相关的各种酶类。 几种重要的工具酶 活性 限制性核酸内切酶 识别特异碱基序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA5ˊ-磷酸与3ˊ-羟基 形成磷酸二酯键 DNA聚合酶 以DNA为模板合成DNA 逆转录酶 以RNA为模板合成cDNA 碱性磷酸酶 切除5－末端磷酸 T4多聚核苷酸激酶 催化核酸5'-羟基磷酸化 末端脱氧核苷酸转移酶 催化3'-端合成同聚尾 DNA连接酶 只能催化互补粘性末端之间的连接 DNA 连接酶（DNA ligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘-OH 末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。 催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低 。 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生相同粘性末端，再通过DNA连接酶作用将两者连接起来，构成重组DNA分子。 用同一种或两种 限制性内切酶酶切 DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 本法适用于在质粒和目的基因上有相同单或双酶切位点 （一） 粘性末端连接 有些限制酶只能将目的基因和载体DNA切割成平端，此时在T4DNA连接酶的作用下同样能连接起来。 质粒 产生平末端的 内切酶 DNA连接酶 产生粘性末端 的内切酶 核酸酶S1 目的基因 重组质粒 核酸酶S1 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ （二）平头末端连接 （三） 人工接头法 合成连接子→与DNA平头末端连接→限制酶切割,产生粘性末端→连接，构建重组DNA。 用接头连接 用同一种 限制性内切酶酶切 DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 + + DNA连接酶 接头(linker) 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点！ （四）同源多聚尾连接法 尾接法 DNA连接酶 重组质粒 质粒 目的基因 内切酶 末端转移酶 +dGTP 末端转移酶 +dCTP 本法适用于在质粒 和目的基因上没有相 同的酶切位点 基因与载体的平末端连接方法有哪些？ (1)T4DNA连接酶法 连接平末端DNA分子的方法有2种，一种是直接用T4DNA连接酶连接，另一种是先用末端核苷酸转移酶给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接。T4DNA连接酶同一般的大肠杆菌DNA连接酶不同。T4DNA连接酶除了能够封闭具有3’-OH和5’-P末端的双链DNA的缺口之外,在存在ATP和加入高浓度酶的条件下,它还能够连接具有完全配对碱基的平末端DNA分子,但其连接效率比粘性端要低的多。 （2） 同聚物加尾法 5’特意的核酸外切酶处理目的基因及质粒的平末端，移去几个末端核苷酸。运用末端核苷酰转移酶，能够将核苷酸（通过脱氧核苷三磷酸前体）加到DNA分子单链延伸末端的3’-OH基因上,它并不需要模板链的存在,它一个一个加上核苷酸,构成由核苷酸组成的尾巴,长度可达100个核苷酸。在载体中加入dTTP和末端核苷酸转移酶，在载体3’－OH末端延伸形成单链PolyT尾巴。将两者混合发生互补连接，缺口用DNA连接酶封闭。 3）用化学合成的衔接物连接 DNA分子用化学合成法合成一段10－12个核苷酸，具有限制酶识别位点的寡核苷酸片段，磷酸化后，通过T4DNA连接酶，将片段分别于载体5’端和目的基因片段5’连接起来。用相应的限制性内切酶处理，产生互补的粘性末端。 4）T-A克隆法： TagDNA聚合酶在扩增目的基因DNA的同时，还能不依赖模版在产物3’末端加上两个游离的A。只要载体切口除人工加上的游离T，PCR产物即可于载体连接。 T-A克隆 T-vector两条链的5’端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3’端多加一个A 1.用一定的_________切割 质粒，使其出现一个切 口，露出____________。 2.用_____________切断目 的基因，使其产生_____ ____________。 3.将切下的目的基因片段插入质粒的______处， 再加入适量___________，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒） 限制酶 黏性末端 同一种限制酶 的黏性末端 切口 DNA连接酶 相同 质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶（如EcoRI）消化酶切后, 两者的两端均具有相同的粘性末端, 称为单酶切点的粘性末端, 又称全同源性粘性末端 ⑴ 高背景 载体经单一限制性核酸内切酶切割后, 载体分子易于自我环化, 既不利于目的基因的重组连接, 大大降低阳性克隆效率, 又可使非重组性载体造成高背景。为了防止载体的自我环化，通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的 5’-P以抑制DNA的自我环化。在连接反应中, 具有5’-P的目的基因DNA片断可有效地与去磷酸化质粒DNA载体通过粘性末端发生互补连接, 尽管产生的重组DNA分子于连接点含有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环, 但转化大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复。 ⑵ 双向插入 经单一限制核酸内切酶（如EcoRI）切割的目的基因和载体, 因二者的粘性末端是相同的, 因此在连接反应中, 目的基因可发生双向插入, 载体对目的基因表达是有方向的, 而目的基因可双向与之相连, 这种连接若以克隆目的基因片段为目的没有影响, 若以表达为目的, 我们就要对插入的片段进行方向鉴定, 因目的基因由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的, 一旦启动子与目的基因编码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的mRNA。若构建表达DNA重组体选用双酶切切割目的基因和载体，可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组, 以便定向克隆。 第六节 重组DNA导入受体细胞 基因工程之 在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。 由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。 转—重组DNA导入宿主细胞 受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。 分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。 具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠 ；在标记上和载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全。 受体细胞条件 原核生物细胞是较为理想的受体细胞： ①没有细胞壁，便于外源DNA 的进入； ②没有核膜，染色体DNA 没有固定结合的蛋白质，便于外源DNA与染色体DNA 重组； ③基因组小，遗传背景简单，便于外源基因的遗传； ④容易获得一致性的实验材料，培养简单，繁殖迅速，易重复。 表达真核生物基因存在一定的缺陷，很多真核生物基因往往不能在原核生物细胞内表达出具有生物活性的功能蛋白。 需要进行适当的修饰 酵母作为受体细胞，除了真核生物细胞共有的特性外，还具有以下优点： ①基因结构相对简单，其基因表达调控机制研究比较清楚，便于基因工程操作； ②培养简单，适于大规模生产，成本低廉；③可以分泌表达，便于产物的提取和加工； ④不产生毒素，是安全的受体细胞。 真核生物细胞-酵母受体细胞 植物细胞作为受体细胞，除了真核细胞共有的特性外，最突出的优点就是其体细胞的全能性，一个获得外源基因的体细胞可以培养出能稳定遗传的植株或品系。 不足之处是植物细胞有纤维素参与组成的坚硬细胞壁，不利于摄取重组DNA 分子。 动物细胞同样可以作为受体细胞。早期多采用生殖细胞、受精卵细胞或胚细胞作为受体细胞，近年来干细胞成为新的研究热点。 原核生物细胞，大肠杆菌 优点：结构简单，便于操作分析 缺点：表达蛋白可能没有活性 真核生物细胞，酵母 优点：表达蛋白加工具有活性 缺点：操作相对麻烦 大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。 通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。 感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。 一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。 1、直接导入法： （1）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。 （2）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。 （3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。 （4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。 基因导入方法 又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。 （1）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法； 将外源基因通过毛细玻璃管，再显微镜下注释到受精卵的细胞核内的方法。 （2）电转化法 也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。 该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。     电穿孔法具有简便、快速、效率高等优点 电击的处理方式对转化率有着决定性的作用，有两种不同的处理方式：一种是较低的电压，处理较长的时间（350V/cm 54s）；另一种是高电压，短时间处理（1－1.25kV/cm,10s)。一般常用第二种处理方式。 1.磷酸钙沉淀法 利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与λ噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬 DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。 （3）直接吸收法： Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化的可能原因： ①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要 Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用，因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞，可以提高DNA的转化效率。如利用二甲基亚砜(DMSO)和二硫苏糖醇(DDT)等进一步处理细胞，能诱导高频感受态细胞的形成，转化效率可提高100～1000倍，且对大小质粒分子均可进行有效的转化。 但该法要求条件高，对外界污染物极为敏感，通常很少采用。 （4）基因枪技术 又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰击法 基本原理：将DNA吸附在微型子弹(1µm)的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。 基本做法：先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5µm )共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。 基因枪转化的操作步骤 靶细胞或组织的预处理 微粒子弹的制备 装备基因枪 轰击 过渡培养 进行筛选培养或 直接分化再生植株 PDS-1000 | He System 无宿主限制：农杆菌介导法只对双子叶植物敏感，限制了它的应用范围。而基因枪没有物种限制。 靶受体类型广泛：可以是原生质体，叶片，悬浮细胞，茎或根切段，种子胚，愈伤组织，花粉等。 操作简单快速 基因枪法转化的优点有： 便携式基因枪 1.体外包装转染法 又称感染，将目的基因放在载体上，感染到要表达的细胞中, 并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。 常用的载体是质粒、λ噬菌体、科斯质粒。 2、间接导入法 2.脂质体介导法 脂质体(又叫做人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂质体内，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。 这种方法具有许多方面的优点,包括可保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用,降低了对细胞的毒性效应,适用的植物种类广泛,重复性高,包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等。 人们很早就发现双子叶植物常发生一种冠瘿瘤病，该病在法国、东欧和意大利的葡萄和果树上曾大面积发生。 1907年 Smith和Townsent等 首先发现这种冠瘿瘤 病是由根癌农杆菌 引发的。 3.农杆菌的Ti质粒与植物遗传转化 Tumor induced by A. tumefaciens 农杆菌介导法转基因的基本 生理状态 来源 植物愈伤组织的诱导 农杆菌的活化 愈伤组织 农杆菌 的共培养 抗性愈伤组织 获得及植株再生 菌 种 活化状态 培养基成分 缩短组培时间 提高再生频率 农杆菌的活化 挑单克隆 测OD600 收集细胞 用液体MS培养基重悬细胞 将预培养的外植体放入菌液中共培养 100rpm,30min 取出外植体在无菌滤纸上吸干菌液 共培养 在含有选择压力的培养基上诱导细胞分化，形成转化芽 生根，形成转化植株 花粉管通道法 微注射法：一般适合于较大花的农作物如棉花等。利用微量注射器将基因溶液注射进入受精子房 柱头滴加：在授粉前后，将转基因溶液滴加在柱头上 花粉粒携带：即用基因溶液处理花粉粒，让花粉粒吸入基因，然后授粉。 优点：利用整体植株的卵细胞、受精卵或早期胚细胞转化DNA，无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一套人工培养过程。方法简便；单、双子叶植物均可应用；育种时间短。 这一技术局限欲开花时间才能应用；对DNA大小纯度要求高。 思考 1、获得目的基因有那些途径? 2、受体细胞的选择应重点考虑那些 因素？ 3、酵母作为受体细胞有那些特点？ 4、外源DNA 转化方法有那些？