GB 19438.2-2004 H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检测方法

ICS 11.220 B41 中华人民共和国国家标准 GB/T 19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Avian Influenza Virus Subtype H5 2004-2-15发布 2004-2-15实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发布 GB/T19438.2—2004 I 前 言 本标准是依据 GB/T1.1—2000《标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写规则》制定的。 本标准的附录Ａ是本标准的资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、深圳市匹基生物工程股份有限公司。 本标准主要起草人：刘环、张鹤晓、赖平安、周琦、刘宁。 本标准系首次发布的国家标准。 GB/T19438.2—2004 H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本标准了H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR操作方法。 本标准适用于活禽及其产品中H5亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的 修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒型通用型荧光RT-PCR检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准： 荧光RT-PCR 荧光反转录—聚合酶链反应。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 RNA 核糖核酸。 Taq酶 Taq DNA 聚合酶 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 DEPC 焦碳酸乙二酯 4 原理 采用TaqMan方法，在比对禽流感病毒血凝素基因的基础上，一对仅在H5亚型禽流感病毒血凝 素基因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针的结合部位位于目的扩增片段内 部。其中5’端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示），3’端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q 表示），它在近距离内能吸收5’端荧光基团发出的荧光信号。反应进入退火阶段时，引物和探针同时与 目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应 进行到延伸阶段时，Taq酶发挥5’→3’的外切核酸酶功能，将探针降解。这样探针上的R基团游离出来， 所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环往复，PCR产物呈指数形式增长， 荧光信号也相应增长，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 5 试剂和 5.1 试剂 除另有说明，所用试剂均为纯；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 氯仿 异丙醇：-20 ℃预冷 75 %乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB6682要求）配制，-20 ℃预冷 0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS：配方见GB/T 19438.4-2004附录A。121±2 ℃，15 min高压灭菌冷却 后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10 000 U/mL。 GB/T19438.2—2004 H5 亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒1）：试剂盒的组成、说明及使用注意事项见本标准附录A。 5.2 仪器设备 5.2.1 高速台式冷冻离心机 最大离心力 12 000 g以上。 5.2.2 荧光 PCR检测仪、计算机 5.2.3 2～4 ℃冰箱和-20 ℃冰箱 5.2.4 微量加样器 0.5 µL～10 µL，5 µL～20 µL，20 µL～200 µL，200 µL～1 000 µL。 5.2.5 组织匀浆器 5.2.6 混匀器 5.2.7 可移动紫外灯 6 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 6.1 取样工具 下列取样工具必须经121±2 ℃，15 min高压灭菌或经160 ℃干烤2 h。 z 拭子； z 剪、镊； z 研钵； z Eppendorf管（1.5 mL）。 6.2 采样方法 6.2.1 活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子，具体采集方法如下： z 咽喉拭子，采取时要将拭子深入喉头及上腭裂来回刮3～5次，取咽喉分泌液； z 取泄殖腔拭子时，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便； z 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1.0 mL PBS的Eppendorf管中，编号备用。 6.2.2 内脏或肌肉样品 用无菌镊剪夹取待检样品2.0 g于研钵中充分研磨，再加10 mL PBS混匀，或置于组织匀浆器中，加 入10 mL PBS匀浆，然后将组织悬液转入无菌Eppendorf管中3 000 r/min离心10 min，取上清液转入 Eppendorf管中，编号备用。 6.2.3 血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。 6.3 存放与运送 采集或处理的样本在2 ℃～8 ℃条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，须放置-70 ℃冰箱，但 应避免反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实 验室。 7 操作方法 7.1 实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T 19438.1-2004附录C。 7.2 样本的处理 在样本处理区进行。 1) 由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同 的效果，则可使用这些等效产品。 GB/T19438.2—2004 7.2.1 取 n个 1.5 mL灭菌 Eppendorf管，其中 n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和， 对每个管进行编号。 7.2.2 每管加入 600 µL裂解液，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各 200 µL，吸头反复 吸打混匀（一份样本换用一个吸头）；再加入 200 µL氯仿，混匀器上震荡混匀 5 s（不宜过于强烈， 以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀）。于 4 ℃条件下，12 000 r/min离心 15 min。 7.2.3 取与本标准 7.2.1中相同数量的 1.5 mL灭菌 Eppendorf管，加入 400 μL异丙醇（-20 ℃ 预 冷），对每个管进行编号。吸取本标准 7.2.2离心后各管中的上清液转移至相应的管中，上清液至少吸 取 500 μL，注意不要吸出中间层，颠倒混匀。 7.2.4 12 000 r/min离心 15 min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清， 倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。加入 600 µL 75%乙醇，颠倒洗涤。 7.2.5 于 4 ℃条件下，12 000 r/min离心 10 min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置）。 轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，沾干液体，不同样品应在吸水纸不同地方沾干。 7.2.6 4 000 r/min离心 10 s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液 体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温 干燥 3 min。不宜过于干燥，以免 RNA不溶。 7.2.7 加入 11 µL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min离心 5 s，冰上保存备用。 提取的 RNA须在 2 h内进行 RT-PCR扩增或放置于 -70 ℃冰箱。 7.3 扩增试剂准备与配置 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出AIV H5亚型RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2 000 r/min离心5 s。设所 需PCR数为n，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见 下表。 表 测试反应体系配制表 试剂 RT-PCR反应液 Taq酶 用量 15 µL 0.25 µL 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积试管中，向其中加入0.25× n颗RT-PCR酶颗粒，充分混合 均匀，向每个PCR管中各分装15 µL，转移至样本处理区。 7.4 加样 在样本处理区进行。在各设定的 PCR管中分别加入本标准 7.2.7中制备的 RNA溶液各 10μL，盖紧 管盖后，500 r/min离心 30 s。 7.5 荧光 RT-PCR反应 在检测区进行。将本标准 7.4中加样后的 PCR管放入荧光 PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。 循环条件设置 荧光 RT-PCR检测 H5亚型禽流感病毒的反应参数为： —— 第一阶段，反转录 42 ℃/30 min； —— 第二阶段，预变性 92 ℃/3 min； —— 第三阶段，92 ℃/10 s，45 ℃/30 s，72 ℃/1 min，5个循环； —— 第四阶段，92 ℃/10 s，60 ℃/30 s，40 个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火 延伸时进行。 8 结果判定 8.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性 为准。或可根据仪器噪音情况进行调整。 GB/T19438.2—2004 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无 Ct值并且无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照的 Ct值应＜28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性 无 Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。 8.3.2 阳性 Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样本中存在禽流感病毒。 8.3.3 有效原则 Ct值＞30.0的样本须重做。重做结果无 Ct值者为阴性，否则为阳性。 GB/T19438.2—2004 1 附 录 A （资料性附录） H5亚型禽流感病毒荧光 RT-PCR试剂盒组成、说明及使用时的注意事项 A.1 试剂盒的组成 组 成 成 分（48 tests/盒） 体 积 样本处理试剂 裂解液 30mL×1盒 核酸扩增试剂 H5亚型禽流感病毒 RT-PCR 反应液 750μL×1管 RT-PCR酶（带盖 PCR反应管装） 1颗/管×12管 Taq酶（5U/μL） 12μL×1管 DEPC 水 1mL×1管 对照品 阴性对照 1mL×1管 阳性对照（非感染体外转录 RNA） 1mL×1管 A.2 说明 A.2.1 裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色，于4 ℃保存。 A.2.2 DEPC水，是用1 %DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。 A.2.3 RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。 A.3 使用时的注意事项 A.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高，检测过程中不得交叉污染。 A.3.2 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污 染仪器。 A.3.3 RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，RT-PCR酶在室温条件下必须置于干燥器内保存，使用时取出所需 数量，剩余部分立即放回干燥器中。 A.3.4 除裂解液外，其它试剂-20 ℃保存。有效期为6个月。