多囊卵巢患者行未成熟卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育观察
第25卷第2期Vo1.25,No.2
2005年2月Feb.2005
牛 殖 与 避 孕
Reproduction&Contraception
http://www.rande.cn
rande@sippr.stc.sh.cn
多囊卵巢患者行未成熟卵母细胞体外
成熟、受精和胚胎发育观察
高敏芝 汪玉宝 顾敦瑜 吴晓云 李忠妹
(上海 l1』计划牛育科学研究所 孕症、试管婴儿q1心, 海,2 0 0 0 3 2)
【摘要】目的:探索在不用或小剂量使用促性腺激素条件下对多囊卵巢患者的未成熟卵母细胞...
第25卷第2期Vo1.25,No.2
2005年2月Feb.2005
牛 殖 与 避 孕
Reproduction&Contraception
http://www.rande.cn
rande@sippr.stc.sh.cn
多囊卵巢患者行未成熟卵母细胞体外
成熟、受精和胚胎发育观察
高敏芝 汪玉宝 顾敦瑜 吴晓云 李忠妹
(上海 l1』
牛育科学研究所 孕症、试管婴儿q1心, 海,2 0 0 0 3 2)
【摘要】目的:探索在不用或小剂量使用促性腺激素条件下对多囊卵巢患者的未成熟卵母细胞体外
培养至成熟、受精、卵裂和妊娠的可行性。方法:阴道B超引导下穿刺取卵后将卵子分别培养于3
种不同培养基:基本培养基(卜HTF+7 5 mIU/mL rFSH+500 mIU/mL rhCG)+1 0%SPS(SPS组),基本培
养基+2O%hFF(FF组)和基本培养基+2O%hFF+2 ng/mL rEGF(FF+EGF组),共培养2 5—48 h,然
后行体外受精和胚胎培养。结果:体外培养卵丘一卵母细胞复合体1 02个,成熟率6 5.69%,受精率
8 3.58%,2PN率7i.4 3%,卵裂率5i.72%,优质胚胎率4O.00%。FF组较SPS组有更高的成熟、受精、
卵裂和优质胚胎率,再添加EGF后卵子的成熟、受精和优质胚胎率增加。刺激组和未刺激组在卵子
成熟、受精、卵裂和优质胚胎率方面均无显著差异。PCO患者卵子的成熟、受精、卵裂和优质胚胎
率均高于PCOS患者,ICSI组优质胚胎率增加,但均无统计学差异。随培养时间延长,卵子的成熟、受
精、卵裂和优质胚胎率均升高,其中正常受精率和卵裂率有显著差异( O.O5)。结论:PC0和
PCOS患者行I、rM可行,二者无明显差异。培养液中添加激素、FF、EGF以及延长培养时间至48 h,
可促进卵子成熟。但有关临床用药、培养条件仍有待改善,进一步提高卵子和胚胎质量以获得妊娠。
关键词:多囊卵巢;多囊卵巢综合征;卵母细胞休外成熟:胚胎发育:辅助生殖技术
中图分类号:R711.6 文献标识码:A 文章编号:0253—357X(2005)02—0089—07
控制性超排卵 (controlled ovarian stimulation,
COS)已成为体外受精一胚胎移植 (in vitro fertili—
zation-embryo transfer,IVF—ET),提高获卵数的常
规选择,但对于进行 IVF—ET的多囊卵巢 (polycystic
ovary,PCO)和多囊卵巢综合征 (polycystic ova—
rian syndrome,PC0S)忠 ,行COS效果不佳,
卵子往往发育不良,流产率高,更存在卵巢过度刺激
综合征 (ovafian hyperstimulation syndrome,OHSS)
的危险⋯I。为克服这些困难,近年来有学者主张
不用或少最使川促性腺激素刺激,获取PCOS患者的
未成熟卵体外培养成熟、受精和胚胎移植 ·。]。该
通讯作者:高敏芝;Tel:+86.21.64044705;
E-mail:328gao@sina.com
技术是从小的窦卵泡中获取卵子行休外培养成熟
(in vitro maturation,IVM),既增加获卵数和避免
OHSS风险,同时也冈减少外源性Gn川景而降低了医
疗费 。冈此,IVM成为PCO不孕患者行IVF的积极
选择 。
在20世纪30年代,就有人丌始哺乳动物IVM
的研究⋯。人 IVM最 在60年代进行 ,但“剑
80年代以后,才有 ‘些 {』心相继报道人卯休外成
熟、受精、胚胎发育和妊娠在卵巢刺激周期、末刺
激周期和PCO患者中获得成功 ]。调节早期人卵
泡发生的机制尚不明了,各种培养基都被用于IVM,
现有的人IVM培养
都是在参考动物研究结果的
基础上建立的。IVM仍处于研究阶段,始基卵泡、窦
前卵泡也能体外生长,但发育到一定程度就出现退
一 8g一
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化、闭锁。I VM的卵子常发生卵裂延缓或停滞,
胚胎质最欠佳,导致妊娠率低 卜,目前人 IVM仅从
安卵泡获得成功妊娠。研究显示不同的培养环境可
产生不同的IVM结局,不适n勺培养环境是造成 IVM
后卵子质量下降的主要因素 ]。因此,如何改进
IvM培养系统,提高IVM的成熟、受精、卵裂和
优质胚胎率,成为迫切需要解决的问
。
1 材料和方法
1.1 研究对象
研究对象为2002.7—2003.3在上海市计划生育
科学研究所接受不孕治疗的多囊卵巢忠 (包括
PCO和PCOS患者)。入选
:年龄20—35岁,B超
显示至少一侧卵巢单个切面有l0个以上2—10 mm的
卵泡,宫腔正常,月经周期规则或不规则,泌乳素
正常,因输卵管、男方、或黄素化不破裂卵泡综合
症 (LUFS)等特发冈素接受治疗,进入研究 3月
未采用卵巢刺激。所有对象均签署知情同意书。PCO
定义:B超示有多囊征象。PCOS定义:除PCO外,还
有临床 (月经稀发、闭经、肥胖和多毛等)或生化
异常 (高LH、LH/FSH和T等)。
1.2 研究方法
1.2.1 临床准备和超声检查 PCO患者注射孕酮撤
退性出血或月经d 3起B超,每隔2-3 d监测卵泡
发育,注射hMG 75-150 iu/d×3-5 d或不用药,
根据周期长短、内膜厚度在d 9—17左右,当优势卵
泡接近10 iiln时,肌肉注射hCG 10 000 IU,36 h后取
卵,取卵后再肌注hCG 10 000 IU。
1.2.2 采卵方式 取卵前0.5 h患者肌注安定10 mg,
阴超引导下采用18G 35 cm长的单腔或双腔采卵针
(Cook, Eight Mi1e P1ainS, OueenS1and,
Australia)穿刺抽吸2-10 mm的卵泡,抽吸压力
l0.7一l3.3 kPa。
1.2.3 体外培养 试剂准备如 F:卵泡冲洗和卵子
洗涤液:PBS(卵泡),Hepes.HTF+10%SPS(卵子)。
成熟液:基本培养基(f-HTF+75 mIU/mL rFSH+500
mIU/mL rhCG)+10%SPS(SPS组):基本培养基 +20%
hFF(FF组):基本培养基+20%hFF+2 ng/mL rhEGF
(FF+EGF组)。受精液:f-HTF+10%SPS。卵裂液:
c.HTF+IO%SPS。除卵子冲洗液需当大配制外,其
余试剂均在使用前1 d配制,隔夜置培养箱中平衡。
卵泡液制备按Chi方法⋯ 。
一 90一
卵泡抽吸及冲沈液L}J找剑卵子后迅速移入沈涤
液中,沈涤3次去除红细胞和细胞碎片。丢弃有 j
锁征象(发黑、皱缩、胞浆不均匀、透明带变形)的
卵子。洗涤后的健康卵丘一卵母细胞复合休(ooc~ne—
cumulus coraplcxes,OCC)移入含30 L/微滴成
熟培养液的Falcon培养皿中,上覆矿物油。37℃、
5%C02培养箱中培养25—48 h。
1.2.4 体外受精 卵子成熟后移入受精培养液,
准备进行IVF或ICSI。精液采用上游法处理。ICSI
者OCt刚80 IU/mL透明质酸酶消化30 s,然后以
170—180 mm。140—150 mm管径吸管逐步机械吹¨脱
颗粒。ICSI技术参考Smith方法 。受精斤 l6—20 h
观察原核。受精卵在卵裂培养液中继续培养卜2 d。
胚胎根据裂球人小、碎片多少、分裂速度等分为4
级,I:细胞大小均匀,形态规则,透明带完 :胞
质均匀清晰,没有颗粒现象;碎片在0%一5%之间。
II:细胞火小略不均匀,形态略不舰则;胞质可有
颗粒现象;碎片在 10%-20%之问。III:细胞人小
明显不均匀,可有明显的形态不规则;胞质可有明
显颗粒现象;碎片在21%-50%之问。Ⅳ:细胞人小
严重不均匀;胞质可有严重颗粒现象 碎片在50%以
上。以I—II级胚胎为优质胚胎。
1.3 统计学方法
采用卡方检验, 0.05为筹异有显著意义,
P
5哪
卵泡中的卵子才能体外成熟。FSH的应用和撤退都
可加强卵子发育,促进卵子成熟、受精和获得较好
的胚胎[2t~-Z2]。但也有学者研究发现FSH对IVM无
效 ]。还有学者发现取卵前注射hCG也可增』J口卵
子成熟率[J 。本研究显示,取卵前使用Gn。显示
无增加获卵数和促进卵子成熟作用,可能与培养液
中已含有Gn等冈素有关,Gn对IVMf 作Hj仍需进 ·
步研究。
3.3.2 卵子来源 本研究发现PCOS较PCO患者可
获得更多卵子数,而 PCO患者较 PCOS患者fFj卵子
成熟率、受精率、卵裂率和优质胚葺夏胎均高,但
无统计学差异。考虑 PCOS患者的小卵泡中较正常
妇女含更高的雄烯二酮、EGF和更低的E ,缺乏产
生优势卵泡的动力学变化。PCO和PCOS忠者的卵子
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I vM后可受精、卵裂,但优质胚胎少,常有胚胎
发育延缓和阻滞、多精受精、减数分裂异常和多倍体
现象。提示存在培养系统不适或胚胎内在缺陷 引。
3.3.3 培养时间 受精时机可能对胚胎发育十分
重要。不同的培养基和不同的刺激方案均可影响卵
子体外成熟的时间。Smith等cz5 研究显示,IVM时间
由36 h减为28 h,并不降低卵子成熟和以后发育
能力。Cha等Cz6 发现Gn刺激周期的卵子GVBD时间
为30 h,而未刺激周期需48 h。我们研究显示:人
多数卵子体外培养25—29 h即可排出第1极休(Pb1),
受精亦可,但正常受精和卵裂牢均显著低于培养
45—48 h者,考虑与胞质尚不成熟有关。卵子体外
培养时间过长 (36-48 h),可能发生卵子在MII期
锁,错过最佳受精时间,而过短则可能胞质尚未成
熟,未合成卵子和胚胎发育所需的蛋白质,导致受
精和卵裂率低 F,因此IVM时机值得深入研究。
3.3.4 受精方法 对卵子成熟发育能力无统 评
价,最终仍由受精率、产生存活后代决定。排出Pbl
不能反映卵子的成熟。Nogueira等c" 发现:IVM 24
- 30 h细胞骨架和染色体异常,胞质不成熟,纺锤
体受损,多核裂球和异倍休增加,致妊娠率一 降。考
虑到IVM中卵母细胞透明带可能发生硬化,故本研
究中部分卵子采用ICSI受精,但结果显示正常受精
耆夏和卵裂率均低于IVF,可能与样本最较小有关。
3.4 改进
由于卵子来源不同和培养系统不 ‘,各家报
道取卵数和卵子成熟率不同,很难客观对比。胚胎
发育不良可能是培养系统不适合,也可能是卵子内
在缺陷所致。目前研究认为IVM妊娠率低,土要是
由于胞质未完全成熟导致胚胎发育不良,其他有关
因素有:窦卵泡数、B超测得的 H巢基质血流速度
峰、收集到的未成熟卵子数、取卵时是否出现优势
卵泡、胚胎移植时的内膜厚度。采用合适的培养环
境、改进培养系统可提高卵子质景。Hwu等czs】在IVM
时采用人类输卵管液(human tubal fluid,HTF)与
输卵管壶腹部细胞共培养,卵子成熟受精后可发育到
囊胚。Mikkelsen等[2 发现,IVM周期d 3 FSH值
和d7阴超卵泡数可预测获卵数,d 3低E 和IA有更
高妊娠葺夏,可推测 IVM妊娠结局。
本研究结果显示,PCO和PCOS忠 在不用或
小剂景使用Gn后可获得满意的墩卵数, f:达剑 ·
定的成熟率、受精率和卵裂率。培养基中添加激
素、hFF和EGF都可促进未成熟卵子的体外发育。
冈胚胎质量欠仕,移植周期少,目Ij{『尚无患者妊
娠。同时因样本数较少, 一些比较未能取得统计
学意义,随研究的深入,例数的增加,将作出进
· 步。同时随着对卵子成熟机制和各种重要影
响因素的逐步阐明和培养系统的优化,IVM的成功
率有望更高。IVM与卵巢组织冷冻技术结合以保存
生育和内分泌能力也将成为新的研究方向 。】。
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(2004年6门8}| 收稿)
In Vitro M aturation,Fertilization and Embryo Development
of Immature Oocytes from PCO Patients
Min—zhi GAO,Yu-bao WANG,Dun—yu GU,Xiao—yun WU,Zhong—mei LI
(InfertilityandIVFCenter,ShanghaiInstituteofPlannedParenthoodResearch.Shangh口 200032)
[ABSTRACT l Objective:To study the possibility of in vitro maturation,fertilization and embryo development
as well as pregnancy of immature oocytes with polycystic ovary(PCO).Methods:From July 2002 to March 2003,
一 94-
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a total of 1 2 women underwent 1 3 natural or Gn primed IVM cycles.Oocyte-cumulus complex(occ)acquired
were randomized sequentially cultured in one of the three mediums f0r 25-48 h:basal medium(f-HTF+75 mlU/mL
rFSH+500 mlU/mL rhCG)+1 0%SPS(group 1),basal medium +20%hFF(group 2)or basal medium+20%hFF+
2 ng/mL rEGF(group 31.All women undertook B-ultrasonic examination since day 3 of menstruation,with or
without 75.1 50 IU hMG for 3-5 days.Aspiration was performed transvaginally between day 9 and day l 7.All
cumulus.enclosed oocytes of healthy appearance were matured ill culture medium in vitro for 25-48 h before in
vitro fertilization(IVF1 or intracytoplasmic sperm injection(ICSI).Results:A total of 11 8 OOCytes were retrieved
and the average rates acquied was 9.83.11he percentage ofoocytes reaching metaphase I1 was significantly higher
in the group 3(73.58%),compared with group 1(63.33%)(J口l<0.05).There were no significant difference in the
rates of oocyte fertilization and cleavage between these groups.Th ere was no significant difference of maturation,
fertilization and cleavage rate between oocytes from Gn prime d and unprimed patients,and between oocytes from
PCO and PCOS patients.Oocytes cultured for 48 h had significant higher rates of fertilization and cleavage.ICSI
group had more good embryos than IVF group,but the difference was not significant.No pregnancy was obtained
inthese groups.Conclusion:These results indicate it is feasible for PCO patients to go through IVM.Gn,FF,EGF
and longer culture period ma y improve the maturational potential of the oocyte from PCO patients.But there’S still
space to imp rove in clinical prescription,culture condition,SO as to advance the quality of embrys and the preg-
nancy rate.
Key words:polycystic ovary;polycystic ovarian syndrome;in-vitro ma turation;embryo development;
assisted reproductive technology
强力霉素致畸作用的研究
刘 铮 李 潇 段丛静 谭泽慧 张鑫磊 伍小飞
(沈阳药科大学药学院GLP巾心,沈阳,ll 001 5)
【摘要】 目的:了解强力霉素临床用药量下的生殖毒性作用。方法:选用体重为200—240 g的雌性
孕大鼠,于孕d 6—1 5颈部皮下注射给药,强力霉素各组给药剂量分别为临床用量的1倍,3倍,9倍
即20 mg/kg、60 mg/kg、1 80 mg/kg,每组1 5只。乙二醇为阳性对照药(1 59 5 mg/kg),灌胃给
药。结果:强力霉素对大鼠的致畸率在正常范围内,而阳性对照药乙二醇引起的致畸率远远大于强
力霉素,呈现阳性结果,实验组和阳性对照组间,畸形率经统计学比较,差异有显著性。本实验
在临床剂量下没有发现强力霉素在胚胎形成期对孕大鼠有明显的生殖毒性。但是在高剂量给药的
情况下以及对于大鼠一般生殖毒性和围产期的生殖毒性还有待进一步研究。结论:临床用量的
强力霉素对大鼠无明显胚胎毒性和致畸作用。
关键词:强力霉素;生殖毒性
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